Modélisation des effets du stress hémodynamique sur les cellules tumorales circulantes à l’aide d’une seringue et d’une aiguille

Résumé

Ici, nous démontrons une méthode pour appliquer la contrainte de cisaillement des fluides aux cellules cancéreuses en suspension pour modéliser les effets du stress hémodynamique sur les cellules tumorales circulantes.

Résumé

Au cours des métastases, les cellules cancéreuses des tissus solides, y compris les épithéliums, accèdent à la circulation lymphatique et hématogène où elles sont exposées à un stress mécanique dû au flux hémodynamique. L’un de ces stress que subissent les cellules tumorales circulantes (CCC) est le stress de cisaillement des fluides (FSS). Alors que les cellules cancéreuses peuvent présenter de faibles niveaux de FSS dans la tumeur en raison du flux interstitiel, les CTC sont exposés, sans attachement à la matrice extracellulaire, à des niveaux beaucoup plus élevés de FSS. Physiologiquement, le FSS varie sur 3-4 ordres de grandeur, avec de faibles niveaux présents dans les lymphatiques (<1 dyne/cm²) et les niveaux les plus élevés présents brièvement lorsque les cellules traversent le cœur et autour des valves cardiaques (>500 dynes/cm²). Il existe quelques modèles in vitro conçus pour modéliser différentes gammes de contraintes physiologiques de cisaillement sur différentes périodes. Cet article décrit un modèle pour étudier les conséquences de brèves impulsions (millisecondes) de FSS de haut niveau sur la biologie des cellules cancéreuses à l’aide d’un simple système de seringue et d’aiguille.

Introduction

Les métastases, ou la propagation du cancer au-delà du site tumoral initial, sont un facteur majeur sous-jacent à la mortalité par cancer¹. Au cours des métastases, les cellules cancéreuses utilisent le système circulatoire comme une autoroute pour se dissémer vers des sites éloignés dans tout le corps^2,3. En route vers ces sites, les cellules tumorales circulantes (CCC) existent au sein d’un microenvironnement fluide dynamique contrairement à celui de leur tumeur primaire d’origine^3,4,5. Il a été proposé que ce microenvironnement fluide soit l’un des nombreux obstacles aux métastases^4. Il existe un large consensus dans le concept d’inefficacité métastatique, c’est-à-dire que la plupart des CTCC entrant dans la circulation périssent ou ne forment pas de colonies métastatiques productives^6,7,8. Cependant, la raison pour laquelle les métastases sont inefficaces du point de vue d’un CCT individuel est moins certaine et demeure un domaine d’investigation actif. Les CTCC sont détachés de la matrice extracellulaire, privés de facteurs solubles de croissance et de survie qui peuvent être présents dans la tumeur primaire, et exposés au système immunitaire et aux forces hémodynamiques d’une manière très différente de celle de la tumeur primaire⁴. Chacun de ces facteurs peut contribuer à la faible survie des CTCC, mais leurs contributions relatives ne sont pas claires. Cet article aborde la question de savoir comment les forces hémodynamiques affectent les CTCC.

L’étude des effets des forces hémodynamiques sur les CTCC est assez difficile. Actuellement, il n’existe aucun système in vitro conçu capable de reproduire l’ensemble de la dynamique spatio-temporelle (du cœur aux capillaires) et des propriétés rhéologiques du système vasculaire humain. De plus, la façon dont les CTCC vivent le système circulatoire n’est pas tout à fait claire. Les preuves expérimentales indiquent que la plupart des cellules cancéreuses ne circulent pas continuellement comme les cellules sanguines. Au contraire, en raison de leur taille relativement grande (10-20 μm de diamètre), la plupart des CCC sont piégés dans des lits capillaires (6-8 μm de diamètre) pendant des durées variables (s à jours) où ils peuvent mourir, extravaser ou être déplacés vers le lit capillaire suivant^8,9,10,11. Cependant, il existe des preuves que la taille du CTC peut être plus hétérogène in vivo et que les CTC plus petits sont détectables¹². Par conséquent, sur la base de la distance et de la vitesse du flux sanguin, les CTCC ne peuvent circuler librement que pendant quelques secondes entre ces périodes de piégeage, bien qu’il manque une description quantitative de ce comportement¹³.

