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  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Aquí demostramos un método para aplicar estrés por cizallamiento de fluidos a las células cancerosas en suspensión para modelar los efectos del estrés hemodinámico en las células tumorales circulantes.

Resumen

Durante la metástasis, las células cancerosas de tejidos sólidos, incluidos los epitelios, obtienen acceso a la circulación linfática y hematógena donde están expuestas al estrés mecánico debido al flujo hemodinámico. Una de estas tensiones que experimentan las células tumorales circulantes (CTC) es el estrés por cizallamiento de fluidos (FSS). Si bien las células cancerosas pueden experimentar niveles bajos de FSS dentro del tumor debido al flujo intersticial, las CTC están expuestas, sin unión a la matriz extracelular, a niveles mucho mayores de FSS. Fisiológicamente, el FSS oscila entre 3 y 4 órdenes de magnitud, con niveles bajos presentes en los linfáticos (<1 gineco/cm2 ) y los niveles más altos se presentan brevemente a medida que las células pasan a través del corazón y alrededor de las válvulas cardíacas (>500 dinas/cm2). Hay algunos modelos in vitro diseñados para modelar diferentes rangos de tensión de cizallado fisiológico en varios marcos de tiempo. Este artículo describe un modelo para investigar las consecuencias de pulsos breves (milisegundos) de FSS de alto nivel en la biología de las células cancerosas utilizando un sistema simple de jeringas y agujas.

Introducción

La metástasis, o la diseminación del cáncer más allá del sitio inicial del tumor, es un factor importante que subyace a la mortalidad por cáncer1. Durante la metástasis, las células cancerosas utilizan el sistema circulatorio como una autopista para diseminarse a sitios distantes en todo el cuerpo2,3. Mientras se dirige a estos sitios, las células tumorales circulantes (CTC) existen dentro de un microambiente fluido dinámico a diferencia del de su tumor primario original3,4,5. Se ha propuesto que este microambiente fluido es una de las muchas barreras para la metástasis4. Existe un amplio acuerdo en el concepto de ineficiencia metastásica, es decir, que la mayoría de los CTC que entran en circulación perecen o no forman colonias metastásicas productivas6,7,8. Sin embargo, por qué la metástasis es ineficiente desde la perspectiva de un CTC individual es menos seguro y sigue siendo un área activa de investigación. Las CTC están separadas de la matriz extracelular, privadas de factores solubles de crecimiento y supervivencia que pueden estar presentes en el tumor primario, y expuestas al sistema inmune y a las fuerzas hemodinámicas de una manera muy diferente a la del tumor primario4. Cada uno de estos factores puede contribuir a la escasa supervivencia de los CTC, pero sus contribuciones relativas no están claras. Este artículo aborda la cuestión de cómo las fuerzas hemodinámicas afectan a las CTC.

Estudiar los efectos de las fuerzas hemodinámicas en los CTC es bastante desafiante. Actualmente, no existen sistemas in vitro diseñados que puedan replicar toda la dinámica espaciotemporal (corazón a capilares) y las propiedades reológicas del sistema vascular humano. Además, la forma en que los CTC experimentan el sistema circulatorio no está del todo clara. La evidencia experimental indica que la mayoría de las células cancerosas no circulan continuamente como las células sanguíneas. Más bien, debido a su tamaño relativamente grande (10-20 μm de diámetro), la mayoría de los CTC quedan atrapados en lechos capilares (6-8 μm de diámetro) durante períodos variables de tiempo (s a días) donde pueden morir, extravasar o ser desplazados al siguiente lecho capilar8,9,10,11. Sin embargo, hay algunas pruebas de que el tamaño de la CTC puede ser más heterogéneo in vivo, y que las CTC más pequeñas son detectables12. Por lo tanto, en función de la distancia y la velocidad del flujo sanguíneo, los CTC solo pueden circular libremente durante cuestión de segundos entre estos períodos de atrapamiento, aunque falta una descripción cuantitativa de este comportamiento13.

