Надежный метод упаковки колонок C18 RP-nano-HPLC с высоким разрешением

Резюме

В данной работе мы представляем и оцениваем протокол создания недорогих нанопроточных жидкостных хроматографических колонок с обращенной фазой для определения характеристик пептидов с использованием протеомных рабочих процессов ЖХ-МС/МС.

Аннотация

Высокая сложность, преобладающая в биологических образцах, требует эффективного анализа хроматографической сепарации с высокой чувствительностью и разрешением. В данной работе мы представляем надежный, воспроизводимый и недорогой протокол для подготовки высокопроизводительных колонок для жидкостной хроматографии (RP-ВЭЖХ) с нанопотоком и обратной фазой для разделения аналитических пептидов в режиме реального времени перед введением и детектированием с помощью масс-спектрометра в традиционных рабочих процессах протеомики снизу вверх. В зависимости от цели эксперимента и химических свойств разделяемых аналитов оптимальные параметры колонки могут различаться по их внутреннему или внешнему диаметру, длине, размеру частиц, размеру пор, химическому составу частиц в неподвижной фазе, а также наличию или отсутствию встроенного излучателя электрораспыления на наконечнике. Собственная система упаковки колонн не только позволяет быстро изготавливать колонны с желаемыми свойствами, но и значительно снижает стоимость процесса. Рассмотренный здесь оптимизированный протокол упаковки колонки C18 AQ (водный) из плавленого диоксида кремния совместим с широким спектром жидкостных хроматографических приборов для достижения эффективного разделения аналитов.

Введение

Колонки для ВЭЖХ внесли огромный вклад в производительность в области фармацевтических, медицинских и экологических исследований 1,2,3,4. Доступ к высококачественным хроматографическим колонкам является ключевым шагом в фракционировании сложных аналитов. В протеомике дробовика высокая аналитическая чувствительность обычно достигается путем сопряжения масс-спектрометрии (МС) электролучевой ионизации (ESI) с нанопроточной хроматографией 5,6,7,8. Эффективное разделение тысяч пептидов имеет первостепенное значение в этом приложении, поскольку оно позволяет масс-спектрометру идентифицировать и количественно определять аналиты с высокой чувствительностью и разрешением.

В последние годы область колонной упаковки для масс-спектрометрических приложений претерпела огромный рост благодаря прогрессу в понимании фундаментальных принципов упаковки колонок, связанных с морфологией стационарной фазы, взаимодействием растворителя и частиц и проектированием оборудования, что делает возможным детальную характеристику широкого спектра биомолекул в сложных биологических условиях 9,10,11,12,13,14 . Усилия, направленные на выявление практических соображений в области упаковки аналитических колонок для целей ЖХ-МС, проложили путь для протеомных лабораторий к разработке собственных систем упаковки для удовлетворения их конкретных интересов с обещанием максимальной производительности 15,16,17,18.

Для целей ионизации электрораспылением хорошо подходят колонки нанораспыления с внутренним диаметром в диапазоне 50-150 мкм и коническими концами. В области протеомики дробовика разделение обычно осуществляется с использованием градиента растворителя, протекающего через упакованную неполярную неподвижную фазу, чаще всего гидрофобный диоксид кремния, связанный углеродной цепью (C8-C30), с размерами частиц от 1,7 до 3,5 мкм 19,20,21,22. Элюирующие аналиты излучаются через встроенный в колонну эмиттер ESI, который обеспечивает мягкую ионизацию аналитов фазы раствора до газообразных ионов. Сопряжение колонок ЖХ с ESI-MS значительно продвинуло применение тандемной масс-спектрометрии к протеомным стратегиям в биомедицинских науках.

Колонки LC с узким внутренним диаметром приводят к более узким хроматоографическим пикам и более высокой чувствительности по сравнению с колонками с более высоким диаметром отверстия и микропотоком и, следовательно, особенно полезны при протеомных рабочих процессах. Несмотря на то, что коммерчески доступные предварительно упакованные колонны LC являются привлекательными вариантами благодаря своему удобству и простоте использования, они могут быть непомерно дорогими и менее гибкими, чем собственные варианты. Целью данной работы является описание технически простого и недорогого подхода к насадке суспензии для подготовки колонн ВЭЖХ с обращенной фазой узкого внутреннего диаметра с использованием капилляров из плавленого кремнезема и собственной системы бомб под давлением для протеомных применений.

