Análisis de todo el genoma de la distribución de modificaciones de histonas utilizando el método de secuenciación de inmunoprecipitación de cromatina en Magnaporthe oryzae

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para analizar la distribución de las modificaciones de histonas en todo el genoma, que puede identificar nuevos genes diana en la patogénesis de M. oryzae y otros hongos filamentosos.

Resumen

La secuenciación de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP-seq) es una técnica molecular poderosa y ampliamente utilizada para mapear las ubicaciones del genoma completo de los factores de transcripción (TF), los reguladores de cromatina y las modificaciones de histonas, así como para detectar genomas completos para descubrir patrones de unión a TF y modificaciones posttraduccionales de histonas. Las actividades modificadoras de la cromatina, como la metilación de histonas, a menudo se reclutan para secuencias reguladoras de genes específicas, causando cambios localizados en las estructuras de la cromatina y dando lugar a efectos transcripcionales específicos. La explosión del arroz es una enfermedad fúngica devastadora en el arroz en todo el mundo y es un sistema modelo para estudiar la interacción hongo-planta. Sin embargo, los mecanismos moleculares en la forma en que las modificaciones de histonas regulan sus genes de virulencia en Magnaporthe oryzae siguen siendo esquivos. Más investigadores necesitan usar ChIP-seq para estudiar cómo la modificación epigenética de histonas regula sus genes objetivo. ChIP-seq también se utiliza ampliamente para estudiar la interacción entre la proteína y el ADN en animales y plantas, pero es menos utilizado en el campo de la fitopatología y no ha sido bien desarrollado. En este artículo, describimos el proceso experimental y el método de operación de ChIP-seq para identificar la distribución de todo el genoma de la metilación de histonas (como H3K4me3) que se une a los genes diana funcionales en M. oryzae. Aquí, presentamos un protocolo para analizar la distribución de las modificaciones de histonas en todo el genoma, que puede identificar nuevos genes diana en la patogénesis de M. oryzae y otros hongos filamentosos.

Introducción

La epigenética es una rama de la investigación genética que se refiere al cambio heredable de la expresión génica sin cambiar la secuencia de nucleótidos de los genes. Un número creciente de estudios han demostrado que la regulación epigenética juega un papel importante en el crecimiento y desarrollo de las células eucariotas, incluida la cromatina que regula y afecta la expresión génica a través del proceso dinámico de plegamiento y ensamblaje en estructuras de orden superior^1,2. La remodelación de la cromatina y la modificación de las histonas covalentes afectan y regulan la función y estructura de la cromatina a través de la variación de los polímeros de cromatina, logrando así la función de regular la expresión^{génica 3,4,5,6.} Las modificaciones posttraduccionales de la histona incluyen acetilación, fosforilación, metilación, monoubiquitinación, sumoilación y ribosilación ADP^7,8,9. La metilación de la histona H3K4, particularmente la trimetilación, se ha mapeado a los sitios de inicio de la transcripción donde se asocia con la replicación de la transcripción, la recombinación, la reparación y el procesamiento de ARN en eucariotas^10,11.

La tecnología ChIP-seq se introdujo en 2007 y se ha convertido en el estándar experimental para el análisis de todo el genoma de la regulación transcripcional y los mecanismos epigenéticos^12,13. Este método es adecuado a escala de todo el genoma y para obtener información de interacción de histonas o factores de transcripción, incluidos los segmentos de ADN de las proteínas de unión al ADN. Cualquier secuencia de ADN entrecruzada a proteínas de interés coprecipitará como parte del complejo de cromatina. Las técnicas de secuenciación de nueva generación también se utilizan para secuenciar 36-100 pb de ADN, que luego se emparejan con el genoma objetivo correspondiente.

