Un protocole pour le pontage gastrique de Roux-en-Y chez le rat à l’aide d’agrafeuses linéaires

Résumé

Le pontage gastrique de Roux-en-Y (RYGB) est effectué pour traiter l’obésité et le diabète. Cependant, les mécanismes sous-jacents à l’efficacité du RYGB ne sont pas entièrement compris, et les études sont limitées par des difficultés techniques conduisant à une mortalité élevée chez les modèles animaux. Cet article fournit des instructions sur la façon d’exécuter RYGB chez les rats avec des taux de réussite élevés.

Résumé

Le pontage gastrique de Roux-en-Y (RYGB) est couramment effectué pour le traitement de l’obésité sévère et du diabète de type 2. Cependant, le mécanisme de perte de poids et les changements métaboliques ne sont pas bien compris. On pense que de multiples facteurs jouent un rôle, y compris la réduction de l’apport calorique, la diminution de l’absorption des nutriments, l’augmentation de la satiété, la libération d’hormones favorisant la satiété, les changements dans le métabolisme des acides biliaires et les altérations du microbiote intestinal.

Le modèle RYGB de rat présente un cadre idéal pour étudier ces mécanismes. Les travaux antérieurs sur les modèles murins ont eu des taux de mortalité élevés, allant de 17 à 52%, limitant leur adoption. Les modèles de rat démontrent plus de réserve physiologique au stimulus chirurgical et sont techniquement plus faciles à adopter car ils permettent l’utilisation d’agrafeuses chirurgicales. Un défi avec les agrafeuses chirurgicales, cependant, est qu’elles laissent souvent une grande poche gastrique qui n’est pas représentative de RYGB chez l’homme.

Dans ce protocole, nous présentons un protocole de RYGB chez les rats qui ont comme conséquence une petite poche gastrique utilisant les agrafeuses chirurgicales. En utilisant deux feux d’agrafeuse qui enlèvent le forestomach du rat, nous obtenons une poche gastrique plus petite similaire à celle suivant un RYGB humain typique. L’agrafage chirurgical a également comme conséquence une meilleure hémostase que la division pointue. De plus, le séestomaque du rat ne contient pas de glandes et son élimination ne devrait pas altérer la physiologie du RYGB.

La perte de poids et les changements métaboliques dans la cohorte de RYGB étaient significatifs comparés à la cohorte de feinte, avec la tolérance sensiblement inférieure de glucose à 14 semaines. En outre, ce protocole a une excellente survie de 88,9% après RYGB. Les qualifications décrites dans ce protocole peuvent être acquises sans expérience microsurgical précédente. Une fois maîtrisée, cette procédure fournira un outil reproductible pour étudier les mécanismes et les effets du RYGB.

Introduction

L’obésité et le diabète de type 2 sont devenus des épidémies mondiales¹. Bien que la perte de poids médicale puisse améliorer le diabète chez les patients, ceux atteints de diabète sévère bénéficient le plus de la chirurgie bariatrique. La chirurgie bariatrique s’est avérée sûre et efficace pour perdre du poids et améliorer ou guérir le diabète de type^{2 2,3,}même chez les personnes atteintes d’une maladie de longue date^4. Les procédures bariatriques métaboliques, telles que la chirurgie de pontage gastrique Roux-en-Y (RYGB) de référence actuelle, induisent des améliorations rapides et soutenues de l’homéostasie du glucose tout en réduisant le besoin de médicaments diabétiques^5,6,7.

Après RYGB, l’amélioration de l’homéostasie du glucose se produit rapidement et est indépendante de la perte de poids⁸. Deux théories importantes ont été proposées pour expliquer les changements métaboliques liés à la remise de diabète qui se produisent après chirurgie métabolique. D’abord, l’hypothèse de hindgut postule que, après déviation, des concentrations plus élevées des éléments nutritifs non digérés atteignent l’intestin distal augmentant la libération des hormones telles que GLP-1. D’autre part, l’hypothèse de foregut suggère que le contournement de l’intestin proximal réduise la sécrétion des hormones d’anti-incrétine. Ces deux effets pourraient conduire à une amélioration précoce du métabolisme du glucose⁹.

