체외 충격파 요법 유도 연조직 재생의 표준화된 쥐 모델

요약

이 논문은 충격파 치료를 통한 조직 재생의 표준화된 쥐 모델에 대해 설명합니다.

초록

충격파 요법(SWT)은 여러 조직에서 유망한 재생 효과를 보여줍니다. 그러나 근본적인 분자 메커니즘은 잘 이해되지 않았습니다. 새로운 혈관 형성 과정인 혈관 신생은 최근에 발견된 SWT의 효과뿐만 아니라 부드러운 조직에서 재생의 주요 동인입니다. SWT의 기계적 자극이 어떻게 혈관신생과 재생을 유도하는지, 그리고 어떤 경로가 관련되는지는 완전히 이해되지 않았습니다. SWT의 임상적 사용을 더욱 개선하고 기계적 자극이 조직 및 조직 재생에 어떤 영향을 미칠 수 있는지에 대한 귀중한 정보를 얻으려면 SWT의 표준화된 모델이 필요합니다. 이로써 우리는 뒷다리 허혈 모델을 활용하여 충격파 요법 유도 재생의 표준화되고 구현하기 쉬운 쥐 모델을 설명합니다.

서문

충격파 요법(SWT)은 체외 적용을 통해 신장 결석을 분해하는 수단으로 임상 실습에 처음 도입되었습니다. 1990년대에, 반복적인 쇄석술에 따른 X-선 기록에서 장골능이 두꺼워지는 것이 우연히 발견되어 SWT¹의 뼈 형태 형성 효과가 밝혀졌습니다. 이로 인해 정형외과 분야에서 새로운 응용 분야가 급증했습니다. SWT는 장골 불유합, 외측 상과염 및 아킬레스건염 ^2,3,4,5에 대한 인정된 치료 옵션으로 발전했습니다. 최근의 증거는 이제 정형외과를 넘어 더 부드러운 조직과 상처 치유 장애로 기구의 스펙트럼을 다시 넓히고 있습니다 ^6,7. 여기서, 연구는 예를 들어 뇌졸중 후 발기 부전 또는 경련을 포함한 이질적인 조건 집합체에서 SWT의 효과를 보여줄 수 있습니다 ^8,9,10.

그러나 SWT의 기저에 있는 분자 메커니즘은 아직 완전히 이해되지 않았으며 추가 연구가 필요합니다. 심혈관 질환에 초점을 맞춘 본 연구의 이전 연구는 심근경색의 쥐 모델에서 SWT의 유망한 효과를 보여줍니다. 따라서 혈관신생은 SWT¹¹ 이후 심근 재생의 핵심 동인으로 발견되었습니다.

혈관형성(Angiogenesis)은 기존 혈관의 발아 및 분할을 통해 새로운 혈관의 발달을 설명합니다. 부상의 경우, 이 새로운 혈관은 손상된 부위로의 혈류 회복을 촉진하여 재생을 촉진한다¹².

따라서 혈관신생은 조직 재생의 특징이며 연약한 조직에서 SWT 효과에 대한 잠재적인 설명입니다. 그러나 재생은 수많은 인덕터와 이펙터 메커니즘이 있는 복잡한 과정입니다. 고립된 세포 배양 환경에서 이를 조사할 수 있는 가능성은 있지만, 동물 모델은 이러한 복잡한 과정을 모방하는 데 가장 적합합니다. 뒷다리 허혈은 in vivo 혈관신생 및 재생을 조사하기 위해 잘 정립된 모델입니다 ¹³. SWT의 재생 효과에 대한 추가 연구를 지원하기 위해 우리는 뒷다리 허혈에서 SWT의 실현 가능하고 표준화된 쥐 모델을 제시합니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

프로토콜

이 실험은 인스부르크 의과대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회와 오스트리아 과학부(BMWF-66.011/0110-V/3B/2019)의 승인을 받았습니다.

