Yüksek Çözünürlüklü C18 RP-nano-HPLC Kolonlarını Paketlemek için Sağlam Bir Yöntem

Özet

Burada, LC-MS/MS proteomik iş akışlarını kullanarak peptit karakterizasyonu için düşük maliyetli ters fazlı nano akışlı sıvı kromatografi kolonları yapmak için bir protokol sunuyor ve değerlendiriyoruz.

Özet

Biyolojik numunelerde yaygın olan yüksek karmaşıklık, etkili bir şekilde analiz edilebilmesi için yüksek hassasiyet ve çözünürlüğe sahip kromatografik ayırmalar gerektirir. Burada, geleneksel aşağıdan yukarıya proteomik iş akışlarında bir kütle spektrometresine girmeden ve bir kütle spektrometresi ile tespit edilmeden önce analitik peptitlerin on-line ayrılması için nano akışlı ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografisi (RP-HPLC) kolonlarının hazırlanması için sağlam, tekrarlanabilir ve ucuz bir protokol sunuyoruz. Deneyin amacına ve ayrılan analitlerin kimyasal özelliklerine bağlı olarak, optimal kolon parametreleri, iç veya dış çapları, uzunlukları, partikül boyutu, gözenek boyutu, sabit faz partiküllerinin kimyası ve uçta entegre bir elektrosprey yayıcının varlığı veya yokluğu açısından farklılık gösterebilir. Şirket içi bir kolon paketleme sistemi, yalnızca istenen özelliklere sahip kolonların hızlı bir şekilde üretilmesini sağlamakla kalmaz, aynı zamanda işlem maliyetini de önemli ölçüde azaltır. Burada tartışılan bir C18 AQ (sulu) erimiş silika kolonunun paketlenmesi için optimize edilmiş protokol, analitlerin etkili bir şekilde ayrılmasını sağlamak için çok çeşitli sıvı kromatografik cihazlarla uyumludur.

Giriş

HPLC sütunları, farmasötik, tıbbi ve çevresel araştırma alanlarında üretkenliğe büyük katkı sağlamıştır 1,2,3,4. Yüksek kaliteli kromatografi kolonlarına erişim, karmaşık analitlerin fraksiyonlanmasında çok önemli bir adımdır. Av tüfeği proteomiklerinde, elektrosprey iyonizasyon (ESI) kütle spektrometresinin (MS) nanoakış kromatografisi 5,6,7,8'e bağlanmasıyla rutin olarak yüksek analitik hassasiyet elde edilir. Kütle spektrometresinin analitleri yüksek hassasiyet ve çözünürlükle tanımlamasına ve miktarını belirlemesine izin verdiği için binlerce peptitin verimli bir şekilde ayrılması bu uygulamada çok önemlidir.

Kütle spektrometrik uygulamalar için kolon paketleme alanı, sabit faz morfolojisi, çözücü-parçacık etkileşimleri ve donanım tasarımı ile ilgili temel kolon paketleme ilkelerinin anlaşılmasındaki ilerlemelerle son yıllarda muazzam bir büyümeye tanık olmuştur^ve karmaşık biyolojik ortamlarda çok çeşitli biyomoleküllerin ayrıntılı karakterizasyonunu mümkün kılmıştır 9,10,11,12,13,14 'dir. LC-MS amaçları için analitik kolonların paketlenmesinde pratik hususları vurgulayan çabalar, proteomik laboratuvarların maksimum performans vaadiyle özel ilgi alanlarını karşılamak için kurum içi paketleme sistemleri geliştirmelerinin yolunu açmıştır 15,16,17,18.