De plus, selon l’endroit où les CCC pénètrent dans la circulation, ils peuvent traverser plusieurs lits capillaires dans le poumon et d’autres sites périphériques et à travers le cœur droit et gauche avant d’atteindre leur destination finale. En cours de route, les CTCC sont exposés à diverses contraintes hémodynamiques, y compris la contrainte de cisaillement des fluides (FSS), les forces de compression lors de leur piégeage dans la microcirculation et, potentiellement, les forces de traction dans des circonstances où ils pourraient présenter un roulement semblable à celui d’un leucocyte le long des parois des vaisseaux sanguins¹⁴. Ainsi, la capacité de modéliser la circulation et la compréhension du comportement CTC à modéliser sont limitées. En raison de cette incertitude, tout résultat de systèmes modèles in vitro doit être validé dans un organisme vertébré expérimental et, en fin de compte, chez des patients atteints de cancer.

Avec les mises en garde susmentionnées, cet article démontre un modèle relativement simple pour appliquer le FSS aux cellules en suspension afin de sonder les effets du FSS sur les CTC décrits pour la première fois en 2012¹⁵. FSS résulte du frottement du flux sanguin contre la paroi des vaisseaux, ce qui produit un gradient de vitesse parabolique dans des conditions d’écoulement laminaire dans les plus gros vaisseaux. Les cellules éprouvent des niveaux plus élevés de FSS près des parois des vaisseaux et des niveaux plus bas près du centre du vaisseau sanguin. La viscosité du fluide, le débit et les dimensions du conduit à travers lequel l’écoulement se produit influencent FSS, comme décrit par l’équation de Hagen-Poiseuille. Cela s’applique aux flux sanguins se comportant comme des fluides newtoniens, mais ne tient pas pour la microcirculation. Le FSS physiologique varie sur plusieurs ordres de grandeur avec les niveaux les plus bas dans les lymphatiques (<1 dyn/cm 2 ) et les plus élevés dans les régions^autourdes valves cardiaques et des plaques d’athérosclérose (>500 dyn/cm²⁾⁵. Le stress moyen de cisaillement de la paroi dans les artères est de 10-70 dyn/cm² et de 1-6 dyn/cm2 dans les veines^16,17.

Dans le cœur, les cellules peuvent être exposées à des écoulements turbulents autour des folioles valvulaires où un niveau très élevé, mais de très courte durée FSS peut être expérimenté^18,19. Bien que le domaine du biotraitement ait longtemps étudié les effets du FSS sur les cellules de mammifères en suspension, cette information peut être d’une valeur limitée pour comprendre les effets du FSS sur les CTCC car elle se concentre généralement sur des niveaux beaucoup plus faibles de FSS appliqués sur une longue durée²⁰. Comme décrit ci-dessous, à l’aide d’une seringue et d’une aiguille, on peut appliquer un FSS relativement élevé (des dizaines à des milliers de^dyn/cm2)pendant une durée relativement courte (millisecondes) sur une suspension cellulaire. Depuis la description initiale de ce modèle^15,d’autres l’ont utilisé pour étudier les effets du FSS sur les cellules cancéreuses^21,22,23. De multiples « impulsions » de FSS peuvent être appliquées à des suspensions cellulaires en peu de temps pour faciliter les analyses expérimentales en aval. Par exemple, ce modèle peut être utilisé pour mesurer la capacité des cellules à résister à la destruction mécanique par FSS en mesurant la viabilité des cellules en fonction du nombre d’impulsions appliquées. Alternativement, les effets de l’exposition au FSS sur la biologie des cellules cancéreuses peuvent être explorés en collectant des cellules pour une variété d’analyses en aval. Il est important de savoir qu’une partie de la suspension cellulaire est réservée en tant que contrôle statique pour comparer les effets du FSS de ceux qui pourraient être associés au détachement cellulaire et au temps passé en suspension.

Protocole

1. Préparation des cellules

1. Libérez les cellules de la boîte de culture tissulaire lorsqu’elles sont confluentes à 70 à 90 % en suivant les directives recommandées pour la lignée cellulaire utilisée.
   1. Par exemple, aspirez le milieu de croissance des cellules PC-3 et lavez le plat de 10 cm de cellules avec 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans calcium et magnésium.
   2. Aspirer le PBS avant d’ajouter 1 mL de trypsine à 0,25 % en utilisant le protocole du fabricant.
   3. Après avoir observé le détachement des cellules au microscope inversé, ajouter 5 mL de milieu DMEM:F12 contenant 10% de sérum bovin fœtal pour inhiber la trypsine.
2. Placez la suspension cellulaire dans un tube conique.
3. Déterminez la concentration et le nombre total de cellules.
4. Les cellules granulées par centrifugation (300 × g pendant 3 min), aspirent le surnageant et ressuspendent les cellules dans un milieu de culture tissulaire sans sérum jusqu’à 5 × 10⁵ cellules/mL.
   REMARQUE: Il est essentiel que le milieu d’essai contienne au moins 1,17 mM de Ca^++, car il a été démontré que le Ca⁺⁺ extracellulaire est nécessaire pour la résistance cellulaire à FSS¹⁵.

