Un modelo murino estandarizado de terapia con ondas de choque extracorpóreas indujo la regeneración de tejidos blandos

Resumen

Este artículo describe un modelo murino estandarizado de regeneración de tejidos mediante tratamiento con ondas de choque.

Resumen

La terapia con ondas de choque (SWT) muestra efectos regenerativos prometedores en varios tejidos diferentes. Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes son poco conocidos. La angiogénesis, un proceso de formación de nuevos vasos sanguíneos, es uno de los principales impulsores de la regeneración en los tejidos más blandos, así como un efecto recientemente descubierto de SWT. No se comprende completamente cómo el estímulo mecánico de SWT induce la angiogénesis y la regeneración y qué vías están involucradas. Para mejorar aún más el uso clínico de SWT y obtener información valiosa sobre cómo la estimulación mecánica puede afectar el tejido y la regeneración de tejidos, se necesita un modelo estandarizado de SWT. Por la presente, describimos un modelo murino estandarizado y fácil de implementar de regeneración inducida por terapia con ondas de choque, utilizando el modelo de isquemia de las extremidades posteriores.

Introducción

La terapia con ondas de choque (SWT) se introdujo por primera vez en la práctica clínica como un medio para desintegrar los cálculos renales mediante aplicación extracorpórea. En la década de 1990, un hallazgo incidental de engrosamiento de la cresta ilíaca en las radiografías después de una litotricia repetida reveló un efecto morfogénico óseo de SWT¹. Esto provocó un aumento de nuevas aplicaciones en el uso ortopédico. Por lo tanto, la SWT se convirtió en una opción de tratamiento reconocida para las pseudoartrosis de los huesos largos, la epicondilitis lateral y la tendinitis de Aquiles 2,3,4,5. La evidencia reciente vuelve a ampliar el espectro de aparatos más allá de la ortopedia, hacia tejidos más blandos y trastornos de la cicatrización de heridas ^6,7. En este caso, los estudios podrían demostrar la eficacia de la SWT en un conjunto heterogéneo de afecciones, como la disfunción eréctil o la espasticidad después de un accidente cerebrovascular ^8,9,10.

Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen a la SWT aún no se comprenden completamente y requieren más investigación. Con un enfoque en la enfermedad cardiovascular, nuestro trabajo previo demuestra un efecto prometedor de SWT en un modelo murino de infarto de miocardio. De este modo, se descubrió que la angiogénesis era un factor clave de la regeneración miocárdica tras el SWT¹¹.

La angiogénesis describe el desarrollo de nuevos vasos a través de la brotación y división de vasos preexistentes. En el caso de lesión, estos nuevos vasos facilitan el restablecimiento del flujo sanguíneo a la zona dañada y, por lo tanto, la regeneración¹².

La angiogénesis, por lo tanto, representa un sello distintivo de la regeneración de tejidos y una posible explicación de los efectos de SWT en tejidos más blandos. Sin embargo, la regeneración es un proceso complejo con numerosos mecanismos inductores y efectores. A pesar de la posibilidad de investigarlos en un entorno de cultivo celular aislado, los modelos animales son los más adecuados para emular estos procesos complejos. La isquemia de las extremidades posteriores es un modelo bien establecido para investigar la angiogénesis y la regeneración in vivo¹³. Para apoyar la investigación adicional del efecto regenerativo de SWT, presentamos un modelo murino factible, estandarizado y factible de SWT en la isquemia de las extremidades posteriores.

Protocolo

Los experimentos fueron aprobados por el comité institucional de cuidado y uso de animales de la Universidad Médica de Innsbruck y por el Ministerio de Ciencia de Austria (BMWF-66.011/0110-V/3b/2019).