протокол

1. Подготовка кончика капилляра

1. Используя керамический раскалывающий камень, вырежьте около 60-70 см капилляра из плавленого кремнезема с полиимидным покрытием с внутренним диаметром (ID) 75 μм и внешним диаметром (OD) 360 μм.
2. Придерживайте капилляр руками примерно на середине его длины, оставляя между пальцами зазор в 4-5 см и нагревайте участок в зазоре, вращая его над пламенем спиртовой лампы. Отполируйте обожженный участок с помощью пропитанной метанолом салфетки с низким ворсом, пока стекло не станет видимым. (Рисунок 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: 4-5 см капилляра из плавленого кремнезема с полиимидным покрытием необходимо обнажить и отполировать, прежде чем его можно будет загрузить в лазерный съемник.
3. Для того, чтобы вытащить конусообразный излучатель для ЭСИ, используют лазерный съемник наконечника со специальными программными настройками теплоты 300 (эквивалент 2 Вт мощности лазера), скоростью 10 (эквивалент 0,25 мм/с) и задержкой 180 миллисекунд для того, чтобы получить наконечник диаметром ~1-5 мкм (Рисунок 2 и Рисунок 3А). Загрузите полированную часть капилляра в лазерный съемник и нажмите на него, в результате чего две пустые капиллярные колонны будут готовы к упаковке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Частый осмотр наконечника на любом этапе производится с помощью микроскопа. Настройки, скорее всего, будут отличаться у разных лазерных съемников и должны быть определены опытным путем.

2. Полимеризация/травление наконечника

1. Для того чтобы удержать частицы неподвижной фазы в капиллярной трубке, приготовьте пористую фритту из смеси двух растворов силиката калия и формамида. Непосредственно перед применением внесите раствор в пробирку объемом 2 мл и перемешайте с помощью вортекса.
   1. Смешайте два раствора силиката калия с SiO₂/K₂O в соотношении 2,50 (w/w) и 1,65 (w/w) и формамидом в соотношении 1:3:1 (v/v/v) соответственно. Например, смешайте 100 мкл силиката калия с SiO₂/K₂O в соотношении 2,50 (по массе), 300 мкл силиката калия с SiO₂/K₂O в соотношении 1,65 (по массе)) и 100 мкл формамида с последующим вортексированием. Этот раствор полимеризуется при нагревании и образует пористую фритту.
2. Погрузите вытянутый лазером капиллярный кончик в прозрачный маточный раствор фриттовой суспензии (не осадок) примерно на 10-20 секунд, позволяя ему проникнуть примерно на 5 мм внутрь кончика за счет капиллярного действия. В зависимости от ширины наконечника может потребоваться дольше удерживать наконечник погруженным в раствор фритты. Как правило, время погружения сокращается, если наконечник шире, так как раствор может быстрее входить в наконечник.
3. Поместите горячий паяльник (с температурой 350 °F) вдоль жала, чтобы инициировать полимеризацию раствора фритты во время осмотра капилляра под микроскопом. Пожалуйста, обратитесь к Рисунку 3 , чтобы увидеть вытянутый кончик до (Рисунок 3A) и после полимеризации (Рисунок 3B).
4. Чтобы предотвратить засорение эмиттера после фриттовой полимеризации, погрузите кончик колонки в 50% раствор фтористоводородной кислоты (HF) на 5 минут (настройка показана на рисунке 4). Высокочастотное травление также придает колонне плоскую конусообразную геометрию, увеличивая ее долговечность. После травления HF убедитесь, что наконечник колонки тщательно промыт, сначала нейтрализатором HF, а затем обильно водой для защиты от контакта с кислотой.
   ВНИМАНИЕ: HF является очень опасным и коррозионным химическим веществом. Рекомендуется соблюдать крайнюю осторожность при обращении, чтобы предотвратить контакт. Убедитесь, что при работе с ВЧ всегда обеспечивается соответствующая защита внутри вытяжного шкафа, обозначенного табличкой с надписью «Опасно! острые токсины».
   1. Для безопасности при работе с ВЧ используйте как обычные, так и негорючие лабораторные халаты, а также двойные слои нитриловых и неопреновых перчаток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Необязательно для фритты капиллярных кончиков; Тем не менее, это делает колонну значительно более устойчивой к засорению и увеличивает ее долговечность. Пустые капиллярные колонки из плавленого диоксида кремния со встроенным излучателем электрораспыления коммерчески доступны и при необходимости могут использоваться для замены этапов 1 и 2.