Además, dependiendo de dónde entren en circulación los CTC, pueden pasar a través de múltiples lechos capilares en el pulmón y otros sitios periféricos y a través del corazón derecho e izquierdo antes de llegar a su destino final. En el camino, los CTC están expuestos a diversas tensiones hemodinámicas, incluida la tensión de cizallamiento de fluidos (FSS), las fuerzas de compresión durante su atrapamiento en la microcirculación y, potencialmente, las fuerzas de tracción en circunstancias en las que podrían exhibir un rodar similar a un leucocitos a lo largo de las paredes de los vasos sanguíneos14. Por lo tanto, tanto la capacidad de modelar la circulación como la comprensión del comportamiento de CTC a modelar es limitada. Debido a esta incertidumbre, cualquier hallazgo de los sistemas modelo in vitro debe validarse en un organismo vertebrado experimental y, en última instancia, en pacientes con cáncer.

Con las advertencias antes mencionadas, este trabajo demuestra un modelo relativamente simple para aplicar FSS a células en suspensión para sondear los efectos de FSS en CTC descritos por primera vez en 201215. FSS resulta de la fricción del flujo sanguíneo contra la pared del vaso, lo que produce un gradiente de velocidad parabólica en condiciones de flujo laminar en vasos más grandes. Las células experimentan niveles más altos de FSS cerca de las paredes de los vasos y niveles más bajos cerca del centro del vaso sanguíneo. La viscosidad del fluido, el caudal y las dimensiones del conducto a través del cual se produce el flujo influyen en el FSS, como se describe en la ecuación de Hagen-Poiseuille. Esto se aplica a los flujos sanguíneos que se comportan como fluidos newtonianos, pero no se mantienen para la microcirculación. El FSS fisiológico varía en varios órdenes de magnitud con los niveles más bajos en los linfáticos (<1 dyn/cm2) y los más altos en las regiones alrededor de las válvulas cardíacas y las placas ateroscleróticas (>500 dyn/cm2)5. El esfuerzo cizallamiento medio de la pared en las arterias es de 10-70 dinas/cm2 y de 1-6 dinares/cm2 en las venas16,17.

En el corazón, las células pueden estar expuestas a flujos turbulentos alrededor de las valvas de las válvulas donde se puede experimentar FSS de muy alto nivel, pero de muy corta duración18,19. Aunque el campo del bioprocesamiento ha estudiado durante mucho tiempo los efectos de FSS en células de mamíferos en suspensión, esta información puede ser de valor limitado para comprender los efectos de FSS en CTC, ya que generalmente se centra en niveles mucho más bajos de FSS aplicados durante una larga duración20. Como se describe a continuación, usando una jeringa y una aguja, se puede aplicar FSS relativamente alto (decenas a miles de dinas / cm2)durante una duración relativamente corta (milisegundos) a una suspensión celular. Desde la descripción inicial de este modelo15,otros lo han empleado para estudiar los efectos del FSS sobre las células cancerosas21,22,23. Se pueden aplicar múltiples "pulsos" de FSS a las suspensiones celulares en un corto período de tiempo para facilitar los análisis experimentales posteriores. Por ejemplo, este modelo se puede utilizar para medir la capacidad de las células para resistir la destrucción mecánica por FSS midiendo la viabilidad celular en función del número de pulsos aplicados. Alternativamente, los efectos de la exposición a FSS en la biología de las células cancerosas se pueden explorar mediante la recolección de células para una variedad de análisis posteriores. Es importante destacar que parte de la suspensión celular se reserva como un control estático para comparar los efectos de FSS de aquellos que podrían estar asociados con el desprendimiento celular y el tiempo mantenido en suspensión.

Protocolo

1. Preparación celular

  1. Libere las células de la placa de cultivo de tejidos cuando el 70-90% confluyen siguiendo las pautas recomendadas para la línea celular en uso.
    1. Por ejemplo, aspire el medio de crecimiento para las células PC-3 y lave el plato de 10 cm de las células con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato libre de calcio y magnesio (PBS).
    2. Aspire el PBS antes de agregar 1 ml de tripsina al 0,25% utilizando el protocolo del fabricante.
    3. Después de observar el desprendimiento de las células bajo un microscopio invertido, agregue 5 ml de medio DMEM: F12 que contenga un 10% de suero bovino fetal para inhibir la tripsina.
  2. Coloque la suspensión celular en un tubo cónico.
  3. Determinar la concentración celular y el número total de células.
  4. Las células de pellets por centrifugación (300 × g durante 3 min), aspiran el sobrenadante y resuspend las células en medio de cultivo de tejido libre de suero a 5 × 105 células/ml.
    NOTA: Es fundamental que el medio de ensayo contenga al menos 1,17 mM de Ca++ ya que se ha demostrado que el Ca++ extracelular es necesario para la resistencia celular a FSS15.