İç çapları 50-150 μm aralığında ve konik uçlara sahip nanosprey kolonları, elektrosprey iyonizasyonu için çok uygundur. Av tüfeği proteomiği alanında, ayırmalar tipik olarak, partikül boyutları 1,7 ila 3,5 μm arasında değişen hidrofobik karbon zincirli silika (C8-C30) olan paketlenmiş polar olmayan sabit fazdan akan bir çözücü gradyanı kullanılarak gerçekleştirilir 19,20,21,22. Elüting analitleri, çözelti fazı analitlerinin gaz halindeki iyonlara yumuşak iyonizasyonunu sağlayan kolon içine entegre edilmiş bir ESI yayıcı aracılığıyla yayılır. LC kolonlarının ESI-MS ile birleştirilmesi, biyomedikal bilimlerde proteomik stratejilere tandem kütle spektrometresinin uygulanmasını önemli ölçüde ilerletmiştir.

Dar iç çaplara sahip LC kolonları, daha yüksek delikli, mikro akışlı kolonlara göre daha dar kromatografik pikler ve daha yüksek hassasiyet ile sonuçlanır ve bu nedenle proteomik iş akışlarında özellikle avantajlıdır. Ticari olarak temin edilebilen önceden paketlenmiş LC sütunları, kolaylıkları ve kullanım kolaylıkları nedeniyle çekici seçenekler olsa da, şirket içi seçeneklere göre aşırı derecede pahalı ve daha az esnek olabilirler. Bu çalışmanın amacı, erimiş silika kılcal damarlar ve proteomik uygulamalar için şirket içi yerleşik bir basınç bombası sistemi kullanarak dar iç çaplı ters fazlı HPLC kolonları hazırlamak için teknik olarak basit ve düşük maliyetli bir bulamaç paketleme yaklaşımını tanımlamaktır.

Protokol

1. Kılcal ucun hazırlanması

1. Seramik bir yarma taşı kullanarak, iç çapı (ID) 75 μm ve dış çapı (OD) 360 μm olan poliimid kaplı erimiş silika kılcaldan yaklaşık 60-70 cm kesin.
2. Kılcal damarı ellerinizle yaklaşık olarak uzunluğunun ortasından, parmaklarınız arasında 4-5 cm'lik bir boşluk bırakarak tutun ve boşluktaki alanı bir alkol lambasının alevi üzerinde döndürürken ısıtın. Yanmış alanı, cam görünene kadar metanolle ıslatılmış düşük tiftikli bir doku kullanarak temizleyin. (Şekil 1).
   NOT: Poliimid kaplı erimiş silika kılcal damarın 4-5 cm'sinin lazer çektirmeye yüklenmeden önce açığa çıkarılması ve parlatılması gerekir.
3. ESI için koni şeklinde bir emitör çekmek için, ~1-5 μm çapında bir uç elde etmek için 300 (2 Watt lazer gücüne eşdeğer), 10 (0,25 mm/s'ye eşdeğer) hız ve 180 milisaniye gecikmeli özel program ayarlarına sahip bir lazer uç çektirme kullanın (Şekil 2 ve Şekil 3A). Kılcal damarın cilalı kısmını lazer çektirmeye yükleyin ve çekmeye basın, böylece paketlenmeye hazır iki boş kılcal sütun elde edin.
   NOT: Herhangi bir adımda ucun sık sık incelenmesi mikroskop kullanılarak yapılır. Ayarlar muhtemelen lazer çekiciler arasında farklılık gösterecektir ve ampirik olarak belirlenmesi gerekecektir.