3. Подготовка стационарной фазы

1. Суспендируйте 25-50 мг полностью пористых частиц диоксида кремния ReproSil-Pur 120 C18-AQ с размером частиц 1,9 мкм и размером пор 120 Å в 300 мкл метанола. Пипетируйте вверх и вниз около 20 раз, чтобы обеспечить однородную смесь частиц суспензии в метаноле.
2. Поместите трубку, содержащую суспензию суспензии, в камеру камеры давления собственной конструкции с колонной и упаковочной бомбой, которая, в свою очередь, установлена на магнитной мешалке, позволяющей частицам суспензии оставаться во взвешенном состоянии. Подсоедините бомбу к гелиевому баллону (<1500 фунтов на квадратный дюйм), который работает при постоянном давлении, чтобы не нарушить воздействие суспензии ВЭЖХ во время упаковки. (Схема представлена на рисунке 5).
3. Зафиксируйте крышку датчика давления, затянув ее на месте болтами, как показано на рисунке 6A.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно понимать разницу в работе насоса ВЭЖХ и насадочной бомбы для ВЭЖХ. В то время как первая предназначена для работы с постоянной скоростью потока независимо от противодавления, создаваемого неподвижной фазой в колонне, системы давления насадки ВЭЖХ работают при постоянном давлении, обеспечивая непрерывную и плотную упаковку частиц неподвижной фазы по всей длине капиллярной колонны.

4. Насадка колонны с неподвижной фазой

1. Проденьте нижнюю часть колонны вперед (без фриттированного открытого конца) через плотно обтягивающий фитинг в верхней части бомбы под давлением так, чтобы кончик колонны был направлен вверх. Протолкните колонну до тех пор, пока она не коснется дна флакона, содержащего суспензию, и втяните ее на 1-2 мм над основанием. Затяните плотно прилегающий фитинг, чтобы зафиксировать колонну на месте.
2. Подсоедините упаковочную бомбу к гелиевому газовому баллону (рекомендуемое давление < 1500 фунтов на квадратный дюйм) и включите ее на давление ~ 1300 фунтов на квадратный дюйм. Газообразный гелий поступает в ячейку давления, в которой находится флакон с суспензией, через трехходовой клапан. Откройте клапан, медленно поворачивая его на 180° по часовой стрелке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как только газообразный гелий начинает течь внутри камеры, он выталкивает суспензию из трубки в капилляр. Когда суспензия проходит через колонну, частицы задерживаются в капилляре, в то время как растворитель образует каплю жидкости на кончике колонны (рис. 6B).
   1. Если образование капель жидкости на кончике колонки задерживается, быстро разожгите наконечник, чтобы убедиться, что он открыт. На этом этапе источник света, расположенный позади колонны, может помочь наблюдать за ходом процесса упаковки (Рисунок 7). Для колонны с внутренним диаметром 75 мкм обычно требуется ~30-60 минут, чтобы упаковать ее длиной около 30 см.
   2. Если поток пульпы через колонну прекращается или замедляется, плотно прижмите капилляр над плотно прилегающим приспособлением упаковочной бомбы и слегка ослабьте его, повернув примерно на четверть оборота (может быть слышен шипящий звук разгерметизации).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволяет перемещать колонну без необходимости полного разгерметизации бомбы.
   3. Теперь аккуратно переместите колонну, перемещая ее вверх и вниз, а затем снова затяните плотно прилегающую поверхность, убедившись, что колонка не касается дна флакона. Это обеспечивает равномерное течение суспензии через капилляр в любое время.
   4. Если вышеупомянутая мера не позволяет возобновить укладку, закройте клапан, проветрьте сальниковую бомбу, открутите крышку и осмотрите суспензию, чтобы убедиться в отсутствии осадка. Также возможно, что конец колонны забит твердыми частицами неподвижной фазы, и в этом случае разрезание небольшой длины задней части капилляра может помочь возобновлению потока.
3. Упаковывайте на несколько сантиметров длиннее желаемой длины в конце колонны, чтобы обеспечить полную упаковку неподвижных частиц и свести к минимуму возможность попадания пузырьков гелия в упакованную колонну.