2. Exposición al estrés por cizallado de fluidos

  1. Antes de exponer las células a FSS, corte un tubo de poliestireno de 14 ml de fondo redondo en la línea de 7 ml. Mezcle la suspensión celular, coloque 5 ml de la suspensión en el tubo de corte y recoja muestras de control estáticas.
    NOTA: El volumen necesario a recoger para la muestra estática depende del ensayo de viabilidad utilizado (consulte el paso 3).
  2. Extraiga la suspensión celular en una jeringa de 5 ml y coloque una aguja de 30 G 1/2". Desencuelte la aguja, coloque la jeringa en una bomba de jeringa, asegure la jeringa y establezca el caudal para alcanzar el nivel deseado de FSS.
    NOTA: La Tabla 1 muestra la tensión máxima de cizallamiento de la pared para diferentes agujas y caudales, así como el nivel mínimo de FSS dependiendo del tamaño de la celda (10, 15 y 20 μm). Inspeccione la aguja antes de usarla para asegurarse de que no esté doblada; si no está seguro, reemplace la aguja por una nueva. La integridad de la aguja puede tener un impacto significativo en el nivel de FSS aplicado.
  3. Haga funcionar la bomba de la jeringa y recoja la muestra cortada en el tubo de corte en un ángulo aproximado de 45 ° para reducir la formación de espuma. Recolectar una muestra dependiendo del tipo de ensayo de viabilidad o de las necesidades del ensayo aguas abajo.
    1. Retire cuidadosamente la jeringa y la aguja de la bomba de la jeringa y use alicates para extraer la aguja de la jeringa, teniendo cuidado de no tocar la aguja.
      NOTA: Las agujas no biseladas se pueden usar indistintamente con agujas biseladas como medida de seguridad adicional.
  4. Vuelva a colocar la suspensión cizallada en la jeringa, vuelva a colocar cuidadosamente la aguja con alicates y vuelva a colocarla en la bomba de la jeringa.
  5. Repita los pasos 2.3 y 2.4 hasta que la suspensión celular haya sido expuesta al número deseado de pulsos de FSS.
    NOTA: Para evaluar la capacidad de las células para resistir la destrucción mecánica de la exposición a FSS, la suspensión celular generalmente se somete a 10 pulsos de FSS. Sin embargo, se ha demostrado que las células comienzan a sufrir adaptaciones biológicas en respuesta a FSS después de 2 pulsos24.

3. Medición de la viabilidad

NOTA: La viabilidad se puede evaluar mediante ensayos enzimáticos (luciferasa, resazolina y WST-1), contando células intactas, citometría de flujo o mediante ensayos clonogénicos.