2. Ucun polimerizasyonu / aşındırılması

1. Sabit faz parçacıklarını kılcal tüpte tutmak için, iki potasyum silikat çözeltisi ve formamid karışımından gözenekli bir frit hazırlayın. Çözeltiyi kullanmadan hemen önce 2 mL'lik bir tüpte yapın ve bir girdap kullanarak karıştırın.
   1. İki potasyum silikat çözeltisini SiO₂ / K₂O oranı 2.50 (a / a) ve 1.65 (a / a) ve formamid ile sırasıyla 1: 3: 1 (v / v / v) oranında karıştırın. Örneğin, 100 μL potasyum silikatı SiO₂/K₂O oranı 2.50 (a/a), 300 μL potasyum silikatı SiO₂/K₂O oranı 1.65 (a/a)) ve 100 μL formamid ve ardından girdaplama ile karıştırın. Bu çözelti ısıtıldığında polimerize olacak ve gözenekli bir frit üretecektir.
2. Lazerle çekilen kılcal ucu, frit süspansiyonunun (çökeltinin değil) berrak ana likörüne yaklaşık 10-20 saniye daldırın ve kılcal hareketle uca yaklaşık 5 mm nüfuz etmesine izin verin. Ucun genişliğine bağlı olarak, ucun frit çözeltisine daha uzun süre daldırılmış halde tutulması gerekebilir. Genel olarak, çözelti uca daha hızlı girebildiğinden, uç daha genişse daldırma süresi daha kısadır.
3. Kılcal damarı mikroskop altında incelerken frit çözeltisinin polimerizasyonunu başlatmak için uç boyunca sıcak bir havya (350 °F'ye ayarlanmış) yerleştirin. Polimerizasyondan önce (Şekil 3A) ve sonra (Şekil 3B) çekilen ucu görmek için lütfen Şekil 3'e bakın.
4. Frit polimerizasyonundan sonra yayıcının tıkanmasını önlemek için, kolon ucunu 5 dakika boyunca %50 hidroflorik asit (HF) çözeltisine daldırın (kurulum Şekil 4'te gösterilmiştir). HF aşındırma ayrıca kolona düz bir koni şeklinde geometri kazandırarak uzun ömürlülüğünü artırır. HF aşındırma işleminden sonra, asitle temasa karşı korumak için kolonun ucunun önce HF nötrleştirici ile ve ardından cömertçe su ile iyice yıkandığından emin olun.
   DİKKAT: HF son derece tehlikeli ve aşındırıcı bir kimyasaldır. Maruz kalmayı önlemek için kullanım sırasında çok dikkatli olunması önerilir. HF'nin her zaman, "Tehlike! Akut Toksinler".
   1. Güvenlik için, HF ile çalışırken çift kat nitril ve neopren eldivenlere ek olarak hem normal hem de yanıcı laboratuvar önlükleri kullanın.
      NOT: Kılcal uçları frit etmek isteğe bağlıdır; Bununla birlikte, kolonu tıkanmaya karşı önemli ölçüde daha dirençli hale getirir ve ömrünü uzatır. Entegre bir elektrosprey yayıcıya sahip boş erimiş silika kılcal kolonlar ticari olarak temin edilebilir ve gerekirse 1. ve 2. adımların yerini almak için kullanılabilir.

3. Sabit fazın hazırlanması

1. 300 μL metanol içinde 1.9 μm partikül boyutu ve 120 şgözenek boyutuna sahip 25-50 mg tam gözenekli ReproSil-Pur 120 C18-AQ silika partiküllerini askıya alın. Bulamaç parçacıklarının metanol içinde homojen karışımını sağlamak için yaklaşık 20 kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
2. Bulamaç süspansiyonu içeren tüpü, şirket içi yerleşik bir sütun paketleme bomba sisteminin basınç hücresi odasının içine yerleştirin, bu da bulamaç parçacıklarının süspansiyon halinde kalmasına izin veren manyetik bir karıştırıcının üzerine kurulur. Paketleme sırasında HPLC bulamacının bozulmasını önlemek için bombayı sabit basınçta çalışan helyum tankına (<1500 psi) bağlayın. ( Şekil 5'te gösterilen şematik).
3. Basınç hücresinin kapağını, Şekil 6A'da gösterildiği gibi cıvatalarla yerine sıkarak sabitleyin.
   NOT: Bir HPLC pompasının ve HPLC paketleme bombasının çalışmasındaki farkı takdir etmek önemlidir. İlki, kolondaki sabit fazın uyguladığı geri basınçtan bağımsız olarak sabit akış hızında çalışacak şekilde tasarlanırken, HPLC paketleme basınç sistemleri, sabit faz parçacıklarının kılcal kolonun uzunluğu boyunca kesintisiz ve yoğun bir şekilde paketlenmesini sağlamak için sabit bir basınçta çalışır.