En hongos fitopatógenos, la investigación ha comenzado recientemente a estudiar cómo las modificaciones de metilación de histonas regulan sus genes diana en el proceso de patogenicidad. Algunos estudios previos demostraron que la regulación de los genes relacionados con la histona metilasa se refleja principalmente en el silenciamiento génico y la catalización de la producción de metabolitos secundarios (SM). MoSet1 es la H3K4 metilasa en M. oryzae. La eliminación de este gen da como resultado la eliminación completa de la modificación H3K4me3¹⁴. En comparación con la cepa de tipo salvaje, la expresión del gen MoCEL7C en el mutante se inhibe en el estado inducido por CMC y en el estado no inducido (glucosa o celobiosa), la expresión de MoCEL7C aumentó¹⁵. En Fusarium graminearum,KMT6 puede catalizar la modificación de la metilación de H3K27me3, regular el desarrollo normal de hongos y ayudar a regular el "genoma críptico" que contiene el grupo de genes SM^16,17,18,19. En 2013, Connolly informó que la metilación de H3K9 y H3K27 regula el proceso patogénico de los hongos a través de metabolitos secundarios y factores efectores que regulan la inhibición de los genes diana²⁰. En Aspergillus,la modificación de las histonas H3K4me2 y H3K4me3 está relacionada con la activación génica y juega un papel importante en el control de la regulación del nivel de cromatina de los grupos de genes SM^21. En M. oryzae,Tig1 (homólogo a Tig1 en levaduras y mamíferos) es un HADC (histona desacetilasa)²². La eliminación del gen Tig1 conduce a la pérdida completa de la patogenicidad y la capacidad de producción de esporas en el mutante nulo. Es más sensible a un ambiente de peroxígeno, que no puede producir hifas infecciosas²².

La explosión de arroz causada por M. oryzae. es una de las enfermedades más graves del arroz en la mayoría de las zonas de cultivo de arroz en el mundo¹⁹. Debido a su proceso de infección representativo, M. oryzae es similar al proceso de infección de muchos hongos patógenos importantes. Como puede llevar a cabo fácilmente operaciones genéticas moleculares, el hongo se ha convertido en un organismo modelo para el estudio de las interacciones fúngico-planta²³. El bloqueo de cada paso del proceso de infección de M. oryzae puede resultar en una infección fallida. Los cambios morfológicos durante el proceso de infección están estrictamente regulados por la función completa del genoma y la transcripción de genes. Entre ellas, las modificaciones epigenéticas como la metilación de histonas juegan un papel esencial en la regulación transcripcional de los genes funcionales^24,25. Sin embargo, hasta ahora, se han realizado pocos estudios sobre el mecanismo molecular de las modificaciones epigenéticas como la metilación de histonas y la acetilación de histonas en la transcripción de genes de patogénesis en M. oryzae. Por lo tanto, desarrollar aún más el mecanismo de regulación epigenética del hongo de la explosión de arroz mientras se investiga en la red reguladora aguas arriba y aguas abajo de estos genes patógenos relacionados ayudará a desarrollar estrategias de prevención y control de la explosión de arroz.

Con el desarrollo de la genómica funcional como ChIP-seq, especialmente en epigenética, este método de adquisición de datos de alto rendimiento ha acelerado la investigación sobre los cromosomas. Utilizando la tecnología experimental ChIP-seq, se puede identificar la distribución de todo el genoma de la metilación de histonas (como H3K4me3, H3K27me3, H3K9me3) en M. oryzae y otros hongos filamentosos. Por lo tanto, este método puede ayudar a dilucidar los mecanismos moleculares subyacentes a cómo las modificaciones epigenéticas regulan sus genes diana candidatos durante la patogénesis fúngica en la patología vegetal.