  1. Para todas las medidas de viabilidad, recoja una muestra antes de exponer las células a FSS.
    1. Para ensayos enzimáticos, tome alícuotas duplicadas de 100 μL y colóquelas en una placa de 96 pozos.
    2. Para la citometría de flujo, tome una alícuota de 500 μL y colóquela en un tubo de 1,5 ml.
    3. Para el ensayo clonogénico, recolectar una alícuota de 100 μL.
  2. Ensayo enzimático
    1. Recolecte muestras de 100 μL después de 1, 2, 4, 6, 8 y 10 pulsos de exposición a FSS y colóquelas en una placa de 96 pozos.
    2. Agregue el sustrato deseado y siga el protocolo para el ensayo utilizado:
      1. Para la resazolina, agregue 20 μL de una solución de 0,15 mg/ml a cada pozo. Añadir 20 μL de solución de resazurina de 0,15 mg/ml a los pozos que contengan 100 μL de medio solo. Incubar durante 2 h en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C. Mida la absorbancia utilizando un lector de placas capaz de leer la fluorescencia (579 excitación / emisión 584).
      2. Para las células que expresan luciferasa, agregue 100 μL de 15 mg/ml de D-luciferina a 5 ml de medio. Agregue 100 μL de esa solución a cada pozo que contenga células. Espere 5 minutos y luego lea la placa con un lector compatible con luminiscencia.
      3. Para WST-1, agregue 10 μL de WST-1 a cada pozo, incluidos los pozos que contengan solo medio. Incubar durante 4 h, y luego leer la absorbancia entre 420 y 480 nm utilizando un lector de placas.
    3. Compare la señal promediada de cada una de las muestras expuestas a FSS con la muestra de control estática promediada para obtener el porcentaje de células viables.
  3. Citometría de flujo24
    1. Recolecte muestras de 500 μL y colóquelas en tubos centrífugos de 1,5 ml después de 1, 2, 5 y 10 pulsos de FSS.
    2. Centrifugar muestras (500 × g durante 3 min), y desechar los sobrenadantes.
    3. Resuspónda los gránulos con 1 ml de PBS libre de calcio y magnesio, y centrífuga las muestras (300 × g durante 3 min).
    4. Suspender los gránulos con 500 μL de tampón de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS) (PBS con albúmina sérica bovina al 0,5% y azida de sodio al 0,1%) con perlas de conteo y colorantes impermeables a la membrana o de viabilidad como yoduro de propidio (1,75 μg/ml).
    5. Determinar la viabilidad comparando la relación de células viables, normalizadas a cuentas de conteo, en muestras esquiladas con la de la muestra estática.
  4. Ensayo clonogénico
    1. Tome 100 μL de la muestra estática y agregue 900 μL de medio de crecimiento para hacer una dilución de 1:10.
    2. Tome 100 μL de la muestra diluida 1:10 y agregue 900 μL de medio de crecimiento para hacer una dilución final de 1:100.
    3. Agregue 100 μL de la muestra de dilución 1:100 en cada uno de los 3 pozos de un plato de 6 pozos que contenga 2 ml de medio de crecimiento.
    4. Repita los pasos 3.4.1-3.4.3 con muestras que hayan sido sometidas a 10 pulsos de FSS.
    5. Deje que las células crezcan durante 7-10 días sin cambiar el medio, y verifique la formación de colonias. Una vez que se hayan formado colonias de células ≥50, aspire el medio de crecimiento, enjuague cada pozo con 1 ml de PBS, aspire el PBS y fije durante 5 minutos con 1 ml de etanol helado al 70% (EtOH). Es importante destacar que arregle las muestras cizalladas y estáticas al mismo tiempo.
    6. Después de fijar las muestras, aspire el EtOH y agregue de 1 a 2 ml de solución violeta cristalina (0.1% de violeta de cristal en 90% H2O, 10% de EtOH) durante 5 min.
    7. Enjuague con un exceso de agua y deje que el plato se seque
    8. Cuente las colonias (grupos de ≥50 células) tanto para las muestras estáticas como para las esquiladas. Compare la relación entre el número promedio de colonias de la muestra esquilada y el número promedio de colonias de la muestra estática para determinar la viabilidad.

Resultados

Se ha demostrado previamente que la resistencia elevada a la destrucción mecánica inducida por FSS es un fenotipo conservado a través de múltiples líneas celulares de cáncer y células cancerosas recién aisladas de tumores en relación con los comparadores de células epiteliales no transformadas15,24. Aquí, se probaron líneas celulares de cáncer adicionales de una variedad de orígenes tisulares(Tabla 2)para demostrar que la mayoría d...

Discusión

Este artículo demuestra la aplicación de FSS a las células cancerosas en suspensión utilizando una jeringa y una aguja. Usando este modelo, se ha demostrado que las células cancerosas son más resistentes a pulsos breves de FSS de alto nivel en relación con las células epiteliales no transformadas15,22,24. Además, la exposición a FSS utilizando este modelo resulta en un rápido aumento de la rigidez celular, la activaci...

Divulgaciones

MDH es cofundador, presidente y accionista de SynderBio, Inc. DLM es consultor de SynderBio, Inc.

Agradecimientos

El desarrollo del modelo demostrado aquí fue apoyado por la subvención del DOD W81XWH-12-1-0163, las subvenciones de los NIH R21 CA179981 y R21 CA196202, y el Fondo de Investigación de Metástasis Sato.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% TrypsinGibco25200-056
14 mL round bottom tubesFalcon - Corning352059
30 G 1/2" NeedleBD305106
5 mL syringeBD309646
96-well black bottom plateCostar - Corning3915
Bioluminescence detectorAMIAMI HTX
BSA, Fraction VSigma10735086001
Cell Titer BluePromegaG8081
crystal violetSigmaC0775
D-luciferinGoldBioD-LUCK
DMEMGibco11965-092
FBSAtlanta BiologicalsS11150
PBSGibco10010023
Plate ReaderBioTekSynergy HT
Sodium Azide (NaN3)SigmaS2002
Syringe PumpHarvard Apparatus70-3005

Referencias

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