4. Kolonun sabit faz ile paketlenmesi

1. Önce kolon tabanını (açılmamış açık uç), kolonun ucu yukarı bakacak şekilde basınç bombasının üstündeki parmak sıkı bağlantıdan geçirin. Sütunu, bulamaç içeren şişenin tabanına değene kadar itin ve tabanın 1-2 mm yukarısına geri çekin. Kolonu yerine sabitlemek için parmak sıkı bağlantı parçasını sıkın.
2. Paketleme bombasını bir helyum gazı tankına bağlayın (önerilen basınç < 1500 psi) ve ~ 1300 psi'lik bir basınca getirin. Helyum gazı, üç bir vana aracılığıyla bulamaç içeren şişeyi barındıran basınç hücresine girer. Vanayı yavaşça saat yönünde 180° çevirerek açın.
   NOT: Helyum gazı haznenin içinde akmaya başlar başlamaz, bulamacı tüpten kılcal damara iter. Bulamaç kolondan geçerken, çözücü kolonun ucunda bir sıvı damlası oluştururken, partiküller kılcal damarda tutulur (Şekil 6B).
   1. Kolon ucunda sıvı damlası oluşumu gecikirse, açık olduğundan emin olmak için ucu hızla alevlendirin. Bu aşamada, kolonun arkasına yerleştirilen bir ışık kaynağı, paketleme işleminin ilerlemesini gözlemlemeye yardımcı olabilir (Şekil 7). 75 μm iç çapa sahip bir sütun için, yaklaşık 30 cm'lik bir uzunluğu paketlemek genellikle ~ 30-60 dakika sürer.
   2. Bulamacın kolondan akışı durur veya yavaşlarsa, kılcal damarı paketleme bombasının parmak sıkılığındaki bağlantısının üzerinde sıkıca tutun ve yaklaşık çeyrek tur çevirerek hafifçe gevşetin (basınçsızlaştırmanın tıslama sesi duyulabilir).
      NOT: Bu, bombanın basıncını tamamen boşaltmaya gerek kalmadan kolonun yeniden konumlandırılmasına izin verir.
   3. Şimdi kolonu yukarı ve aşağı hareket ettirerek nazikçe yeniden konumlandırın ve ardından kolonun şişenin tabanına temas etmediğinden emin olarak parmak sıkılığındaki bağlantı parçasını yeniden sıkın. Bu, bulamacın kılcal damardan her zaman düzgün bir şekilde akmasını sağlar.
   4. Yukarıda belirtilen önlem paketlemeye devam edemezse, valfi kapatın, paketleme bombasını havalandırın, kapağı sökün ve çökelti olmadığından emin olmak için bulamacı inceleyin. Kolon ucunun katı sabit faz parçacıkları ile tıkanması da mümkündür, bu durumda kılcal damarın arkasından küçük bir uzunluk kesmek akışın devam etmesine yardımcı olabilir.
3. Sabit parçacıkların tam olarak paketlenmesini sağlamak ve helyum kabarcıklarının paketlenmiş sütuna girme olasılığını en aza indirmek için sütunun sonunda istenen uzunluktan birkaç santimetre daha uzun paketleyin.

