Un método robusto para empaquetar columnas de C18 RP-nano-HPLC de alta resolución

Resumen

Aquí, presentamos y evaluamos un protocolo para hacer columnas de cromatografía líquida de nanoflujo de fase reversa de bajo costo para la caracterización de péptidos utilizando flujos de trabajo proteómicos LC-MS/MS.

Resumen

La alta complejidad prevalente en las muestras biológicas requiere separaciones cromatográficas con alta sensibilidad y resolución para ser analizadas de manera efectiva. Aquí presentamos un protocolo robusto, reproducible y económico para la preparación de columnas de cromatografía líquida de alta resolución (RP-HPLC) de fase reversa de nanoflujo para la separación en línea de péptidos analíticos antes de su introducción y detección por un espectrómetro de masas en flujos de trabajo tradicionales de proteómica ascendente. Dependiendo del objetivo del experimento y de las propiedades químicas de los analitos que se separan, los parámetros óptimos de la columna pueden diferir en sus diámetros internos o exteriores, longitud, tamaño de partícula, tamaño de poro, química de las partículas de fase estacionaria y la presencia o ausencia de un emisor de electrospray integrado en la punta. Un sistema de empaquetado de columnas interno no solo permite la fabricación rápida de columnas con las propiedades deseadas, sino que también reduce drásticamente el costo del proceso. El protocolo optimizado para el empaquetamiento de una columna de sílice fundida C18 AQ (acuosa) que se analiza aquí es compatible con una amplia gama de instrumentos de cromatografía líquida para lograr una separación eficaz de los analitos.

Introducción

Las columnas de HPLC han contribuido enormemente a la productividad en los campos de la investigación farmacéutica, médica y ambiental 1,2,3,4. Tener acceso a columnas de cromatografía de alta calidad es un paso fundamental en el fraccionamiento de analitos complejos. En la proteómica de escopeta, la alta sensibilidad analítica se logra rutinariamente mediante el acoplamiento de la espectrometría de masas (MS) de ionización por electrospray (ESI) a la cromatografía de nanoflujo 5,6,7,8. La separación eficiente de miles de péptidos es primordial en esta aplicación, ya que permite que el espectrómetro de masas identifique y cuantifique analitos con alta sensibilidad y resolución.

El campo del empaquetamiento de columnas para aplicaciones de espectrometría de masas ha experimentado un enorme crecimiento en los últimos años con avances en la comprensión de los principios fundamentales del empaquetamiento de columnas relacionados con la morfología de la fase estacionaria, las interacciones solvente-partícula y el diseño de hardware, lo que hace posible la caracterización detallada de una amplia gama de biomoléculas en entornos biológicos complejos 9,10,11,12,13,14 . Los esfuerzos que destacan las consideraciones prácticas en el empaquetamiento de columnas analíticas para fines de LC-MS han allanado el camino para que los laboratorios proteómicos desarrollen sistemas de empaque internos para satisfacer sus intereses específicos con la promesa de un rendimiento máximo 15,16,17,18.

Las columnas de nanospray con diámetros internos en el rango de 50-150 μm y extremos cónicos son muy adecuadas para la ionización por electrospray. En el campo de la proteómica de escopeta, las separaciones se llevan a cabo típicamente utilizando un gradiente de solvente que fluye a través de una fase estacionaria no polar empaquetada, más comúnmente sílice unida a cadena de carbono hidrofóbica (C8-C30) con tamaños de partícula que varían entre 1,7 y 3,5 μm 19,20,21,22. Los analitos eluyentes se emiten a través de un emisor ESI integrado dentro de la columna, lo que garantiza una ionización suave de los analitos en fase disolución a iones gaseosos. El acoplamiento de columnas LC con ESI-MS ha avanzado significativamente en la aplicación de la espectrometría de masas en tándem a las estrategias proteómicas en las ciencias biomédicas.

Las columnas LC con diámetros interiores estrechos dan como resultado picos cromatográficos más estrechos y una mayor sensibilidad en relación con las columnas de microflujo de mayor diámetro y, por lo tanto, son particularmente ventajosas con los flujos de trabajo proteómicos. Aunque las columnas LC preempaquetadas disponibles en el mercado son opciones atractivas debido a su conveniencia y facilidad de uso, pueden ser prohibitivamente costosas y menos flexibles que las opciones internas. El objetivo de este trabajo es describir un enfoque de empaquetamiento de lodos técnicamente simple y de bajo costo para preparar columnas de HPLC de fase reversa de diámetro interior estrecho utilizando capilares de sílice fundida y un sistema de bomba de presión construido internamente para aplicaciones proteómicas.