Protocolo

1. Preparación de protoplastos de M. oryzae

1. Preparar el agar avena-tomate (OTA).
   1. Pesar 30-50 g de avena y hervirla en 800 mL de agua (ddH₂O) durante 20 min. Filtre a través de dos capas de gasa y tome el filtrado.
   2. Recoge los tomates maduros y pélalos. Exprima el jugo y filtre a través de dos capas de gasa para recolectar 150 ml del jugo filtrado.
   3. Mezclar bien todo el zumo de tomate y el filtrado de avena preparado y añadir ddH₂O hasta 1000 mL.
   4. Añadir 250 ml de OTA y 2,5 g de polvo de agar a un matraz cónico de 500 ml y autoclave durante 20 min. Conservar a 25 °C.
2. Vierta 25 ml de la OTA en autoclave en un vaso de 5 cm x 5 cm de placa de Petri. Prepara 10 de estas placas de Petri en total. Después de que la OTA se haya solidificado en las placas de Petri, guarde los platos boca abajo a 25 ° C.
3. Use un palillo esterilizado para extraer un pequeño trozo de micelio de M. oryzae (la cepa de tipo salvaje P131, las cepas knockout Δmobre2, Δmospp1 y Δmoswd2)y colóquelos en los platos OTA preparados. Cultivarlos durante 4-6 días a 28 °C en condiciones de luz.
   NOTA: Gire la placa de Petri boca abajo para evitar la contaminación.
4. Agregue 1000 μL de medio completo (CM) líquido (0.6% extracto de levadura, hidrolizado de caseína enzimática al 0.3%, hidrolizado de caseína ácida al 0.3%, glucosa al 1%) a los platos OTA usando una pipeta de 1000 μL.
   NOTA: Las hifas crecieron en los platos de la OTA durante 4-6 días.
5. Raspe el micelio de la cepa de tipo salvaje y la cepa knockout con un lazo de inoculación.
6. Recoja los restos de micelio y transfiéralos a 250 ml de medio completo líquido (CM).
7. Cultive los restos de hongos en un matraz triangular a 28 °C durante 36 h con agitación a 150 rpm.
8. Use un embudo para filtrar y recoger las hifas fúngicas.
9. Lavar las hifas fúngicas con 500 ml de solución de NaCl de 0,7 M.
10. Recoge el micelio fúngico y pésalo.
    NOTA: El micelio no necesita ser secado antes de pesar.
11. Agregue ~ 1 ml de solución de permeación de la enzima de lisis por 1 g del micelio fúngico.
    1. Preparar la solución de permeación de la enzima de lisis de 20 mg/ml disolviendo la enzima de lisis de Trichoderma harzianum en 0,7 M de NaCl.
12. Coloque las hifas para lisar a 28 °C durante 3-4 h con agitación a 150 rpm.
13. Lavar las hifas lisadas con 50 ml de solución de NaCl de 0,7 m.
14. Recoger los protoplastos y la centrífuga durante 15 min a 2.000 x g y 4 °C.
15. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante con cuidado. Resuspend los protoplastos en 20 mL de 0,7 M NaCI tampón a 4 °C.

2. Reticulación y sonicación in vivo

1. Añadir 55 μL de formaldehído al 37% (añadir formaldehído gota a gota hasta que la concentración final sea del 1%) a 2 ml de tampón de NaCI que contenga protoplasto para la reticulación.
2. Incubar los protoplastos a 25 °C durante 10 min.
3. Agregue 20 μL de glicina 10x a cada tubo para apagar el formaldehído no reaccionado.
4. Remolino para mezclar e incubar a 25 °C durante 5 min.
5. Centrifugadora durante 15 min a 2.000 x g y 4 °C.
6. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante con cuidado. Resuspend el pellet en 1 mL de solución de NaCI de 0,7 M.
7. Centrifugadora durante 10 min a 2.000 x g y 4 °C.
8. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante con cuidado. Resuspend el pellet en 750 μL de tampón RIPA (50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8, 1% NP-40, 0,5% desoxicolato de sodio, 0,1% SDS e inhibidores de la proteasa).
9. Añadir 37,5 μL de inhibidor de la proteasa 20x.
10. Transfiera los protoplastos del paso anterior a un tubo centrífugo de 1,5 ml.
11. Realice la sonicación (25% W, salida 3 s, parada 5 s, 4 °C) inmediatamente con un sonicador durante aproximadamente 10 min. El propósito de este paso es sonicar el lisado reticulado durante un período de tiempo para determinar las mejores condiciones.
    NOTA: El lisato se puede congelar a -80 °C en este paso.
12. Si ya se han determinado las condiciones óptimas para la sonicación, continúe con el siguiente paso.
13. Si lo desea, retire 5 μL de protoplastos para el análisis en gel de agarosa (ADN no escuchado).
14. Corte la cromatina por sonicación con un homogeneizador ultrasónico durante 8 min (25% W, salida 3 s, parada 5 s, 4 °C).
15. Después de que la muestra se rompa por ultrasonidos, saque una parte de la muestra como "entrada". La entrada no realiza el experimento ChIP y contiene todo el ADN y la proteína liberados después de que la muestra se sonica.
16. Después de la sonicación, ejecute una electroforesis en gel de agarosa al 1% para analizar la longitud de los fragmentos de ADN.
    NOTA: Los resultados de la electroforesis en gel de agarosa muestran que la longitud del fragmento de ADN es de 200-500 pb(Figura 4).
17. Coloque el tubo sonicado sobre hielo para evitar la degradación de proteínas.
18. Centrifugadora durante 10 min a 10.000 x g y 4 °C.
19. Después de la centrifugación, transfiera el sobrenadante centrifugado a un nuevo tubo de centrífuga de 1,5 ml y guárdelo a -80 °C para su uso posterior. La solución de cromatina obtenida en este paso se puede utilizar para IP posterior.
20. Antes de realizar el experimento IP, diluya cada muestra de cromatina a una proporción de 1:10 con 1x tampón RIPA (por ejemplo, agregue 10 μL de muestra de cromatina a 1 μL de tampón 1×RIPA).