1. 마취 유도 및 운영 설정

1. 동물 시술을 위한 적절한 환경을 준비하십시오: 장비 살균, 표면 소독, 일회용 마스크, 격리 가운 및 장갑 사용.
2. 18-12주 된 생쥐(실험 환경에 따라 균주 및 성별)를 이소플루란 기화기에 부착된 챔버에서 4%로 진정시킵니다.
3. 깊은 통증 인식을 위한 지표로 페달 또는 귓바퀴 반사를 통해 충분한 진정 효과를 확인하십시오.
4. 동물이 충분히 진정되면 이소플루란 흐름을 끄고 승인된 동물 관리 및 사용 프로토콜에 따라 진통제 및 마취제를 투여합니다(예: 마취제로 케타민 염산염(체중 80mg/kg), 복강 내 진통제로 자일라진 염산염(체중 5mg/kg).
   참고: 동물을 마취실에 넣기 전에 복강내 약물로 주사기를 준비하십시오.
5. 페달 철수 반사를 평가하여 주입 5분 후 마취 깊이를 검사합니다.
6. 각막 손상을 방지하기 위해 안연고(예: 레티놀팔미탓 0.5g)를 바르십시오.
7. 수술 부위 안팎의 털, 특히 왼쪽 뒷다리와 사타구니를 제거합니다. 피부 부상을 방지하기 위해 면도기나 트리머 대신 제모 크림을 사용할 수 있습니다.
8. 접착 테이프를 사용하여 팔다리를 뻗은 상태로 동물을 누운 자세로 가열판에 고정합니다.
9. 10% 포비돈 요오드 또는 이와 유사한 소독제로 수술 부위를 소독하고 청소하십시오. 멸균 필드 드레이프를 사용하십시오.

2. 절차

1. 10배에서 20배 배율 사이의 현미경을 사용하여 수술을 수행합니다.
2. 수술용 가위를 사용하여 무릎 관절 근위부(~1.5cm)의 피부를 절개합니다.
3. 뭉툭한 집게를 사용하여 피부와 아래 조직을 부드럽게 분리합니다.
4. 대퇴 혈관을 확인합니다. 집게와 가위를 사용하여 동맥, 정맥 및 신경을 조심스럽게 분리합니다.
5. 서혜부 인대 수준에서 근위부에서 시작하여 동맥이 최적으로 표시될 때까지 주변 결합 조직을 조심스럽게 제거합니다. 원위 종말점으로, 복재동맥과 슬와동맥으로 분기하는 동맥이 보여야 합니다.
6. 7-0 폴리프로필렌 봉합사를 사용하여 서혜부 인대 수준에서 근위 대퇴 동맥을 결찰합니다.
7. 7-0 폴리프로필렌 봉합사를 사용하여 복재 동맥과 슬와동 동맥으로 분기하는 것에 근접한 대퇴 동맥의 원위 끝을 폐색합니다.
8. 투열 요법을 사용하여 원위부와 근위 매듭 사이의 대퇴 동맥 분절을 절제합니다.
   참고: 수술용 가위로 절단하여 대퇴 동맥을 절제하는 것도 가능합니다. 그러나 투열 요법을 사용하면 매듭이 실패할 경우 봉합사 외에 혈관을 막을 수 있습니다.
9. 대퇴 동맥이 안전하게 막혀 있고 수술 부위에서 출혈이 보이지 않는지 확인하십시오.
   참고: SWT 적용 중 상처의 초음파 젤 오염 제거를 피하기 위해 피부 봉합사 사이의 거리를 좁히는 것이 좋습니다.
10. 단일 매듭이 있는 5-0 비흡수성 나일론 봉합사를 사용하여 절개 부위를 봉합합니다.
11. 면봉으로 수술 부위를 소독합니다.

