Un Protocolo Para Roux-en-Y Bypass Gástrico En Ratas Usando Grapadoras Lineales

Resumen

El bypass gástrico Roux-en-Y (RYGB) se realiza para tratar la obesidad y la diabetes. Sin embargo, los mecanismos que subyacen a la eficacia de RYGB no se entienden completamente, y los estudios están limitados por la dificultad técnica que conduce a una alta mortalidad en modelos animales. Este artículo proporciona instrucciones sobre cómo realizar RYGB en ratas con altas tasas de éxito.

Resumen

El bypass gástrico Roux-en-Y (RYGB) se realiza comúnmente para el tratamiento de la obesidad severa y la diabetes tipo 2. Sin embargo, el mecanismo de pérdida de peso y los cambios metabólicos no se entienden bien. Se cree que múltiples factores desempeñan un papel, incluida la reducción de la ingesta calórica, la disminución de la absorción de nutrientes, el aumento de la saciedad, la liberación de hormonas promotoras de la saciedad, los cambios en el metabolismo de los ácidos biliares y las alteraciones en la microbiota intestinal.

El modelo RYGB de rata presenta un marco ideal para estudiar estos mecanismos. Los trabajos previos en modelos de ratón han tenido altas tasas de mortalidad, que oscilan entre el 17 y el 52%, lo que limita su adopción. Los modelos de ratas demuestran una reserva fisiológica al estímulo quirúrgico y son técnicamente más fáciles de adoptar, ya que permiten el uso de grapadoras quirúrgicas. Un desafío con las grapadoras quirúrgicas, sin embargo, es que dejan a menudo una bolsa gástrica grande que no sea representativa de RYGB en seres humanos.

En este protocolo, presentamos un protocolo de RYGB en las ratas que dan lugar a una pequeña bolsa gástrica usando grapadoras quirúrgicas. Utilizando dos fuegos de grapadora que quitan el forestomach de la rata, obtenemos una bolsa gástrica más pequeña similar a ésa que sigue un RYGB humano típico. El grapado quirúrgico también da lugar a una mejor hemostasia que la división aguda. Además, el forestomach de la rata no contiene ninguna glándula y su retiro no debe alterar la fisiología de RYGB.

La pérdida de peso y los cambios metabólicos en la cohorte de RYGB fueron significativos en comparación con la cohorte simulada, con una tolerancia a la glucosa significativamente menor a las 14 semanas. Además, este protocolo tiene una excelente supervivencia del 88,9% después de RYGB. Las habilidades descritas en este protocolo se pueden adquirir sin experiencia microquirúrgica previa. Una vez dominado, este procedimiento proporcionará una herramienta reproducible para el estudio de los mecanismos y efectos de RYGB.

Introducción

La obesidad y la diabetes tipo 2 se han convertido en epidemias^{mundiales 1}. Aunque la pérdida de peso médica puede mejorar la diabetes en los pacientes, aquellos con diabetes grave se benefician más de la cirugía bariátrica. La cirugía bariátrica ha demostrado ser segura y eficaz para bajar de peso y mejorar o curar la diabetes tipo^{2 2,3,}incluso en aquellos con enfermedad de larga data^4. Los procedimientos bariátricos metabólicos, como la actual cirugía de bypass gástrico estándar de Roux-en-Y (RYGB), inducen mejoras rápidas y sostenidas en la homeostasis de la glucosa al tiempo que reducen la necesidad de medicamentos para la diabetes^5,6,7.

Después de RYGB, la mejora de la homeostasis de la glucosa ocurre rápidamente y es independiente de la pérdida de peso⁸. Dos teorías importantes se han propuesto para explicar los cambios metabólicos asociados a la remisión de la diabetes que ocurren después de cirugía metabólica. Primero, la hipótesis del hindgut postula que, después de puente, concentraciones más altas de alimentos undigested alcanzan el intestino distal que aumenta el lanzamiento de hormonas tales como GLP-1. Por otra parte, la hipótesis del foregut sugiere que pasar por alto el intestino próximo reduce la secreción de hormonas antiincretinas. Ambos efectos podrían conducir a una mejora temprana del metabolismo de la glucosa⁹.