3. IP de proteína/ADN reticulado

1. Pipete 50 μL de perlas de proteína superparamagnética en un tubo centrífugo de 2 ml. Coloque los tubos en un soporte magnético. Deja que las cuentas magnéticas precipiten. Retire el sobrenadante.
2. Agregue 1 ml de tampón RIPA 1x (preenfriado en hielo) al tubo y lave las perlas de proteína superparamagnética tres veces. Después del lavado, coloque los tubos en un soporte magnético y retire el sobrenadante. Añadir 100 μL de 1x tampón RIPA a cada tubo.
3. Agregue 300 μL de muestra de chormatina (se utilizaron 2 x^{10 7} células), 100 μL de perlas de proteína superparamagnética y 4 μL de anticuerpo H3K4me3 al tubo.
4. Utilice muestras con IgG de ratón como control negativo.
   NOTA: La IgG de ratón utilizada en este protocolo contiene 0,01 M de tampón de fosfato y 0,15 M de NaCl, y permanecerá congelada por debajo de 20 °C (ver Tabla de Materiales).
5. Después de mezclar bien, coloque las muestras en un agitador rotativo e incube durante la noche a 4 ° C, 30 x g.
   NOTA: Puede ser posible reducir el tiempo de incubación de la inmunoprecipitación (IP). El tiempo de incubación depende de diferentes factores (por ejemplo, el anticuerpo, el gen objetivo, el tipo de célula, etc.) y deberá probarse empíricamente.

4. Recogida y enjuague de los productos IP

1. Pellet las perlas de proteína superparamagnética colocándolas en un soporte magnético. Aspirar y desechar el sobrenadante.
2. Lave el complejo de perlas/cromatina de la proteína superparamagnética resuspiendo las perlas en 1 ml de 1 tampón RIPA.
3. Enjuague el tubo en un agitador rotativo durante 5 min y retire el sobrenadante a 30 x g.
4. Agregue 1 ml de tampón de lavado de complejo inmune bajo en sal (0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8.1 y 150 mM NaCl).
5. Enjuague el tubo en un agitador rotativo durante 5 minutos y retire el sobrenadante.
6. Agregue 1 ml de tampón de lavado de complejo inmune con alto contenido de sal (0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8.1 y 500 mM NaCl) al tubo de la centrífuga.
7. Coloque el tubo en un agitador giratorio durante 5 minutos y retire el sobrenadante.
8. Enjuague con 1 ml de LiCl (0,25 M de LiCl, 1% de NP-40, 1% de ácido desoxicólico, 1 mM de EDTA y 10 mM de Tris-HCl pH 8,1) en el tubo de la centrífuga.
9. Coloque el tubo en un agitador giratorio durante 5 minutos y retire el sobrenadante.
10. Enjuague el tubo de ensayo nuevamente con 1 ml de tampón LiCI de 0.25 M, retire el sobrenadante con una pipeta y luego deseche el sobrenadante.
11. Añadir 1 mL de tampón TE (10 mM Tris-HCl pH 8.1, 1 mM EDTA).
12. Coloque el tubo en un agitador rotativo durante 5 min a 30 x g.
13. Lave el tubo de nuevo con un tampón TE de 1 ml y retire el sobrenadante con una pipeta.
14. Recoge las cuentas.

5. Elución de complejos proteína/ADN

1. Preparar el tampón de elución (10 μL de SDS al 20%, 20 μL de 1 M NaHCO_3,170 μL de H₂O destilado estéril) para todos los tubos IP y de entrada.
2. Añadir 100 μL de tampón de elución a cada tubo de centrífuga.
3. Elución a 65 °C durante 15 min.
4. Centrifugar durante 1 min a 10.000 x g y 4 °C y recoger el sobrenadante en nuevos tubos de centrífuga.
5. Repita los pasos 5.2 a 5.4 y combine los eluidos. Añadir 190 μL de tampón de elución a los 10 μL del ADN de entrada. (volumen total = 200 μL).