Les modèles animaux ont le potentiel d’être un outil puissant pour étudier ces mécanismes. Cependant, un obstacle majeur à l’utilisation de modèles de souris ou de rats est la difficulté technique à effectuer ces procédures. La plupart des études se sont appuyées sur des modèles de souris ou de rat^10,11,12. Les modèles murins ont été difficiles car l’estomac de souris est trop petit pour utiliser des dispositifs d’agrafeuse¹¹, et les taux de mortalité sont inacceptablement élevés, allant de 17 à 52%¹³. Chez le rat, certains protocoles restent techniquement difficiles à réaliser en raison d’une ligature complexe des vaisseaux gastriques avant de diviser l’estomac^12,14. D’autres modèles divisent l’estomac à l’aide d’une agrafeuse mais laissent une grande poche non conforme à l’anatomie humaine post RYGB¹¹. Dans ce modèle, nous fournissons des instructions détaillées sur la façon d’effectuer RYGB à l’aide d’agrafeuses linéaires dans un modèle de rat résultant en une poche gastrique plus conforme à celle de l’anatomie humaine. Dans l’ensemble, cette procédure a été associée à d’excellents taux de survie et résultats métaboliques.

Protocole

Les protocoles d’utilisation des animaux ont été approuvés par le Health Science Animal Care and Use Committee de l’Université de l’Alberta (AUP00003000). Voir la figure 1 pour un diagramme illustrant l’anatomie du RYGB.