Los modelos animales tienen el potencial de ser una herramienta poderosa para estudiar estos mecanismos. Sin embargo, una barrera importante en la utilización de modelos de ratón o rata es la dificultad técnica en la realización de estos procedimientos. La mayoría de los estudios se han basado en modelos de ratón o rata^10,11,12. Los modelos de ratón han sido difíciles ya que el estómago del ratón es demasiado pequeño para utilizar dispositivos grapadores^11,y las tasas de mortalidad son inaceptablemente altas, oscilando entre el 17 y el 52%^13. En ratas, algunos protocolos siguen siendo técnicamente difíciles de realizar debido a la compleja ligadura de los vasos gástricos antes de dividir el estómago^12,14. Otros modelos dividen el estómago usando una grapadora pero dejan una bolsa grande no consistente con el post RYGB anatomía humana¹¹. En este modelo, proporcionamos instrucciones detalladas sobre cómo realizar RYGB utilizando grapadoras lineales en un modelo de rata que resulta en una bolsa gástrica más acorde con la de la anatomía humana. En general, este procedimiento se asoció con excelentes tasas de supervivencia y resultados metabólicos.

Protocolo

Los protocolos de uso de animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Alberta (AUP00003000). Consulte la Figura 1 para obtener un diagrama que muestra la anatomía de RYGB.