2. Exposition aux contraintes de cisaillement des fluides

1. Avant d’exposer les cellules au FSS, coupez un tube de polystyrène à fond rond de 14 mL à la ligne de 7 mL. Mélanger la suspension cellulaire, placer 5 mL de la suspension dans le tube coupé et prélever des échantillons de contrôle statique.
   REMARQUE : Le volume nécessaire au prélèvement de l’échantillon statique dépend du test de viabilité utilisé (voir l’étape 3).
2. Aspirez la suspension cellulaire dans une seringue de 5 mL et fixez une aiguille de 30 G 1/2 po. Décapsulez l’aiguille, placez la seringue sur une pompe à seringue, fixez la seringue et réglez le débit pour atteindre le niveau souhaité de FSS.
   REMARQUE : Le tableau 1 indique la contrainte maximale de cisaillement de la paroi pour différentes aiguilles et débits, ainsi que le niveau minimum de FSS en fonction de la taille de la cellule (10, 15 et 20 μm). Inspecter l’aiguille avant de l’utiliser pour s’assurer qu’elle n’est pas pliée; en cas d’incertitude, remplacez l’aiguille par une nouvelle. L’intégrité de l’aiguille peut avoir un impact significatif sur le niveau de FSS appliqué.
3. Faites fonctionner la pompe à seringue et prélever l’échantillon cisaillé dans le tube coupé à un angle d’environ 45 ° pour réduire la mousse. Prélever un échantillon en fonction du type d’essai de viabilité ou des besoins en aval.
   1. Retirez soigneusement la seringue et l’aiguille de la pompe à seringue et utilisez une pince pour retirer l’aiguille de la seringue, en prenant soin de ne pas toucher l’aiguille.
      REMARQUE: Les aiguilles non biseautées peuvent être utilisées de manière interchangeable avec les aiguilles biseautées comme mesure de sécurité supplémentaire.
4. Retirez la suspension cisaillée dans la seringue, refixez soigneusement l’aiguille à l’aide d’une pince et replacez-la dans la pompe à seringue.
5. Répétez les étapes 2.3 et 2.4 jusqu’à ce que la suspension cellulaire ait été exposée au nombre souhaité d’impulsions de FSS.
   REMARQUE: Pour évaluer la capacité des cellules à résister à la destruction mécanique de l’exposition au FSS, la suspension cellulaire est généralement soumise à 10 impulsions de FSS. Cependant, il a été démontré que les cellules commencent à subir des adaptations biologiques en réponse au FSS après 2 impulsions^24.

3. Mesure de la viabilité

REMARQUE: La viabilité peut être évaluée à l’aide de tests enzymatiques (luciférase, résazurine et WST-1), en comptant les cellules intactes, en cytométrie en flux ou par des tests clonogènes.