1. Pontage gastrique de Roux-en-Y

1. Préparation des animaux et installation opératoire
   1. Une semaine avant la chirurgie, fournir aux rats une thérapie de réhydratation orale et un régime liquide en plus de leur régime solide et de l’eau pour les acclimater à ce nouveau régime.
   2. Rats rapides avec seulement l’accès à l’eau pendant 12-18 h avant la chirurgie.
      1. Assurez-vous que les rats sont jeûnés sur une plate-forme métallique surélevée afin qu’ils ne puissent pas consommer de matériau de litière.
   3. Injecter aux rats une longue buprénorphine sous-cutanée à libération prolongée (SR) à une dose de 1 mg/kg immédiatement avant la chirurgie.
   4. Autoclave tous les instruments chirurgicaux, serviettes et rideaux.
   5. Nettoyez la surface de fonctionnement, le coussin chauffant et le cône de nez anesthésique avec de l’éthanol à 70 %.
   6. Configurez la surface opératoire avec un microscope opératoire, une machine anesthésique et des fournitures d’une manière ergonomique pour le chirurgien opératoire.
   7. Utilisez un coussin chauffant à température réglée et réglé à 37 °C.
   8. Placez un drapé ou une serviette stérile sur le coussin chauffant.
   9. Remplissez un tube conique stérile de 50 mL avec une solution saline à 0,9 %.
2. Induction et préparation anesthésiques
   1. Induire une anesthésie en utilisant 4% d’isoflurane selon les protocoles précédemment établis¹⁵.
   2. Exercer une pression sur l’arrière-pied des quatre membres pour vous assurer qu’il n’y a pas de réponse à la douleur.
   3. Vérifiez une anesthésie et une fréquence respiratoire adéquates toutes les 5 minutes.
   4. Appliquez du lubrifiant sur les deux yeux pour éviter le dessèchement.
   5. Rasez les cheveux de l’abdomen.
   6. Nettoyez l’abdomen avec une solution de povidone-iode. Laissez la solution sécher et changez-la en gants stériles.
   7. Draper le rat avec une ouverture dans le drapé pour exposer l’abdomen.
   8. Placez les instruments, les sutures, les cotons-tiges et une seringue de 10 mL dans un endroit qui permet un accès facile pendant la procédure.
3. Laparotomie médiane
   1. Faites une incision de 3 cm dans la ligne médiane supérieure de l’abdomen à l’aide d’un scalpel, juste en dessous du processus xyphoïde comme point de repère.
   2. À l’aide de ciseaux, divisez le fascia et le péritoine, en prenant soin de rester à mi-ligne sur la linea alba pour réduire les saignements du rectus abdominus. S’il y a un saignement, contrôlez-le avec de la thermocautérisation ou de l’électrocautérisation.
4. Mobiliser l’estomac
   1. À l’aide de deux cotons-tiges humides, disséquer carrément les attaches gastriques.
   2. Lorsque vous rencontrez des adhérences denses, utilisez la cautérisation thermique pour diviser les attachements gastriques avec soin afin d’éviter de cautériser l’estomac. Divisez brusquement le ligament entre l’estomac et le lobe hépatique accessoire pour réduire le risque de déchirure du foie avec la mobilisation de l’estomac.
   3. Pour les vaisseaux sanguins plus gros, en particulier au niveau des artères gastriques courtes, ligate en utilisant une suture de polypropylène 6-0.
   4. Créez une fenêtre sur le côté distal droit de l’œsophage mais proximale à l’artère gastrique gauche. Assurez-vous qu’un coton-tige peut atteindre cette zone par la suite. L’estomac est adéquatement mobilisé lorsqu’il peut être extériorisé à l’extérieur de l’abdomen.
5. Identifier et diviser le jéjunum
   1. Identifier le ligament de Treitz en suivant le jéjunum proximalement jusqu’à ce qu’il soit attaché au mésocolon transversal.
   2. Mesurez 7 cm d’une manière distale, identifiez un emplacement entre les vaisseaux mésentériques et divisez les intestins avec des micro-ciseaux. Évitez les plaques de Peyer lors de la division de l’intestin. Prenez soin de ne diviser que l’intestin et non le mésentère.
   3. Placez une éponge propre et saline trempée avant de diviser l’intestin pour minimiser la contamination.
   4. Vérifiez la présence d’un petit vaisseau traversant dans le mésentère à la frontière de l’intestin grêle et divisez-le avec la cautérisation pour éviter les saignements.
   5. Continuer à diviser le mésentère de 1 cm vers la base mésentérique.
   6. Identifier le jéjunum proximal et distal. Placez le jéjunum proximal sous une gaze humide à droite du rat et le jéjunum distal à gauche du rat.
6. Agrafer l’estomac
   1. Insérez une agrafeuse de coupe linéaire de 45 mm avec une hauteur d’agrafe de 3,5 mm à travers la ligne blanche du boisaque pour créer une pochette plus petite. Attendez 10 s avant de tirer l’agrafeuse.
   2. Placez la pression à l’aide de gaze sur les lignes d’agrafe pendant 1 min pour assurer l’hémostase. Si l’hémostase n’est pas atteinte avec la pression seule, le saignement le long de la ligne d’agrafe est suressé en utilisant la figure de polypropylène 6-0 de huit sutures.