1. Bypass gástrico Roux-en-Y

1. Preparación de animales y configuración operativa
   1. Una semana antes de la cirugía, proporcione a las ratas terapia de rehidratación oral y dieta líquida, además de su dieta sólida y agua para aclimatarlas a esta nueva dieta.
   2. Ratas rápidas con sólo acceso al agua durante 12-18 h antes de la cirugía.
      1. Asegúrese de que las ratas estén en ayunas en una plataforma de alambre elevado para que no puedan consumir material de cama.
   3. Inyecte a ratas con buprenorfina larga subcutánea de liberación sostenida (RS) a una dosis de 1 mg/kg inmediatamente antes de la cirugía.
   4. Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos, toallas y cortinas.
   5. Limpie la superficie de funcionamiento, la almohadilla térmica y el cono de la nariz anestésico con etanol al 70%.
   6. Configure la superficie de operación con un microscopio de operación, una máquina anestésica y suministros de una manera que sea ergonómica para el cirujano de operación.
   7. Utilice una almohadilla de calefacción de temperatura regulada y ajuste a 37 °C.
   8. Coloque una cortina o toalla estéril sobre la almohadilla térmica.
   9. Llene un tubo cónico estéril de 50 mL con solución salina al 0,9%.
2. Inducción y preparación anestésica
   1. Inducir la anestesia utilizando isoflurano al 4% según protocolos previamente establecidos^15.
   2. Aplique presión en la parte posterior del pie de las cuatro extremidades para asegurarse de que no haya respuesta al dolor.
   3. Compruebe si hay anestesia adecuada y frecuencia respiratoria después de cada 5 min.
   4. Aplique lubricante en ambos ojos para evitar el secado.
   5. Afeitarse el pelo del abdomen.
   6. Limpie el abdomen con una solución de povidona-yodo. Deje que la solución se seque y cambie a guantes estériles.
   7. Cubra a la rata con una abertura en la cortina para exponer el abdomen.
   8. Coloque los instrumentos, las suturas, los hisopos de algodón y una jeringa de 10 ml en un lugar que permita un fácil acceso durante el procedimiento.
3. Mediana de laparotomía
   1. Haga una incisión de 3 cm en la línea media superior del abdomen usando un bisturí, justo debajo del proceso xifoideo como punto de referencia.
   2. Usando tijeras, divida la fascia y el peritoneo, con cuidado de permanecer en la línea media alba para reducir el sangrado del recto abdominus. Si hay sangrado, controlarlo con termo o electrocauterización.
4. Movilización del estómago
   1. Usando dos hisopos de algodón húmedos, disecciona sin rodeos los accesorios gástricos.
   2. Cuando encuentre adherencias densas, use la cauterización térmica para dividir los accesorios gástricos con cuidado para evitar cauterizar el estómago. Divida bruscamente el ligamento entre el estómago y el lóbulo hepático accesorio para reducir el riesgo de desgarro hepático con la movilización estomacal.
   3. Para los vasos sanguíneos más grandes, especialmente en las arterias gástricas cortas, ligate usando la sutura del polipropileno 6-0.
   4. Cree una ventana en el lado distal derecho del esófago pero próxima a la arteria gástrica izquierda. Asegúrese de que un hisopo de algodón pueda llegar a esta área posteriormente. El estómago se moviliza adecuadamente cuando se puede exteriorizar fuera del abdomen.
5. Identificar y dividir el yeyuno
   1. Identificar el ligamento de Treitz siguiendo el yeyuno proximally hasta observar que es la fijación al mesocolon transversal.
   2. Mida 7 cm distalmente, identifique una ubicación entre los vasos mesentéricos y divida el intestino con micro tijeras. Evite los parches de Peyer al dividir el intestino. Tenga cuidado de dividir sólo el intestino y no el mesenterio.
   3. Coloque una esponja limpia y salina empapada antes de dividir el intestino para minimizar la contaminación.
   4. Compruebe la presencia de un pequeño vaso de cruce en el mesenterio en el borde del intestino delgado y divídalo con cauterización para evitar sangrado.
   5. Continuar dividiendo el mesenterio 1 cm hacia la base mesentérica.
   6. Identificar el yeyuno proximal y distal. Coloque el yeyuno proximal debajo de una gasa húmeda a la derecha de la rata y el yeyuno distal a la izquierda de la rata.
6. Grapar el estómago
   1. Inserte una grapadora de corte lineal de 45 mm con una altura de grapa de 3,5 mm a través de la línea blanca del forestomach para crear una bolsa más pequeña. Espere 10 s antes de disparar la grapadora.
   2. Coloque la presión usando gasa en las líneas de grapas durante 1 minuto para asegurar la hemostasia. Si la hemostasia no se logra con presión sola, el sangrado a lo largo de la línea de grapa se sobresewn usando 6-0 figuras de polipropileno de ocho suturas.
   3. Realice un segundo fuego básico a través del estómago en la ventana creada previamente. Espere 10 s antes de disparar la grapadora. La presión se mantiene a lo largo de la línea de grapa para asegurar la hemostasia, y puede ser necesario sobresewing.