3. 충격파 치료 신청

1. 피부 절개 부위가 완전히 닫혀 있는지 확인하십시오.
2. 충격파 장치에서 처리 매개변수를 정의합니다. 이 실험 설정에서는 총 300개의 임펄스에 대해 3Hz의 주파수에서 0.1mJ/^mm2 의 에너지 플럭스 밀도가 사용되었습니다.
   참고: 에너지 수준은 집중된 체외 충격파 치료를 사용하여^{이전 결과 14} 에서 채택되었습니다.
3. 적절한 결합을 위해 허벅지 안쪽의 치료 부위에 초음파 젤을 바르십시오.
4. 젤 내부에 기포가 갇히지 않았는지 확인하십시오.
   참고: 적절한 SWT 적용을 위해서는 충분한 젤과의 적절한 결합이 필수적입니다. 젤 내부의 작은 기포는 충격파를 흡수하고 그 효과를 감소시킵니다.
5. 풋 스위치를 토글하여 300번의 임펄스를 가하면서 어플리케이터를 허벅지 위로 천천히 움직입니다.
   참고: 수술 직후 SWT를 적용하지 않는 경우, 치료 전에 제거하여 다시 자란 모발로 인한 충격파 에너지 흡수 가능성을 피하십시오.
6. 치료 후 허벅지의 냉각을 방지하기 위해 잔여 초음파 젤을 닦아내십시오.
7. 저체온증을 피하기 위해 동물을 난방 램프에 노출된 회복 케이지로 옮깁니다.
8. 깨어날 때까지 동물을 주의 깊게 모니터링하고 적절한 진통제를 위해 체중 kg 당 0.05mg의 부프레노르핀을 피하로 투여합니다.
9. 외과적 절개 부위가 완전히 치유될 때까지 매일 동물의 건강과 웰빙을 모니터링하십시오.
   참고: 치료는 한 세션으로 제한되거나 여러 번 반복될 수 있습니다. 이 예에서는 단일 응용 프로그램이 수행되었습니다.

4. 혈류 측정

1. 수술 직후와 실험 환경에 따라 다양한 시점에서 혈류 측정을 수행합니다.
2. 이소플루란 기화기에 부착된 챔버에서 동물을 4%로 진정시킵니다.
3. 동물이 진정되면 이소플루란 흐름을 끄고 마취제와 진통제를 투여합니다. 승인된 동물 관리 및 사용 프로토콜에 따라 케타민 염산염(체중 80mg/kg)과 자일라진 염산염(체중 5mg/kg)을 복강 내에 도포합니다.
4. 페달 철수 반사를 평가하여 주입 5분 후 마취 깊이를 검사합니다.
5. 각막 손상을 방지하기 위해 안연고(예: 0.5g 레티놀팔미탓)를 사용하십시오.
6. 접착 테이프를 사용하여 팔다리를 뻗은 상태로 동물을 누운 자세로 가열판에 고정합니다.
7. 양쪽 뒷다리의 털을 꼼꼼하게 제거합니다.
8. 제조업체의 지침에 따라 레이저 도플러를 통해 사지 관류를 측정합니다.
   참고: 허혈성 사지 대 비허혈성 사지 혈류의 비율을 주요 매개변수로 사용해야 합니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

결과

이 프로토콜을 사용하면 SWT 중재 후 뒷다리 관류의 상당한 차이를 관찰하고 모니터링할 수 있습니다. 대표적인 이미지는 SWT로 치료한 사지(그림 1B)와 치료되지 않은 대조군(그림 1A)의 현저한 차이를 보여줍니다. 여기서 관류는 낮은 관류를 나타내는 차가운 색상과 높은 관류를 나타내는 따뜻한 색상?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

토론

충격파 치료는 여러 연조직 재생 환경에서 유망한 결과를 보여줍니다. 그러나 이러한 재생 능력을 더욱 강화, 개선 또는 격리하기 위해서는 먼저 분자 수준에서 SWT 유도 재생의 기초를 밝혀야 합니다. 조직 재생은 복잡하며 선천성 및 후천성 면역, 염증, 세포주기 진행, 세포사멸, 세포 분화, 혈관 신생 등을 포함한 많은 생물학적 과정을 포함합니다^17,18

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Povidone
5-0 Nylon suture	Ethicon Inc.
7-0 silk suture	Ethicon Inc.
Cautery	Martin	ME-102
depilatory cream	Nivea
Gauze	Gazin
Heating Plate
Ketamine hydrochloride			anesthesia
Laser Doppler	Moor instruments
Surgical Tools	Fine Science Tools
Xylazine hydrochloride			anesthesia