Un protocollo per il bypass gastrico Roux-en-Y nei ratti che utilizza cucitrici lineari

Riepilogo

Il bypass gastrico Roux-en-Y (RYGB) viene eseguito per trattare l'obesità e il diabete. Tuttavia, i meccanismi alla base dell'efficacia del RYGB non sono pienamente compresi e gli studi sono limitati da difficoltà tecniche che portano a un'elevata mortalità nei modelli animali. Questo articolo fornisce istruzioni su come eseguire RYGB nei ratti con alti tassi di successo.

Abstract

Il bypass gastrico Roux-en-Y (RYGB) viene comunemente eseguito per il trattamento dell'obesità grave e del diabete di tipo 2. Tuttavia, il meccanismo di perdita di peso e i cambiamenti metabolici non sono ben compresi. Si ritiene che molteplici fattori svolgano un ruolo, tra cui la riduzione dell'apporto calorico, la diminuzione dell'assorbimento dei nutrienti, l'aumento della sazietà, il rilascio di ormoni che promuovono la sazietà, i cambiamenti nel metabolismo dell'acido biliare e le alterazioni del microbiota intestinale.

Il modello RYGB del ratto presenta una struttura ideale per studiare questi meccanismi. Il lavoro precedente sui modelli di topi ha avuto alti tassi di mortalità, che vanno dal 17 al 52%, limitandone l'adozione. I modelli di ratto dimostrano una riserva più fisiologica per lo stimolo chirurgico e sono tecnicamente più facili da adottare in quanto consentono l'uso di cucitrici chirurgiche. Una sfida con le cucitrici chirurgiche, tuttavia, è che spesso lasciano una grande borsa gastrica che non è rappresentativa del RYGB nell'uomo.

In questo protocollo, presentiamo un protocollo RYGB nei ratti che si traducono in una piccola busta gastrica utilizzando cucitrici chirurgiche. Utilizzando due fuochi di cucitrice che rimuovono il forestomach del ratto, otteniamo una busta gastrica più piccola simile a quella che segue un tipico RYGB umano. La graffatura chirurgica si traduce anche in una migliore emostasi rispetto alla divisione acuta. Inoltre, il forestomach del ratto non contiene ghiandole e la sua rimozione non deve alterare la fisiologia del RYGB.

La perdita di peso e i cambiamenti metabolici nella coorte RYGB sono stati significativi rispetto alla coorte fittizia, con una tolleranza al glucosio significativamente inferiore a 14 settimane. Inoltre, questo protocollo ha un'eccellente sopravvivenza dell'88.9% dopo RYGB. Le competenze descritte in questo protocollo possono essere acquisite senza precedenti esperienze microchirurgiche. Una volta padroneggiata, questa procedura fornirà uno strumento riproducibile per studiare i meccanismi e gli effetti del RYGB.

Introduzione

L'obesità e il diabete di tipo 2 sono diventati epidemie in^{tutto il mondo 1}. Sebbene la perdita di peso medico possa migliorare il diabete nei pazienti, quelli con diabete grave beneficiano maggiormente della chirurgia bariatrica. La chirurgia bariatrica si è dimostrata sicura ed efficace nella perdita di peso e nel migliorare o curare il diabete di tipo^{2 2,3,}anche in quelli con malattia di lunga^{data 4}. Le procedure bariatrica metaboliche, come l'attuale chirurgia di bypass gastrico Roux-en-Y gold-standard (RYGB), inducono miglioramenti rapidi e sostenuti nell'omeostasi del glucosio riducendo al contempo la necessità di farmaci per diabetici^5,6,7.

Dopo RYGB, il miglioramento dell'omeostasi del glucosio si verifica rapidamente ed è indipendente dalla perdita di peso⁸. Sono state proposte due teorie principali per spiegare i cambiamenti metabolici associati alla remissione del diabete che si verificano dopo la chirurgia metabolica. In primo luogo, l'ipotesi del broncio postula che, dopo il bypass, concentrazioni più elevate di nutrienti non digeriti raggiungano l'intestino distale migliorando il rilascio di ormoni come il GLP-1. D'altra parte, l'ipotesi del prenega suggerisce che bypassare l'intestino prossimale riduce la secrezione di ormoni anti-incretina. Entrambi questi effetti potrebbero portare a un miglioramento precoce del metabolismo del glucosio⁹.