   3. Effectuez un deuxième feu d’agrafe à travers l’estomac dans la fenêtre créée précédemment. Attendez 10 s avant de tirer l’agrafeuse. La pression est maintenue le long de la ligne d’agrafe pour assurer l’hémostase, et le sursaut peut être nécessaire.
7. Gastrojejunostomie
   1. Faire une gastrotomie immédiatement après avoir agrafé l’estomac. Les retards dans ceci peuvent causer la distension gastrique et l’aspiration pendant que l’estomac est discontinu après le deuxième agrafe gastrique.
   2. À l’aide d’un scalpel à 11 lames, créez une gastrotomie au niveau de la poche distale. Exprimez le contenu gastrique par la gastrotomie. Ceci est important pour prévenir la distension gastrique et l’aspiration. Allonger cette gastrotomie à l’aide de micro ciseaux à environ 5 mm. La gastrotomie est faite assez grande pour que la pointe de coton-tige s’adapte juste à travers.
   3. Mobiliser l’extrémité distale du jéjunum à côté de la gastrotomie et placer de telle sorte que le mésentère ne soit pas tordu.
   4. Tout en suturant l’anastomose, assurez-vous que l’intestin est maintenu humide en le recouvrant de gaze imbibée de solution saline et en réappliquez régulièrement une solution saline.
   5. À l’aide de la suture polydioxanone ou polypropylène 6-0, placez une suture de séjour à la marge inférieure de l’anastomose et rétractez doucement à l’aide d’un claquement. Attachez à trois nœuds.
   6. Placez une suture de séjour à la marge supérieure de l’anastomose et rétractez doucement à l’aide d’un claquement. Attachez à six nœuds.
   7. Suturer le côté antérieur de l’anastomose de manière continue, en prenant des piqûres de 1 mm de large et 1 mm d’écart avec soin pour éviter de prendre le dos.
   8. Une fois que la suture a atteint la suture inférieure, attachez-les ensemble avec six nœuds supplémentaires.
   9. Une fois que le côté antérieur est complet, retournez les entrailles et l’estomac et passez la suture inférieure de séjour par le défaut mésentérique. Réappliquez l’accrochage et rétractez-le de manière inférieure.
   10. Pour le côté postérieur de l’anastomose, placez la pleine épaisseur interrompue 6-0 sutures, 1 millimètre de large, et espacées de 1 millimètre, avec le soin d’éviter de prendre le dos. Ceux-ci sont attachés avec six nœuds chacun.
       REMARQUE: Le côté antérieur de l’anastomose est suturée de manière continue tandis que le côté postérieur est fait d’une mode interrompue. Ceci empêche la restriction ou la sténose potentielle liée à une fermeture circonférentielle continue.
   11. Vérifiez la fuite en poussant doucement le contenu luminal à travers l’anastomose. S’il y a des zones avec des fuites, renforcez-les soigneusement avec des sutures interrompues. Prenez soin d’éviter de prendre le mur arrière lorsque vous renforcez avec des sutures supplémentaires.
8. Jejunojejunostomy
   1. À partir de la gastrojejunostomy, mesurer 20 cm distalement.
   2. Créez une jéjunotomie du côté antimesentérique à l’aide du scalpel à 11 lames. Évitez de faire la jéjunotomie sur peyer' patchs de s.
   3. Prolongez cette jéjunotomie à l’aide de micro-ciseaux, de sorte qu’elle soit de la même taille que le membre biliopancréatique. Assurez-vous qu’un coton-tige s’adapte parfaitement à l’intérieur.
   4. Placez le membre biliopancréatique de manière à ce qu’il n’y ait pas de torsion du mésentère.
   5. Effectuer l’anastomose de la même manière que la gastrojejunostomy avec des sutures de séjour 6-0 sur les côtés supérieurs et inférieurs. Le côté antérieur est effectué avec des sutures continues tandis que le côté postérieur est effectué avec des sutures interrompues.
   6. Assurez-vous que l’intestin est maintenu humide avec une solution saline pendant cette anastomose.
   7. Vérifiez s’il y a fuite en poussant doucement le contenu luminal à travers l’anastomose. S’il y a des zones avec des fuites, renforcez-les avec des sutures interrompues.
9. Repositionner l’intestin et l’estomac
   1. Assurez-vous qu’il n’y a pas de torsion de la poche, de l’estomac ou du foie. Assurez-vous que le lobe gauche du foie est antérieur à l’estomac et non piégé derrière la poche, car cela peut provoquer une ischémie hépatique compressive.
   2. Placez l’intestin dans l’abdomen dans sa position naturelle de sorte qu’il n’y ait pas de torsion.
10. Fermeture abdominale
    1. Fermez le fascia avec de la polyglactine 3-0 de manière continue. La polydioxanone 3-0 peut également être utilisée.
    2. Fermez la peau avec de la soie 2-0 de manière continue.
11. Émergence anesthésique
    1. Diminuer l’isoflurane à zéro, mais continuer l’oxygène d’appoint.
    2. Administrer un anesthésique local comme bloc d’éclaboussure à l’incision.
    3. Administrer 10 ml de dextrose sous-cutané à 5 % dans une solution saline normale (D5NS) dans le tissu sous-cutané derrière le cou.
    4. Placez un collier de rat élisabéthain avant que le rat ne soit complètement éveillé. Prenez soin de l’adapter confortablement mais pas trop serré pour causer de l’inconfort.
       REMARQUE: Le collier est maintenu jusqu’au jour 5 pour éviter la déhiscence de la plaie.