5. Отделываем колонну и делаем бэк-фритту

1. Как только желаемая длина уплотнения будет достигнута, закройте главный клапан гелиевого газового бака и подождите не менее 15 минут, чтобы обеспечить равномерную укладку колонны и дать возможность системе самосбросить давление.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во избежание образования пузырьков He в результате образования пустого плавленого диоксида кремния в конце колонны, рекомендуется использовать более длинную упаковку. Крайне важно, чтобы процесс упаковки был продолжен даже после того, как видимая глазу часть колонны была упакована с учетом длины капилляра внутри камеры давления. Кроме того, более длинная насадка рекомендуется в тех случаях, когда требуется многократное изменение положения колонны, так как это приводит к уменьшению количества пузырьков воздуха и повышению эффективности упаковки.
2. Аккуратно сбросьте давление в камере, повернув клапан на 180 градусов против часовой стрелки в исходное положение. Крепко держите колонку, открутите плотный штуцер и постепенно снимайте колонку. Этот шаг нужно делать очень аккуратно, чтобы избежать попадания пузырьков воздуха.
3. Обрежьте конец столбика длиной 25,5 см. При осмотре под микроскопом используйте горячий паяльник при температуре 350 °F, чтобы удалить суспензию длиной 0,5 см с заднего конца колонки.
   1. Окуните задний конец колонки в оставшийся от шага 2.1 раствор фритты примерно на 10 секунд и полимеризуйте его, поместив горячий паяльник вдоль задней части колонки во время ее осмотра под микроскопом. Обратная фритта обеспечивает удержание частиц ReproSil-Pur 120 C18-AQ в колонке и предотвращает обратный поток во время хроматографической промывки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фритта в задней части колонны также не является обязательной, но делает колонну более прочной, как было отмечено для передней фритты на шаге 2.

Результаты

Для оценки производительности колонок 750 нг дигестов триптических пептидов, приготовленных из цельных клеточных лизатов клеток HEK293, были фракционированы в режиме онлайн с использованием капилляра из плавленого диоксида кремния длиной 25 см и внутренним диаметром 75 м...

Обсуждение

Современные протеомные стратегии основаны на высококачественном хроматографическом разделении для эффективного анализа сложных биологических систем. Таким образом, высокопроизводительные и экономичные нанопроточные колонки LC являются важнейшими компонентами у?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
99.99% Formamide acid	Sigma-Aldrich		for making frit
alcohol lamp	Any brand		For providing heat
Brechbuehler helium pressure cell	BioSurplus		for packing column
Ceramic column cutter	Any brand		for cutting silica capillary
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥ 99%	Sigma-Aldrich		Stored in a flammable cabinet
Formamide  ≥99.5%	Sigma-Aldrich		for making frit
Hydrofluoric acid (HF) (50%)	Fisher Scientific		for opening the emitter after polymerization
KASIL (Potassium Silicate Solution)	PQ Corporation		for making frit
Orbitrap Fusion Lumos	Thermo Fisher Scientific		for MS data acquisition
P2000 Laser Puller	Sutter		for pulling capillary
PTFE 1/16" Ferrule 0.4 mm ID (long) for Tube Fitting	Chromre	214104	For bomb setting
Reprosil-Pur 120 C18-AQ, 1.9 um, 1g	Dr. Masch GmbH	r119.aq.0001	Batch 5910
Soldering	Any brand		For initiating polimerization
Stainless Steel Pipe Fitting, Hex Coupling, 1/4 in. Female NPT	Swagelok	SS-4-HCG	for bomb setting
TSP075375 fused silica, 75 µm ID x 360 µOD	MOLEX/Polymicro	1068150019	For column tubing
Ultimate 3000 UHPLC	Dionex		HPLC type