Protocolo

1. Preparación de la punta capilar

1. Con una piedra de corte de cerámica, corte unos 60-70 cm de un capilar de sílice fundida recubierto de poliimida con un diámetro interno (ID) de 75 μm y un diámetro exterior (OD) de 360 μm.
2. Sostenga el capilar con las manos aproximadamente a la mitad de su longitud, dejando un espacio de 4-5 cm entre los dedos y caliente el área en el espacio mientras lo gira sobre la llama de una lámpara de alcohol. Pula el área quemada con un pañuelo de papel empapado en metanol con poca pelusa hasta que el vidrio sea visible. (Figura 1).
   NOTA: 4-5 cm del capilar de sílice fundida recubierto de poliimida deben exponerse y pulirse antes de que pueda cargarse en el extractor láser.
3. Para extraer un emisor en forma de cono para ESI, utilice un extractor de punta láser con configuraciones de programa especiales de un valor de calor de 300 (equivalente a 2 vatios de potencia láser), una velocidad de 10 (equivalente a 0,25 mm/s) y un retraso de 180 milisegundos para obtener una punta de ~1-5 μm de diámetro (Figura 2 y Figura 3A). Cargue la parte pulida del capilar en el extractor láser y presione pull, lo que da como resultado dos columnas capilares vacías listas para ser empaquetadas.
   NOTA: La inspección frecuente de la punta en cualquier paso se realiza con un microscopio. Es probable que los ajustes diferencien entre los extractores láser y deberán determinarse empíricamente.

2. Polimerización/grabado de la punta

1. Para retener las partículas de la fase estacionaria en el tubo capilar, prepare una frita porosa a partir de una mezcla de dos soluciones de silicato de potasio y formamida. Prepare la solución inmediatamente antes de usar en un tubo de 2 ml y mezcle con un vórtice.
   1. Mezcle dos soluciones de silicato de potasio con una proporción de SiO₂/K₂O de 2,50 (p/p) y 1,65 (p/p) y formamida en una proporción de 1:3:1 (v/v/v), respectivamente. Por ejemplo, mezcle 100 μL de silicato de potasio con una proporción de SiO₂/K₂O de 2,50 (p/p), 300 μL de silicato de potasio con una relación de SiO₂/K₂O de 1,65 (p/p)) y 100 μL de formamida seguido de vórtice. Esta solución se polimerizará cuando se caliente y producirá una frita porosa.
2. Sumerja la punta capilar tirada con láser en el licor madre transparente de la suspensión de frita (no en el precipitado) durante unos 10-20 segundos, permitiendo que penetre unos 5 mm en la punta por acción capilar. Dependiendo del ancho de la punta, puede ser necesario mantener la punta sumergida durante más tiempo en la solución de frita. Generalmente, el tiempo de inmersión es más corto si la punta es más ancha, ya que la solución puede entrar en la punta más rápido.
3. Coloque un soldador caliente (ajustado a 350 ° F) a lo largo de la punta para iniciar la polimerización de la solución de frita mientras inspecciona el capilar bajo el microscopio. Consulte la Figura 3 para ver la punta extraída antes (Figura 3A) y después de la polimerización (Figura 3B).
4. Para evitar el bloqueo del emisor después de la polimerización por frita, sumerja la punta de la columna en una solución de ácido fluorhídrico (HF) al 50% durante 5 minutos (la configuración se ilustra en la Figura 4). El grabado HF también imparte una geometría plana en forma de cono a la columna, lo que aumenta su longevidad. Después del grabado HF, asegúrese de lavar bien la punta de la columna, primero con neutralizador HF y luego generosamente con agua para protegerla contra el contacto con el ácido.
   PRECAUCIÓN: El HF es un producto químico altamente peligroso y corrosivo. Se recomienda extremar la precaución al manipular para evitar la exposición. Asegúrese de que el HF se manipule en todo momento con la protección adecuada dentro de una campana extractora que esté identificada con un letrero que diga "¡Peligro! Toxinas agudas".
   1. Por seguridad, use batas de laboratorio regulares y antiinflamables, además de dobles capas de guantes de nitrilo y neopreno, mientras manipula HF.
      NOTA: Es opcional fritar puntas capilares; Sin embargo, hace que la columna sea significativamente más resistente a la obstrucción y aumenta su longevidad. Las columnas capilares vacías de sílice fundida con un emisor de electrospray integrado están disponibles en el mercado y se pueden utilizar para reemplazar los pasos 1 y 2 si es necesario.