2. Chirurgie simulée

REMARQUE: La chirurgie simulée est effectuée de manière similaire à RYGB, cependant, aucune anastomose n’est effectuée.

1. Une gastrotomie est créée puis fermée avec des sutures de polydioxanone ou de polypropylène 6-0.
2. Une jéjunotomie est créée à 7 cm distale du ligament de Treitz, puis fermée avec des sutures de polydioxanone ou de polypropylène 6-0.

3. Soins postopératoires

1. Soins postopératoires
   1. Logez les rats individuellement et gardez-les sur des plates-formes métalliques surélevées jusqu’à ce que les aliments solides soient réintroduits pour empêcher la consommation de litière et l’obstruction luminale.
      REMARQUE: Le régime postopératoire est repris graduellement car l’oedème au gastrojejunostomy peut causer l’obstruction avec la reprise tôt du régime solide.
   2. Inspectez les pieds tous les jours pendant que les rats sont sur des plates-formes de fil surélevé pour tout changement de peau.
   3. Gardez les rats sous l’eau et le régime de thérapie de réhydratation orale pendant les 72 premières h.
   4. Administrer 10 mL de D5NS toutes les 12 h pendant les 72 premières h.
   5. Administrer de la buprénorphine sous-cutanée à courte durée d’action à 0,01 mg/kg si les rats semblent souffrir. L’échelle de grimace de rat est utilisée pour évaluer la douleur¹⁶.
   6. Le jour postopératoire 3, ajoutez le régime liquide des rongeurs. Continuer de fournir de l’eau et une thérapie de réhydratation orale.
   7. Le jour postopératoire 5, redémarrez le régime riche en graisses. Continuer à fournir de l’eau et un régime liquide. Retirez le collier élisabéthain.
   8. Le jour postopératoire 7, interrompre le régime liquide.
   9. Enlever les sutures cutanées le jour postopératoire 10-14.

Résultats

Animaux et logement
36 rats Wistar mâles ont été logés par paires et ont reçu un régime alimentaire riche en graisses à 60 % de rongeurs stériles à partir de l’âge de six semaines(figure 2). À l’âge de 16 semaines, ils ont subi une chirurgie RYGB ou feinte. Après la première semaine postopératoire, des rats ont été repris sur un régime à haute teneur en graisses. La moitié des rats ont été euthanasiés à 2 semaines postopératoires et l’autre ...

Discussion

Le RYGB implique la création d’une petite poche gastrique (moins de 30 mL) et la création d’un membre biliopancréatique et d’un membre Roux (Figure 1). Chez l’homme, le membre biliopancréatique mesure généralement de 30 à 50 cm et transporte les sécrétions du reste gastrique, du foie et du pancréas. Le membre de Roux mesure généralement de 75 à 150 cm de long et constitue le principal canal d’ingéré. Le canal commun est l’intestin grêle restant distal à l’endro...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-0 Silk Sutures	Ethicon	K533
3-0 Vicryl Sutures	Ethicon	J219H
4% Isoflurane	N/A	N/A
5% Dextrose and 0.9% Sodium Chloride Solution - 1000 mL	Baxter	2B1064
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-432-22
6-0 Prolene Sutures	Ethicon	8805H
Anesthetic Machine	N/A	N/A
Animal Hair Shaver	N/A	N/A
Betadine Solution	N/A	N/A
Castrojievo Needle Holder with lock 14 cm (smooth curved)	World Precision Instruments	503258
ECHELON FLEX Articulating Endoscopic Linear Cutter	Ethicon	EC45A
Economy Tweezers #4	World Precision Instruments	501978
ENDOPATH ETS Articulating Linear Cutter 45mm Reloads	Ethicon	6R45B
Far Infrared Warming Pad Controller with warming pad (15.2 cm W x 20.3 cm L), pad temperature probe, and 10 disposable, non-sterile sleeve protectors	Kent Scientific	RT-0515
Large Rat Elizabethan Collar	Kent Scientific	EC404VL-10
Liquid Diet Feeding Tube (150 mL)	Bio-Serv	9007
Liquid Diet Feeding Tube Holder (short adjustable)	Bio-Serv	9015
Micro Mosquito Forceps	World Precision Instruments	500452
Micro Scissors	World Precision Instruments	503365
Mouse Diet, High Fat Fat Calories (60%), Soft Pellets	Bio-Serv	S3282
No. 11 Blade and Scalpel Handle	N/A	N/A
OPMI Vario Surgical Microscope	ZEISS	S88
Raised Floor Grid	Tecniplast	GM500150 Raised Floor Grid
Rodent Liquid Diet, Lieber-DeCarli '82, Control, 4 Liters/Bag	Bio-Serv	F1259
Sodium Chloride Irrigation 0.9% Solution - 500 mL	Baxter	JF7633
Sterile Cotton Swabs	N/A	N/A
Sterile Drape	N/A	N/A
Sterile Towel	N/A	N/A
Thermal Cautery Unit	World Precision Instruments	501293