1. Inducción de la anestesia y puesta en marcha

1. Preparar un ambiente adecuado para los procedimientos con animales: esterilizar el equipo, desinfectar las superficies, hacer uso de mascarillas desechables, batas de aislamiento y guantes.
2. Sedar a un ratón de 18-12 semanas de edad (la cepa y el sexo dependen del entorno experimental) en una cámara conectada a un vaporizador de isoflurano al 4%.
3. Compruebe la sedación suficiente a través del reflejo del oído auricular como indicadores para el reconocimiento del dolor profundo.
4. Cuando el animal esté suficientemente sedado, apague el flujo de isoflurano y administre analgesia y anestésicos según el protocolo aprobado de cuidado y uso de animales, por ejemplo, clorhidrato de ketamina (80 mg/kg de peso corporal) como anestésico y clorhidrato de xilacina (5 mg/kg de peso corporal) como analgésico intraperitoneal.
   NOTA: Prepare la jeringa con medicación intraperitoneal antes de colocar al animal en la cámara de anestesia.
5. Examinar la profundidad de la anestesia 5 min después de la inyección evaluando el reflejo de retirada del pedal.
6. Aplique ungüento para los ojos (por ejemplo, 0,5 g de Retinolpalmitat) para evitar daños en la córnea.
7. Eliminar el vello en la zona quirúrgica y en sus proximidades, en particular la extremidad posterior izquierda y la ingle. La crema depilatoria se puede usar en lugar de maquinillas de afeitar o recortadoras para evitar lesiones en la piel.
8. Fije al animal en posición supina con las extremidades extendidas sobre una placa calefactora con cinta adhesiva.
9. Desinfectar y limpiar el área de la cirugía con povidona yodada al 10% o desinfectante similar. Utilice un paño de campo estéril.

2. Procedimiento

1. Utilice un microscopio con un aumento de entre 10x y 20x para realizar la cirugía.
2. Haga una incisión en la piel (~1,5 cm) proximal a la articulación de la rodilla con unas tijeras quirúrgicas.
3. Separe suavemente la piel del tejido subyacente con pinzas romas.
4. Identificar los vasos femorales. Separe cuidadosamente la arteria, la vena y el nervio con pinzas y tijeras.
5. Comenzando proximalmente a nivel del ligamento inguinal, retire con cuidado el tejido conectivo circundante hasta que la arteria se muestre de manera óptima. Como criterio de valoración distal, la ramificación arterial hacia la arteria safena y poplítea debe ser visible.
6. Libar la arteria femoral proximal a nivel del ligamento inguinal mediante una sutura de polipropileno 7-0.
7. Ocluir el extremo distal de la arteria femoral proximal a la ramificación en arteria safena y poplítea mediante una sutura de polipropileno 7-0.
8. Extirpar el segmento de la arteria femoral entre los nudos distal y proximal mediante diatermia.
   NOTA: También es posible extirpar la arteria femoral mediante cortes con tijeras quirúrgicas. Sin embargo, el uso de una diatermia ocluye el vaso además de la sutura en caso de que los nudos fallen.
9. Asegúrese de que la arteria femoral esté ocluida de forma segura y que no haya hemorragias visibles en el campo de operación.
   NOTA: Se recomienda una distancia estrecha entre las suturas cutáneas para evitar la descontaminación ultrasónica de la herida con gel durante la aplicación de SWT.
10. Sutura la incisión cutánea con suturas de nailon no absorbible 5-0 con nudos individuales.
11. Desinfecte el área quirúrgica con hisopos de algodón.