3. Preparación de la fase estacionaria

1. Suspender 25-50 mg de partículas de sílice ReproSil-Pur 120 C18-AQ totalmente porosas con un tamaño de partícula de 1,9 μm y un tamaño de poro de 120 Å en 300 μL de metanol. Pipetear hacia arriba y hacia abajo unas 20 veces para asegurar una mezcla homogénea de las partículas de lechada en el metanol.
2. Coloque el tubo que contiene la suspensión de lodo dentro de la cámara de la celda de presión de un sistema de bomba de empaque de columna construido internamente, que a su vez está configurado sobre un agitador magnético que permite que las partículas de lodo permanezcan en suspensión. Conecte la bomba al tanque de helio (<1500 psi) que funciona a presión constante para evitar interrumpir la suspensión de HPLC durante el embalaje. (Esquema representado en la Figura 5).
3. Asegure la tapa de la celda de presión ajustándola en su lugar con los pernos como se muestra en la Figura 6A.
   NOTA: Es importante apreciar la diferencia en el funcionamiento de una bomba de HPLC y una bomba de embalaje de HPLC. Mientras que el primero está diseñado para funcionar a un caudal constante, independientemente de la contrapresión ejercida por la fase estacionaria en la columna, los sistemas de presión de empaquetadura de HPLC funcionan a una presión constante para garantizar un empaquetamiento denso e ininterrumpido de las partículas de la fase estacionaria a lo largo de la columna capilar.

4. Empaquetamiento de la columna con fase estacionaria

1. Pase primero la parte inferior de la columna (extremo abierto sin fritar) a través del accesorio apretado con los dedos en la parte superior de la bomba de presión de modo que la punta de la columna apunte hacia arriba. Empuje la columna hasta que toque la base del vial que contiene la suspensión y retírela 1-2 mm por encima de la base. Apriete el accesorio para asegurar la columna en su posición.
2. Conecte la bomba de embalaje a un tanque de gas helio (presión recomendada < 1500 psi) y enciéndala a una presión de ~ 1300 psi. El gas helio entra en la celda de presión que alberga el vial que contiene la suspensión a través de una válvula de tres vías. Abra la válvula girándola lentamente 180° en el sentido de las agujas del reloj.
   NOTA: Tan pronto como el gas helio comienza a fluir dentro de la cámara, empuja la suspensión del tubo hacia el capilar. A medida que la lechada pasa a través de la columna, las partículas se retienen en el capilar mientras que el solvente forma una gota de líquido en la punta de la columna (Figura 6B).
   1. Si se retrasa la formación de gotas de líquido en la punta de la columna, flamee rápidamente la punta para asegurarse de que esté abierta. En esta etapa, una fuente de luz colocada detrás de la columna puede ayudar a observar el progreso del proceso de empaque (Figura 7). Para una columna con un diámetro interior de 75 μm, normalmente se tarda ~30-60 minutos en empaquetar una longitud de unos 30 cm.
   2. Si el flujo de la lechada a través de la columna se detiene o se ralentiza, sostenga el capilar firmemente por encima del ajuste apretado con los dedos de la bomba de empaque y aflójelo ligeramente girando aproximadamente un cuarto de vuelta (se puede escuchar un silbido de despresurización).
      NOTA: Esto permite reposicionar la columna sin necesidad de despresurizar completamente la bomba.
   3. Ahora vuelva a colocar suavemente la columna moviéndola hacia arriba y hacia abajo y luego vuelva a apretar el accesorio apretado con los dedos asegurándose de que la columna no toque la base del vial. Esto asegura un flujo uniforme de la lechada a través del capilar en todo momento.
   4. Si la medida antes mencionada no reanuda el empaque, cierre la válvula, ventile la bomba de empaque, desenrosque la tapa e inspeccione la suspensión para asegurarse de que no haya precipitados. También es posible que el extremo de la columna esté obstruido con partículas sólidas de fase estacionaria, en cuyo caso, cortar una pequeña longitud desde la parte posterior del capilar puede ayudar a reanudar el flujo.
3. Empaque unos centímetros más largo que la longitud deseada en el extremo de la columna para garantizar el empaquetamiento completo de las partículas estacionarias y minimizar la posibilidad de que entren burbujas de helio en la columna empaquetada.