6. Reticulación inversa de complejos proteína/ADN

1. Agregue 8 μL de NaCl de 5 M a todos los tubos e incube a 65 ° C durante 4-5 h o durante la noche para revertir los enlaces cruzados ADN-proteína.
   NOTA: Después de este paso, almacene las muestras a -20 °C y continúe con el protocolo al día siguiente, si es necesario.
2. Añadir 1 μL de RNasa A e incubar durante 30 min a 37 °C.
3. Añadir 4 μL de proteinasa K (disuelta en H₂O a 20 mg/ml y almacenada a -20 °C) a cada tubo e incubar a 45 °C durante 1-2 h.

7. Purificación y recuperación del ADN

1. Añadir 550 μL de mezcla de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (proporción de 25:24:1) al tubo de la centrífuga.
2. Vórtice completamente la mezcla durante 1 min.
3. Centrifugar durante 15 min a 10.000 x g y aspirar el sobrenadante.
4. Transfiera el sobrenadante extraído del paso anterior a un nuevo tubo centrífugo de 1,5 ml.
5. Añadir 1/10 de volumen de solución de acetato de sodio 3 M, 2,5 volúmenes de etanol absoluto y 3 μL de glucógeno (20 mg/ml) al tubo.
6. Coloque la muestra en un refrigerador a -20 °C durante la noche para la precipitación.
7. Centrifugadora durante 15 min a 10.000 x g y 4 °C.
8. Deseche el sobrenadante después de la centrifugación. Lave el pellet tres veces con 1 ml de etanol al 75% (debe prepararse fresco) a 10.000 x g.
9. Coloque el precipitado lavado en un banco limpio para dejar que el alcohol se seque.
10. Añadir 50 μL de H₂O desionizado estéril para disolver suficientemente el precipitado.
11. Ligar el adaptador de secuenciación al fragmento de ADN y utilizar una plataforma de secuenciación de alto rendimiento para secuenciar el ADN.

8. Reparación del ADN y construcción de la biblioteca Solexa

1. Repare los extremos del ADN para generar ADN romo utilizando un kit de reparación final de ADN (1-34 μL de ADN, 5 μL de tampón de reparación final 10x, 5 μL de 2.5 mM cada dNTP, 5 μL de 10 mM ATP, 1 μL de mezcla de enzimas de reparación final y H₂O para ajustar el volumen de reacción a 49 μL).
2. Utilice un kit de purificación por PCR o fenol: extracción de cloroformo para purificar el ADN. Eluar o resuspend el ADN en 30 μL de 1x TE pH 7.4.
3. Agregue "A" a los extremos 3' (30 μL de ADN del paso 2, 2 μL de H₂O, 5 μL de tampón Taq 10x, 10 μL de dATP de 1 mM y 3 μL de ADN polimerasa Taq). Agregue los reactivos a un tubo centrífugo PCR de 0,2 ml, mezcle bien y reaccione en una máquina de PCR a 72 ° C durante 10 min.
4. Realizar la ligadura del enlazador mezclando 10 μL de ADN, 9,9 μL de H₂O, 2,5 μL de tampón de ligasa de ADN T4, 0,1 μL de oligomezcla adaptadora y 2,5 μL de ADN ligasa T4. Agregue los reactivos a un tubo de centrífuga PCR de 0,2 ml y mezcle bien. Incubarlos a 16 °C durante 4 h.
5. Purificar el ADN utilizando un kit de purificación de PCR según protocolo del fabricante. Elute con 20-25 μL de tampón de elución.
6. Antes de establecer la biblioteca de ADN, identifique la concentración del ADN purificado para confirmar su uso para los experimentos de secuenciación posteriores.
7. Detecte la concentración de ADN utilizando un fluorómetro. Después de derretir la muestra en hielo, mezclarla bien y centrifugar durante 30 s a 1000 x g y 4 °C. Luego tome una cantidad adecuada de muestra y mídala en un fluorómetro con una longitud de onda de 260 nm.
8. Coloque muestras de ADN con calidad y concentración calificadas en la plataforma de secuenciación Illumina para secuenciación.
9. Antes de la secuenciación, amplifique el ADN utilizando cebadores de PCR, PE1.0 y PE2.0, y 2x mezcla maestra de alta fidelidad (10.5 μL de ADN, 12.5 μL de 2x mezcla maestra de alta fidelidad, 1 μL de imprimación de PCR PE1.0 y 1 μL de imprimación de PCR PE2.0). Agregue los reactivos a un tubo de centrífuga PCR de 0,2 ml y mezcle bien.
10. Ejecutar la reacción de PCR en la máquina de PCR: predenaturalización de 95 °C durante 2 min; luego 35 ciclos de desnaturalización de 95 °C durante 10 s, recocido a 60 °C durante 15 s, extensión a 72 °C durante 5 s; una extensión final a 72 °C durante 5 min. Finalmente, incubar la reacción a 4 °C.
11. Utilice el ADN para la generación de clústeres y realice la secuenciación por síntesis en un Illumina Hiseq 2000.
    NOTA: En este protocolo, las células de flujo illumina se utilizaron para la generación de clústeres. La secuenciación por síntesis se realizó en un analizador del genoma de Illumina siguiendo las instrucciones del fabricante.