I modelli animali hanno il potenziale per essere un potente strumento per studiare questi meccanismi. Tuttavia, una barriera importante nell'utilizzo di modelli di topi o ratti è la difficoltà tecnica nell'eseguire queste procedure. La maggior parte degli studi si è basata sui modelli di^{topo o ratto 10,11,12}. I modelli di topo sono stati difficili in quanto lo stomaco del topo è troppo piccolo per utilizzare dispositivi di^{cucitrice 11}e i tassi di mortalità sono inaccettabilmente alti, che vanno dal 17 al 52%¹³. Nei ratti, alcuni protocolli rimangono tecnicamente difficili da eseguire a causa della complessa legatura dei vasi gastrici prima di dividere lo^{stomaco 12,14}. Altri modelli dividono lo stomaco usando una cucitrice ma lasciano una grande borsa non coerente con l'anatomia umana post RYGB¹¹. In questo modello, forniamo istruzioni dettagliate su come eseguire RYGB utilizzando cucitrici lineari in un modello di ratto con conseguente sacchetto gastrico più in linea con quello dell'anatomia umana. Nel complesso, questa procedura è stata associata a eccellenti tassi di sopravvivenza e risultati metabolici.

Protocollo

I protocolli sull'uso degli animali sono stati approvati dal Health Science Animal Care and Use Committee dell'Università dell'Alberta (AUP00003000). Vedere la figura 1 per un diagramma che illustra l'anatomia rygb.