5. Acabado de la columna y elaboración de la frita trasera

1. Una vez alcanzada la longitud de empaquetamiento deseada, cierre la válvula principal del tanque de gas helio y espere un mínimo de 15 minutos para asegurar un empaquetamiento uniforme de la columna y permitir que el sistema se autodespresurice.
   NOTA: Para evitar la introducción de burbujas de He como resultado de la sílice fundida vacía en el extremo de la columna, se recomienda una longitud de empaquetadura más larga. Es fundamental que el proceso de empaquetamiento continúe incluso después de que se haya empacado la parte de la columna visible a simple vista para tener en cuenta la longitud del capilar dentro de la cámara de presión. Además, se recomienda una longitud de empaquetadura más larga en los casos en que se requiera reposicionar repetidamente la columna, ya que esto da como resultado menos burbujas de aire y una mayor eficiencia de empaquetamiento.
2. Despresurice suavemente la cámara girando la válvula 180 grados en sentido contrario a las agujas del reloj a su posición original. Sujete la columna con fuerza, desatornille el accesorio apretado con los dedos y retire la columna gradualmente. Este paso debe hacerse con mucha suavidad para evitar la introducción de burbujas de aire.
3. Corta el extremo de la columna a una longitud de 25,5 cm. Mientras inspecciona bajo el microscopio, use un soldador caliente a 350 ° F para eliminar una longitud de 0.5 cm de la suspensión del extremo posterior de la columna.
   1. Sumerja el extremo posterior de la columna en la solución de frita sobrante del paso 2.1 durante unos 10 segundos y polimerícela colocando un soldador caliente a lo largo de la parte posterior de la columna mientras la inspecciona bajo el microscopio. La frita posterior garantiza que las partículas ReproSil-Pur 120 C18-AQ permanezcan en la columna y evita el reflujo durante los lavados cromatográficos.
      NOTA: La frita en la parte posterior de la columna también es opcional, pero hace que la columna sea más robusta, como también se observó para la frita delantera en el paso 2.

Resultados

Para evaluar el rendimiento de las columnas, se fraccionaron en línea 750 ng de digestión de péptidos trípticos preparados a partir de lisados de células enteras de células HEK293 utilizando un capilar de sílice fundida de 25 cm de largo y 75 μm de diámetro interno empaquetado internamente con partículas a granel ReproSil-Pur 120 C18-AQ, tal como se describe en el protocolo. Antes de la carga de la muestra, la columna se lavó utilizando 6 μL de una mezcla de acetonitrilo, iso...

Discusión

Las estrategias proteómicas modernas se basan en separaciones cromatográficas de alta calidad para analizar eficazmente sistemas biológicos complejos. Por lo tanto, las columnas LC de nanoflujo rentables y de alto rendimiento son componentes cruciales de un régimen exitoso de espectrometría de masas en tándem destinado a caracterizar miles de proteínas en un solo flujo de trabajo.

En este estudio evaluamos el rendimiento y la fiabilidad de una gama de c...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
99.99% Formamide acid	Sigma-Aldrich		for making frit
alcohol lamp	Any brand		For providing heat
Brechbuehler helium pressure cell	BioSurplus		for packing column
Ceramic column cutter	Any brand		for cutting silica capillary
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥ 99%	Sigma-Aldrich		Stored in a flammable cabinet
Formamide  ≥99.5%	Sigma-Aldrich		for making frit
Hydrofluoric acid (HF) (50%)	Fisher Scientific		for opening the emitter after polymerization
KASIL (Potassium Silicate Solution)	PQ Corporation		for making frit
Orbitrap Fusion Lumos	Thermo Fisher Scientific		for MS data acquisition
P2000 Laser Puller	Sutter		for pulling capillary
PTFE 1/16" Ferrule 0.4 mm ID (long) for Tube Fitting	Chromre	214104	For bomb setting
Reprosil-Pur 120 C18-AQ, 1.9 um, 1g	Dr. Masch GmbH	r119.aq.0001	Batch 5910
Soldering	Any brand		For initiating polimerization
Stainless Steel Pipe Fitting, Hex Coupling, 1/4 in. Female NPT	Swagelok	SS-4-HCG	for bomb setting
TSP075375 fused silica, 75 µm ID x 360 µOD	MOLEX/Polymicro	1068150019	For column tubing
Ultimate 3000 UHPLC	Dionex		HPLC type