5. Sütunun bitirilmesi ve geri fritin yapılması

1. İstenen paketleme uzunluğu elde edildiğinde, helyum gazı tankının ana valfini kapatın ve kolonun düzgün bir şekilde paketlenmesini sağlamak ve sistemin kendi kendine basıncını düşürmesini sağlamak için en az 15 dakika bekleyin.
   NOT: Kolonun sonunda boş erimiş silikanın bir sonucu olarak He kabarcıklarının girmesini önlemek için, daha uzun bir paketleme uzunluğu önerilir. Basınç odası içindeki kılcal damarın uzunluğunu hesaba katmak için, kolonun gözle görülebilen kısmı paketlendikten sonra bile paketleme işlemine devam edilmesi çok önemlidir. Ek olarak, daha az hava kabarcığı ve daha yüksek paketleme verimliliği ile sonuçlandığından, kolonun tekrar tekrar yeniden konumlandırılmasının gerekli olduğu durumlarda daha uzun bir paketleme uzunluğu önerilir.
2. Valfi orijinal konumuna saat yönünün tersine 180 derece çevirerek haznenin basıncını nazikçe boşaltın. Kolonu sıkıca tutun, parmak sıkı bağlantı parçasını sökün ve kolonu kademeli olarak çıkarın. Hava kabarcıklarının girmesini önlemek için bu adımın çok nazikçe yapılması gerekir.
3. Sütunun ucunu 25,5 cm uzunluğunda kesin. Mikroskop altında incelerken, kolonun arka ucundan 350 cm uzunluğundaki bulamacı çıkarmak için 0.5 °F'de sıcak bir havya kullanın.
   1. Kolonun arka ucunu yaklaşık 10 saniye boyunca 2.1. adımdan kalan frit çözeltisine batırın ve mikroskop altında incelerken kolonun arkasına sıcak bir havya yerleştirerek polimerize edin. Arka frit, ReproSil-Pur 120 C18-AQ partiküllerinin kolonda kalmasını sağlar ve kromatografik yıkamalar sırasında geri akışı önler.
      NOT: Kolonun arkasındaki frit de isteğe bağlıdır ancak 2. adımda ön frit için de belirtildiği gibi kolonu daha sağlam hale getirir.

Sonuçlar

Kolonların performansını değerlendirmek için, HEK293 hücrelerinin tüm hücre lizatlarından hazırlanan 750 ng'lık triptik peptit sindirimi, protokolde açıklandığı gibi toplu ReproSil-Pur 120 C18-AQ partikülleri ile şirket içinde paketlenmiş 25 cm uzunluğunda, 75 μm ID kaynaşmış silika kılcal damar kullanılarak çevrimiçi olarak fraksiyonlandı. Numune yüklemeden önce, kolon 6:2:2 oranında 6 μL asetonitril, izopropanol ve H₂O karışımı kullanıl...

Tartışmalar

Modern proteomik stratejiler, karmaşık biyolojik sistemleri etkili bir şekilde analiz etmek için yüksek kaliteli kromatografik ayırmalara dayanır. Bu nedenle, yüksek performanslı ve uygun maliyetli nano akışlı LC kolonları, tek bir iş akışında binlerce proteini karakterize etmeyi amaçlayan başarılı bir tandem kütle spektrometresi rejiminin çok önemli bileşenleridir.

Bu çalışmada, yukarıda açıklanan protokol kullanılarak yapılan...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
99.99% Formamide acid	Sigma-Aldrich		for making frit
alcohol lamp	Any brand		For providing heat
Brechbuehler helium pressure cell	BioSurplus		for packing column
Ceramic column cutter	Any brand		for cutting silica capillary
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥ 99%	Sigma-Aldrich		Stored in a flammable cabinet
Formamide  ≥99.5%	Sigma-Aldrich		for making frit
Hydrofluoric acid (HF) (50%)	Fisher Scientific		for opening the emitter after polymerization
KASIL (Potassium Silicate Solution)	PQ Corporation		for making frit
Orbitrap Fusion Lumos	Thermo Fisher Scientific		for MS data acquisition
P2000 Laser Puller	Sutter		for pulling capillary
PTFE 1/16" Ferrule 0.4 mm ID (long) for Tube Fitting	Chromre	214104	For bomb setting
Reprosil-Pur 120 C18-AQ, 1.9 um, 1g	Dr. Masch GmbH	r119.aq.0001	Batch 5910
Soldering	Any brand		For initiating polimerization
Stainless Steel Pipe Fitting, Hex Coupling, 1/4 in. Female NPT	Swagelok	SS-4-HCG	for bomb setting
TSP075375 fused silica, 75 µm ID x 360 µOD	MOLEX/Polymicro	1068150019	For column tubing
Ultimate 3000 UHPLC	Dionex		HPLC type