1. Pour toutes les mesures de viabilité, prélever un échantillon avant d’exposer les cellules au FSS.
   1. Pour les essais enzymatiques, prenez des aliquotes de 100 μL en double et placez-les dans une plaque de 96 puits.
   2. Pour la cytométrie en flux, prenez une aliquote de 500 μL et placez-la dans un tube de 1,5 mL.
   3. Pour le dosage clonogène, prélever une aliquote de 100 μL.
2. Essai enzymatique
   1. Prélever des échantillons de 100 μL après 1, 2, 4, 6, 8 et 10 impulsions d’exposition au FSS et les placer dans une plaque de 96 puits.
   2. Ajoutez le substrat souhaité et suivez le protocole pour le test utilisé:
      1. Pour la résazurine, ajouter 20 μL d’une solution de 0,15 mg/mL à chaque puits. Ajouter 20 μL de solution de résazurine à 0,15 mg/mL aux puits contenant 100 μL de milieu seul. Incuber pendant 2 h dans un incubateur de culture tissulaire à 37 °C. Mesurer l’absorbance à l’aide d’un lecteur de plaques capable de lire la fluorescence (579 excitation/ 584 émission).
      2. Pour les cellules exprimant la luciférase, ajouter 100 μL de 15 mg/mL de D-luciférine à 5 mL de milieu. Ajouter 100 μL de cette solution à chaque puits contenant des cellules. Attendez 5 min, puis lisez la plaque à l’aide d’un lecteur compatible avec la luminescence.
      3. Pour WST-1, ajouter 10 μL de WST-1 à chaque puits, y compris les puits contenant uniquement du milieu. Incuber pendant 4 h, puis lire l’absorbance entre 420 et 480 nm à l’aide d’un lecteur de plaques.
   3. Comparez le signal moyenné de chacun des échantillons exposés au FSS à l’échantillon de contrôle statique moyenné pour obtenir le pourcentage de cellules viables.
3. Cytométrie en flux²⁴
   1. Prélever des échantillons de 500 μL et les placer dans des tubes centrifuges de 1,5 mL après 1, 2, 5 et 10 impulsions de FSS.
   2. Centrifuger les échantillons (500 × g pendant 3 min) et jeter les surnageants.
   3. Resuspendez les granulés avec 1 mL de PBS sans calcium et magnésium et centrifugez les échantillons (300 × g pendant 3 min).
   4. Suspendre les granulés avec 500 μL de tampon de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) (PBS avec 0,5% d’albumine sérique bovine et 0,1% d’azide de sodium) avec des billes de comptage et des colorants imperméables à la membrane ou viables tels que l’iodure de propidium (1,75 μg / mL).
   5. Déterminer la viabilité en comparant le rapport entre les cellules viables, normalisées pour compter les billes, dans les échantillons cisaillés et celui de l’échantillon statique.
4. Essai clonogénique
   1. Prendre 100 μL de l’échantillon statique et ajouter 900 μL de milieu de croissance pour faire une dilution de 1:10.
   2. Prendre 100 μL de l’échantillon dilué 1:10 et ajouter 900 μL de milieu de croissance pour faire une dilution finale de 1:100.
   3. Ajouter 100 μL de l’échantillon de dilution 1:100 dans chacun des 3 puits d’une boîte de 6 puits contenant 2 mL de milieu de croissance.
   4. Répétez les étapes 3.4.1 à 3.4.3 avec des échantillons qui ont été soumis à 10 impulsions de FSS.
   5. Laissez les cellules se développer pendant 7 à 10 jours sans changer le milieu et vérifiez la formation de colonies. Une fois que des colonies de cellules ≥50 se sont formées, aspirez le milieu de croissance, rincez chaque puits avec 1 mL de PBS, aspirez le PBS et fixez pendant 5 minutes à l’aide de 1 mL d’éthanol glacé à 70% (EtOH). Il est important de fixer les échantillons cisaillés et statiques en même temps.
   6. Après avoir fixé les échantillons, aspirer l’EtOH et ajouter 1 à 2 mL de solution de violet cristallin (0,1% de violet cristallin dans 90% H₂O, 10% EtOH) pendant 5 min.
   7. Rincer avec un excès d’eau et laisser sécher la plaque
   8. Comptez les colonies (grappes de ≥50 cellules) pour les échantillons statiques et cisaillés. Comparez le rapport entre le nombre moyen de colonies de l’échantillon cisaillé et le nombre moyen de colonies de l’échantillon statique pour déterminer la viabilité.

Résultats

Une résistance élevée à la destruction mécanique induite par le FSS s’est déjà avérée être un phénotype conservé dans plusieurs lignées cellulaires cancéreuses et cellules cancéreuses fraîchement isolées de tumeurs par rapport aux comparateurs de cellules épithéliales non transformées^15,24. Ici, d’autres lignées cellulaires cancéreuses provenant de diverses origines tissulaires(tableau 2)ont été testées pour démontre...

Discussion

Cet article démontre l’application du FSS aux cellules cancéreuses en suspension à l’aide d’une seringue et d’une aiguille. En utilisant ce modèle, il a été démontré que les cellules cancéreuses sont plus résistantes aux brèves impulsions de FSS de haut niveau par rapport aux cellules épithéliales non transformées^15,22,24. De plus, l’exposition au FSS à l’aide de ce modèle entraîne une augmentation r...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin	Gibco	25200-056
14 mL round bottom tubes	Falcon - Corning	352059
30 G 1/2" Needle	BD	305106
5 mL syringe	BD	309646
96-well black bottom plate	Costar - Corning	3915
Bioluminescence detector	AMI	AMI HTX
BSA, Fraction V	Sigma	10735086001
Cell Titer Blue	Promega	G8081
crystal violet	Sigma	C0775
D-luciferin	GoldBio	D-LUCK
DMEM	Gibco	11965-092
FBS	Atlanta Biologicals	S11150
PBS	Gibco	10010023
Plate Reader	BioTek	Synergy HT
Sodium Azide (NaN3)	Sigma	S2002
Syringe Pump	Harvard Apparatus	70-3005