Análisis de todo el genoma de la distribución de modificaciones de histonas utilizando el método de secuenciación de inmunoprecipitación de cromatina en Magnaporthe oryzae

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para analizar la distribución de las modificaciones de histonas en todo el genoma, que puede identificar nuevos genes diana en la patogénesis de M. oryzae y otros hongos filamentosos.

Resumen

La secuenciación de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP-seq) es una técnica molecular poderosa y ampliamente utilizada para mapear las ubicaciones del genoma completo de los factores de transcripción (TF), los reguladores de cromatina y las modificaciones de histonas, así como para detectar genomas completos para descubrir patrones de unión a TF y modificaciones posttraduccionales de histonas. Las actividades modificadoras de la cromatina, como la metilación de histonas, a menudo se reclutan para secuencias reguladoras de genes específicas, causando cambios localizados en las estructuras de la cromatina y dando lugar a efectos transcripcionales específicos. La explosión del arroz es una enfermedad fúngica devastadora en el arroz en todo el mundo y es un sistema modelo para estudiar la interacción hongo-planta. Sin embargo, los mecanismos moleculares en la forma en que las modificaciones de histonas regulan sus genes de virulencia en Magnaporthe oryzae siguen siendo esquivos. Más investigadores necesitan usar ChIP-seq para estudiar cómo la modificación epigenética de histonas regula sus genes objetivo. ChIP-seq también se utiliza ampliamente para estudiar la interacción entre la proteína y el ADN en animales y plantas, pero es menos utilizado en el campo de la fitopatología y no ha sido bien desarrollado. En este artículo, describimos el proceso experimental y el método de operación de ChIP-seq para identificar la distribución de todo el genoma de la metilación de histonas (como H3K4me3) que se une a los genes diana funcionales en M. oryzae. Aquí, presentamos un protocolo para analizar la distribución de las modificaciones de histonas en todo el genoma, que puede identificar nuevos genes diana en la patogénesis de M. oryzae y otros hongos filamentosos.

Introducción

La epigenética es una rama de la investigación genética que se refiere al cambio heredable de la expresión génica sin cambiar la secuencia de nucleótidos de los genes. Un número creciente de estudios han demostrado que la regulación epigenética juega un papel importante en el crecimiento y desarrollo de las células eucariotas, incluida la cromatina que regula y afecta la expresión génica a través del proceso dinámico de plegamiento y ensamblaje en estructuras de orden superior^1,2. La remodelación de la cromatina y la modificación de las histonas covalentes afectan y regulan la función y estructura de la cromat....

Protocolo

1. Preparación de protoplastos de M. oryzae

1. Preparar el agar avena-tomate (OTA).
   1. Pesar 30-50 g de avena y hervirla en 800 mL de agua (ddH₂O) durante 20 min. Filtre a través de dos capas de gasa y tome el filtrado.
   2. Recoge los tomates maduros y pélalos. Exprima el jugo y filtre a través de dos capas de gasa para recolectar 150 ml del jugo filtrado.
   3. Mezclar bien todo el zumo de tomate y el filtrado de avena preparado y añadir ddH₂O hasta 1000 mL.
   4. Añadir 250 ml de OTA y 2,5 g de polvo de agar a un matraz cónico de 500 ml y autoclave durante 20 min. Conservar a 25 °C.
2. V....

Resultados

Todo el diagrama de flujo del método ChIP-seq se muestra en la Figura 1. Los experimentos ChIP-seq se realizaron utilizando anticuerpos contra H3K4me3 en la cepa de tipo salvaje P131 y tres cepas mutantes nulas que carecían del gen mobre2, mospp1y moswd2 para verificar el perfil completo del genoma completo de la distribución de la histona H3K4me3 en M. oryzae. Los protoplastos de la cepa de tipo salvaje, Δmobre2, Δmospp1y Δmosw.......

Discusión

Recientemente, ChIP-seq se ha convertido en un método de análisis genómico ampliamente utilizado para determinar los sitios de unión de TFs o sitios de enriquecimiento modificados por histonas específicas. En comparación con la tecnología ChIP-seq anterior, la nueva tecnología ChIP-seq es altamente sensible y flexible. Los resultados se proporcionan en alta resolución sin efectos negativos, como la señal de ruido causada por la hibridación inespecífico de ácidos nucleicos. Aunque este es un análisis de expr.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
acidic casein hydrolysate	WAKO	65072-00-6	Medium configuration
agar powder	scientan	9002-18-0	Medium configuration
deoxycholic acid	MedChemExpress	83-44-3	protein and dissolution
DNA End-Repair kit	NovoBiotec	ER81050	Repair DNA or cDNA damaged by enzymatic or mechanical shearing
Dynabeads	Invitrogen	no.100.02D	Binding target
EB buffer	JIMEI	JC2174	Membrane and liquid
EDTA	ThermoFisher	AM9912	protease inhibitor
enzymatic casein hydrolysate	Sigma	91079-40-2	Medium configuration
glucose	Sigma	50-99-7	Medium configuration
glycogen	ThermoFisher	AM9510	Precipitant action
H3K4me3 antibodies	Abcam	ab8580	Immune response to H3K4me3 protein
illumina Genome Analyzer	illumina	illumina Hiseq 2000	Large configuration
Illumina PCR primers	illumina	CleanPlex	Random universal primer
isoamyl alcohol	chemical book	30899-19-5	Purified DNA
LiCl	ThermoFisher	AM9480	specific removal RNA
lysing enzymes	Sigma	L1412-10G	cell lysis buffer
Mouse IgG	Yeasen	36111ES10	Animal normal immunoglobulin
NaCl solution	ThermoFisher	7647-14-5	Medium configuration
NaHCO3	Seebio	SH30173.08*	preparation of protein complex eluent
NP-40	ThermoFisher	85124	cell lysate to promote cell lysis
PCR Purification kit	Qiagen	28004	The purification procedure removes primers from DNA samples
protease inhibitors	ThermoFisher	A32965	A protein inhibitor that decreases protein activity
Proteinase K	ThermoFisher	AM2546	DNA Extraction Reagent
Qubit 4.0	ThermoFisher	Q33226	Medium configuration
RIPA buffer	ThermoFisher	9806S	cell lysis buffer
RNase A	ThermoFisher	AM2271	Purified DNA
SDS	ThermoFisher	AM9820	cover up the charge differences
sodium acetate solution	ThermoFisher	R1181	Acetic acid buffer
sodium deoxycholate	ThermoFisher	89904	inhibition of protease degradation
T4 DNA ligase	ThermoFisher	EL0011	Under the condition of ATP as coenzyme, DNA ligase
T4 DNA ligase buffer	ThermoFisher	B69	DNA ligase buffer
Tris-HCl	ThermoFisher	1185-53-1	buffer action
Triton X-100	ThermoFisher	HFH10	keep the membrane protein stable
yeast extract	OXOID	LP0021	Medium configuration