7. Gastroyeyunostomía
   1. Haga una gastrotomía inmediatamente después de grapar el estómago. Los retrasos en esto pueden causar distensión gástrica y aspiración ya que el estómago es discontinuo después de la segunda grapa gástrica.
   2. Usando un bisturí de 11 hojas, cree una gastrotomía en la bolsa distal. Expresar el contenido gástrico a través de la gastrotomía. Esto es importante para prevenir la distensión gástrica y la aspiración. Alargar esta gastrotomía usando tijeras micro a aproximadamente 5 mm. La gastrotomía se hace lo suficientemente grande como para que la punta del hisopo de algodón se ajuste a través de.
   3. Movilice el extremo distal del yeyuno adyacente a la gastrotomía y coloque de tal manera que el mesenterio no se tuerza.
   4. Mientras sutura la anastomosis, asegúrese de que el intestino se mantenga húmedo cubriéndolo con gasa empapada de solución salina y reaplicando solución salina regularmente.
   5. Usando 6-0 polidioxanona o sutura de polipropileno, coloque una sutura de estancia en el margen inferior de la anastomosis y retraiga suavemente usando un broche de presión. Atar con tres nudos.
   6. Coloque una sutura de estancia en el margen superior de la anastomosis y retraiga suavemente usando un broche de presión. Atar con seis nudos.
   7. Suturar el lado anterior de la anastomosis de forma continua, tomando mordeduras de 1 mm de ancho y 1 mm de distancia con cuidado para evitar tomar la parte posterior.
   8. Una vez que la sutura ha alcanzado la sutura de estancia inferior, atar estos juntos con un adicional de seis nudos.
   9. Una vez que el lado anterior está completo, voltear el intestino y el estómago y pasar la sutura de estancia inferior a través del defecto mesentérico. Vuelva a aplicar el ajuste y retraiga inferiormente.
   10. Para el lado posterior de la anastomosis, coloque el espesor completo interrumpido 6-0 suturas, 1 mm de ancho, y espaciado 1 mm de distancia, con cuidado para evitar tomar la parte posterior. Estos están atados con seis nudos cada uno.
       NOTA: El lado anterior de la anastomosis se sutura de manera continua, mientras que el lado posterior se realiza de manera interrumpida. Esto previene la estenosis potencial o la estenosis asociada a un encierro circunferencial continuo.
   11. Compruebe la fuga empujando suavemente el contenido luminal a través de la anastomosis. Si hay áreas con fugas, reforzá cuidadosamente con suturas interrumpidas. Tenga cuidado de evitar tomar la pared trasera al reforzar con suturas adicionales.
8. Yeyunojejunostomía
   1. A partir de la gastrojeyunostomía, medir 20 cm distalmente.
   2. Cree una yeyunotomía en el lado antimesentérico usando el bisturí de 11 hojas. Evite hacer la yeyunotomía sobre los parches de Peyer.
   3. Extienda esta yeyunotomía usando micro tijeras, de tal manera que sea del mismo tamaño que la extremidad biliopancreática. Asegúrese de que un hisopo de algodón sólo cabe en el interior.
   4. Coloque la extremidad biliopancreática de tal manera que no haya torsión del mesenterio.
   5. Realizar la anastomosis de manera similar a la gastrojejunostomía con 6-0 suturas de estancia en los lados superior e inferior. El lado anterior se realiza con suturas continuas mientras que el lado posterior se realiza con suturas interrumpidas.
   6. Asegúrese de que el intestino se mantenga húmedo con solución salina durante esta anastomosis.
   7. Compruebe si hay fugas empujando suavemente el contenido luminal a través de la anastomosis. Si hay áreas con fugas, reforcélas con suturas interrumpidas.
9. Reposicionar el intestino y el estómago
   1. Asegúrese de que no haya torsión de la bolsa, el estómago remanente o el hígado. Asegúrese de que el lóbulo izquierdo del hígado sea anterior al estómago y no quede atrapado detrás de la bolsa, ya que esto puede causar isquemia hepática compresiva.
   2. Coloque el intestino en el abdomen en su posición natural de tal manera que no haya torsión.
10. Cierre abdominal
    1. Cierre la fascia con poliglactina 3-0 de manera continua. También se puede usar polidioxanona 3-0.
    2. Cierre la piel con 2-0 de seda de manera continua.
11. Aparición anestésica
    1. Disminuya el isoflurano a cero, pero continúe con el oxígeno suplementario.
    2. Administre un anestésico local como un bloque de salpicaduras a la incisión.
    3. Administrar 10 mL de dextrosa subcutánea al 5% en solución salina normal (D5NS) en el tejido subcutáneo detrás del cuello.
    4. Coloque un collar de rata isabelino antes de que la rata esté completamente despierta. Tenga cuidado de ajustarlo perfectamente, pero no demasiado apretado para causar molestias.
       NOTA: El collar se mantiene encendido hasta el día 5 para prevenir la dehiscencia de la herida.