Resultados

Todo el diagrama de flujo del método ChIP-seq se muestra en la Figura 1. Los experimentos ChIP-seq se realizaron utilizando anticuerpos contra H3K4me3 en la cepa de tipo salvaje P131 y tres cepas mutantes nulas que carecían del gen mobre2, mospp1y moswd2 para verificar el perfil completo del genoma completo de la distribución de la histona H3K4me3 en M. oryzae. Los protoplastos de la cepa de tipo salvaje, Δmobre2, Δmospp1y Δmosw...

Discusión

Recientemente, ChIP-seq se ha convertido en un método de análisis genómico ampliamente utilizado para determinar los sitios de unión de TFs o sitios de enriquecimiento modificados por histonas específicas. En comparación con la tecnología ChIP-seq anterior, la nueva tecnología ChIP-seq es altamente sensible y flexible. Los resultados se proporcionan en alta resolución sin efectos negativos, como la señal de ruido causada por la hibridación inespecífico de ácidos nucleicos. Aunque este es un análisis de expr...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
acidic casein hydrolysate	WAKO	65072-00-6	Medium configuration
agar powder	scientan	9002-18-0	Medium configuration
deoxycholic acid	MedChemExpress	83-44-3	protein and dissolution
DNA End-Repair kit	NovoBiotec	ER81050	Repair DNA or cDNA damaged by enzymatic or mechanical shearing
Dynabeads	Invitrogen	no.100.02D	Binding target
EB buffer	JIMEI	JC2174	Membrane and liquid
EDTA	ThermoFisher	AM9912	protease inhibitor
enzymatic casein hydrolysate	Sigma	91079-40-2	Medium configuration
glucose	Sigma	50-99-7	Medium configuration
glycogen	ThermoFisher	AM9510	Precipitant action
H3K4me3 antibodies	Abcam	ab8580	Immune response to H3K4me3 protein
illumina Genome Analyzer	illumina	illumina Hiseq 2000	Large configuration
Illumina PCR primers	illumina	CleanPlex	Random universal primer
isoamyl alcohol	chemical book	30899-19-5	Purified DNA
LiCl	ThermoFisher	AM9480	specific removal RNA
lysing enzymes	Sigma	L1412-10G	cell lysis buffer
Mouse IgG	Yeasen	36111ES10	Animal normal immunoglobulin
NaCl solution	ThermoFisher	7647-14-5	Medium configuration
NaHCO3	Seebio	SH30173.08*	preparation of protein complex eluent
NP-40	ThermoFisher	85124	cell lysate to promote cell lysis
PCR Purification kit	Qiagen	28004	The purification procedure removes primers from DNA samples
protease inhibitors	ThermoFisher	A32965	A protein inhibitor that decreases protein activity
Proteinase K	ThermoFisher	AM2546	DNA Extraction Reagent
Qubit 4.0	ThermoFisher	Q33226	Medium configuration
RIPA buffer	ThermoFisher	9806S	cell lysis buffer
RNase A	ThermoFisher	AM2271	Purified DNA
SDS	ThermoFisher	AM9820	cover up the charge differences
sodium acetate solution	ThermoFisher	R1181	Acetic acid buffer
sodium deoxycholate	ThermoFisher	89904	inhibition of protease degradation
T4 DNA ligase	ThermoFisher	EL0011	Under the condition of ATP as coenzyme, DNA ligase
T4 DNA ligase buffer	ThermoFisher	B69	DNA ligase buffer
Tris-HCl	ThermoFisher	1185-53-1	buffer action
Triton X-100	ThermoFisher	HFH10	keep the membrane protein stable
yeast extract	OXOID	LP0021	Medium configuration