3. Aplicación de la terapia de ondas de choque

1. Asegúrese de que la incisión en la piel esté completamente cerrada.
2. Defina los parámetros de tratamiento en el dispositivo de onda de choque. En este entorno experimental, se utilizó una densidad de flujo de energía de 0,1 mJ/^mm2 a una frecuencia de 3 Hz para un total de 300 impulsos.
   NOTA: Los niveles de energía se adoptaron de los resultados anteriores¹⁴ utilizando un tratamiento con ondas de choque extracorpóreas focalizadas.
3. Aplique gel ultrasónico en el área de tratamiento en la parte interna del muslo para un acoplamiento adecuado.
4. Asegúrese de que no haya burbujas de aire atrapadas dentro del gel.
   NOTA: El acoplamiento adecuado con suficiente gel es esencial para una aplicación adecuada de SWT. Las pequeñas burbujas de aire dentro del gel absorberán las ondas de choque y disminuirán su efecto.
5. Aplique 300 impulsos alternando el interruptor de pie mientras mueve lentamente el aplicador sobre el muslo.
   NOTA: Si SWT no se aplica inmediatamente después de la cirugía, evite la posible absorción de energía de onda de choque debido a la regeneración del vello mediante la eliminación antes del tratamiento.
6. Después del tratamiento, limpie cualquier gel ultrasónico residual para evitar el enfriamiento del muslo.
7. Traslade al animal a una jaula de recuperación expuesta a una lámpara de calefacción para evitar la hipotermia.
8. Vigilar atentamente al animal hasta que esté despierto y administrar una dosis de 0,05 mg/kg de peso corporal de buprenorfina, por vía subcutánea para una analgesia adecuada.
9. Monitoree la salud y el bienestar de los animales diariamente hasta que la incisión quirúrgica se cure por completo.
   NOTA: El tratamiento puede limitarse a una sesión o repetirse varias veces. En este ejemplo, se realizó una sola aplicación.

4. Medición del flujo sanguíneo

1. Realizar la medición del flujo sanguíneo inmediatamente después de la cirugía y en varios momentos posteriores dependiendo del entorno experimental.
2. Sedar al animal en una cámara conectada a un vaporizador de isoflurano al 4%.
3. Cuando el animal esté sedado, corte el flujo de isoflurano y administre anestésicos y analgésicos. De acuerdo con el protocolo aprobado de cuidado y uso de animales, aplique clorhidrato de ketamina (80 mg/kg de peso corporal) y clorhidrato de xilacina (5 mg/kg de peso corporal) por vía intraperitoneal.
4. Examine la profundidad de la anestesia 5 min después de la inyección evaluando el reflejo de retirada del pedal.
5. Utilice un ungüento para los ojos (por ejemplo, 0,5 g de Retinolpalmitat) para evitar daños en la córnea.
6. Fije al animal en posición supina con las extremidades extendidas sobre una placa calefactora con cinta adhesiva.
7. Retire el vello de ambas extremidades traseras meticulosamente.
8. Mida la perfusión de las extremidades a través de láser Doppler de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   NOTA: La relación entre el flujo sanguíneo de la extremidad isquémica y el flujo sanguíneo de la extremidad no isquémica debe utilizarse como parámetro principal.

Resultados

Utilizando este protocolo, se pueden observar y monitorear diferencias significativas en la perfusión de las extremidades traseras después de la intervención de SWT. Las imágenes representativas muestran una marcada diferencia en las extremidades tratadas con SWT (Figura 1B) en comparación con las extremidades de control no tratadas (Figura 1A). Aquí, la perfusión se representa a través ...

Discusión

El tratamiento con ondas de choque muestra resultados prometedores en varios entornos de regeneración de tejidos blandos. Sin embargo, para aumentar, mejorar o aislar aún más estas capacidades regenerativas, primero se deben descubrir los conceptos básicos de la regeneración inducida por SWT a nivel molecular. La regeneración de tejidos es compleja e involucra muchos procesos biológicos, incluyendo inmunidad innata y adquirida, inflamación, progresión del ciclo celular, apoptosi...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Povidone
5-0 Nylon suture	Ethicon Inc.
7-0 silk suture	Ethicon Inc.
Cautery	Martin	ME-102
depilatory cream	Nivea
Gauze	Gazin
Heating Plate
Ketamine hydrochloride			anesthesia
Laser Doppler	Moor instruments
Surgical Tools	Fine Science Tools
Xylazine hydrochloride			anesthesia