2. Cirugía simulada

NOTA: La cirugía simulada se realiza de manera similar a RYGB, sin embargo, no se realizan anastomosis.

1. Se crea una gastrotomía y luego se cierra con 6-0 suturas de polidioxanona o polipropileno.
2. Una yeyunotomía se crea 7 cm distal al ligamento de Treitz y luego se cierra con 6-0 suturas de polidioxanona o polipropileno.

3. Cuidados postoperatorios

1. Cuidados postoperatorios
   1. Aloja a las ratas individualmente y mantenlas en plataformas de alambre elevadas hasta que se reintroduzca la comida sólida para evitar el consumo de ropa de cama y la obstrucción luminal.
      NOTA: La dieta postoperatoria se reasume gradualmente pues el edema en el gastrojejunostomy puede causar la obstrucción con la reasunción temprana de la dieta sólida.
   2. Inspeccione los pies diariamente mientras las ratas están en plataformas de alambre elevadas para cualquier cambio en la piel.
   3. Mantenga a las ratas en el agua y la dieta de la terapia de la rehidratación oral para los primeros 72 h.
   4. Administrar 10 mL de D5NS cada 12 h durante las primeras 72 h.
   5. Administre buprenorfina subcutánea de acción corta a 0,01 mg/kg si las ratas parecen tener dolor. La Escala de Mueca de Rata se utiliza para evaluar el dolor¹⁶.
   6. En el día postoperatorio 3, agregue dieta líquida de roedores. Continúe proporcionando agua y terapia de rehidratación oral.
   7. En el día postoperatorio 5, reinicie la dieta alta en grasas. Continúe proporcionando agua y dieta líquida. Quitar el collar isabelino.
   8. En el día postoperatorio 7, suspenda la dieta líquida.
   9. Retire las suturas de la piel en el día postoperatorio 10-14.

Resultados

Animales y alojamiento
36 ratas Wistar machos fueron alojadas en parejas y fueron alimentadas con un 60% de dietas estériles de roedores ricos en grasas a partir de las seis semanas de edad(Figura 2). En 16 semanas de la edad, experimentaron RYGB o cirugía del impostor. Después de la primera semana postoperatoria, las ratas fueron reasumídas en una dieta de alto contenido en grasas. La mitad de las ratas fueron euthanized en 2 semanas postoperatorias y la otra mitad e...

Discusión

RYGB implica la creación de una pequeña bolsa gástrica (menos de 30 mL), y la creación de una extremidad biliopancreática y una extremidad Roux (Figura 1). En los seres humanos, el miembro biliopancreático es típicamente de 30 a 50 cm y transporta secreciones del remanente gástrico, el hígado y el páncreas. La extremidad de Roux es típicamente de 75 a 150 cm de longitud y es el canal principal para los alimentos ingeridos. El canal común es el intestino delgado restante distal a ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-0 Silk Sutures	Ethicon	K533
3-0 Vicryl Sutures	Ethicon	J219H
4% Isoflurane	N/A	N/A
5% Dextrose and 0.9% Sodium Chloride Solution - 1000 mL	Baxter	2B1064
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-432-22
6-0 Prolene Sutures	Ethicon	8805H
Anesthetic Machine	N/A	N/A
Animal Hair Shaver	N/A	N/A
Betadine Solution	N/A	N/A
Castrojievo Needle Holder with lock 14 cm (smooth curved)	World Precision Instruments	503258
ECHELON FLEX Articulating Endoscopic Linear Cutter	Ethicon	EC45A
Economy Tweezers #4	World Precision Instruments	501978
ENDOPATH ETS Articulating Linear Cutter 45mm Reloads	Ethicon	6R45B
Far Infrared Warming Pad Controller with warming pad (15.2 cm W x 20.3 cm L), pad temperature probe, and 10 disposable, non-sterile sleeve protectors	Kent Scientific	RT-0515
Large Rat Elizabethan Collar	Kent Scientific	EC404VL-10
Liquid Diet Feeding Tube (150 mL)	Bio-Serv	9007
Liquid Diet Feeding Tube Holder (short adjustable)	Bio-Serv	9015
Micro Mosquito Forceps	World Precision Instruments	500452
Micro Scissors	World Precision Instruments	503365
Mouse Diet, High Fat Fat Calories (60%), Soft Pellets	Bio-Serv	S3282
No. 11 Blade and Scalpel Handle	N/A	N/A
OPMI Vario Surgical Microscope	ZEISS	S88
Raised Floor Grid	Tecniplast	GM500150 Raised Floor Grid
Rodent Liquid Diet, Lieber-DeCarli '82, Control, 4 Liters/Bag	Bio-Serv	F1259
Sodium Chloride Irrigation 0.9% Solution - 500 mL	Baxter	JF7633
Sterile Cotton Swabs	N/A	N/A
Sterile Drape	N/A	N/A
Sterile Towel	N/A	N/A
Thermal Cautery Unit	World Precision Instruments	501293