1. Bypass gastrico Roux-en-Y

1. Preparazione degli animali e allestimento operativo
   1. Una settimana prima dell'intervento chirurgico, fornire ai ratti una terapia di reidratazione orale e una dieta liquida oltre alla loro dieta solida e acqua per acclimatarli a questa nuova dieta.
   2. Ratti veloci con accesso all'acqua solo per 12-18 ore prima dell'intervento chirurgico.
      1. Assicurarsi che i ratti siano digiunati su una piattaforma di filo rialzato in modo che non possano consumare materiale da letto.
   3. Iniettare ratti con buprenorfina lunga sottocutanea a rilascio prolungato (SR) ad una dose di 1 mg/kg immediatamente prima dell'intervento chirurgico.
   4. Autoclave tutti gli strumenti chirurgici, asciugamani e tende.
   5. Pulire la superficie operativa, il tampone riscaldante e il cono nasale anestetico con il 70% di etanolo.
   6. Impostare la superficie operativa con un microscopio operativo, una macchina anestetica e forniture in modo ergonomico per il chirurgo operativo.
   7. Utilizzare un riscaldante regolato dalla temperatura e impostare su 37 °C.
   8. Posizionare un drappo sterile o un asciugamano sopra la pastiglia riscaldante.
   9. Riempire un tubo conico sterile da 50 ml con 0,9% di soluzione salina.
2. Induzione e preparazione anestetica
   1. Indurre l'anestesia utilizzando il 4% di isoflurane secondo i protocolli^{15 precedentemente stabiliti.}
   2. Applicare pressione sul piede posteriore di tutti e quattro gli arti per assicurarsi che non vi sia risposta al dolore.
   3. Verificare la presenza di anestesia e frequenza respiratoria adeguate dopo ogni 5 minuti.
   4. Applicare lubrificante su entrambi gli occhi per evitare l'asciugatura.
   5. Radersi i capelli dall'addome.
   6. Pulire l'addome con una soluzione di povidone-iodio. Lasciare asciugare la soluzione e passare a guanti sterili.
   7. Drappeggiare il topo con un'apertura nel drappo per esporre l'addome.
   8. Posizionare strumenti, suture, tamponi di cotone e una siringa da 10 ml in un luogo che consenta un facile accesso durante la procedura.
3. Laparotomia mediana
   1. Fai un'incisione di 3 cm nella linea mediana superiore dell'addome usando un bisturi, appena sotto il processo xifoide come punto di riferimento.
   2. Usando le forbici, dividere la fascia e il peritoneo, con cura per rimanere a metà linea sulla linea alba per ridurre il sanguinamento dal retto abdominus. Se c'è sanguinamento, controllalo con termica o elettrocauteria.
4. Mobilitare lo stomaco
   1. Utilizzando due tamponi di cotone bagnati, sezionare senza mezzi termini gli attacchi gastrici.
   2. Quando si incontrano adesioni dense, utilizzare cautery termico per dividere gli attacchi gastrici con cura per evitare di cauterizzare lo stomaco. Dividere bruscamente il legamento tra lo stomaco e il lobo epatico accessorio per ridurre il rischio di strappo del fegato con la mobilitazione dello stomaco.
   3. Per vasi sanguigni più grandi, specialmente nelle arterie gastriche corte, ligate usando 6-0 sutura di polipropilene.
   4. Creare una finestra sul lato distale destro dell'esofago ma prossimale all'arteria gastrica sinistra. Assicurarsi che un batuffolo di cotone possa raggiungere quest'area posteriormente. Lo stomaco è adeguatamente mobilitato quando può essere esternati al di fuori dell'addome.
5. Identificare e dividere il giunone
   1. Identificare il legamento di Treitz seguendo il giunone prossimale fino a quando non lo si osserva è attaccamento al mesocolone trasversale.
   2. Misurare 7 cm distally, identificare una posizione tra vasi mesenterici e dividere l'intestino con micro forbici. Evita le patch di Peyer quando dividi l'intestino. Fai attenzione a dividere solo l'intestino e non il mesenterio.
   3. Posizionare una spugna pulita e salina imbevuta prima di dividere l'intestino per ridurre al minimo la contaminazione.
   4. Verificare la presenza di un piccolo vaso di attraversamento nel mesentere al confine del piccolo intestino e dividerlo con cautery per evitare sanguinamento.
   5. Continuare a dividere il mesentere di 1 cm verso la base mesenterica.
   6. Identificare il giunone prossimale e distale. Posizionare il giunone prossimale sotto una garza bagnata sulla destra del ratto e il giunone distale sulla sinistra del topo.
6. Graffatura dello stomaco
   1. Inserire una cucitrice da taglio lineare da 45 mm con altezza della graffetta di 3,5 mm sulla linea bianca del forestomach per creare una borsa più piccola. Attendere 10 s prima di sparare la cucitrice.
   2. Posizionare la pressione utilizzando la garza sulle linee di graffetta per 1 minuto per garantire l'emostasi. Se l'emostasi non si ottiene solo con la pressione, il sanguinamento lungo la linea di graffetta viene sovrascisso usando una figura di polipropilene 6-0 di otto suture.
   3. Eseguire un secondo fuoco di graffetta attraverso lo stomaco nella finestra creata in precedenza. Attendere 10 s prima di sparare la cucitrice. La pressione viene tenuta lungo la linea di graffetta per garantire l'emostasi e potrebbe essere necessario un sovrasezione.
7. Gastrojejunostomia
   1. Fare una gastrotomia immediatamente dopo aver graffato lo stomaco. Ritardi in questo possono causare distensione gastrica e aspirazione in quanto lo stomaco è discontinuo dopo il secondo graffetta gastrica.
   2. Utilizzando un bisturi a 11 lame, creare una gastrotomia sulla borsa distale. Esprimere il contenuto gastrico attraverso la gastrotomia. Questo è importante per prevenire la distensione gastrica e l'aspirazione. Allungare questa gastrotomia usando micro forbici a circa 5 mm. La gastrotomia è resa abbastanza grande da far passare la punta del batuffolo di cotone.
   3. Mobilitare l'estremità distale del giunone adiacente alla gastrotomia e posizionare in modo tale che il mesentere non sia contorto.
   4. Durante la sutura dell'anastomosi, assicurarsi che l'intestino sia mantenuto umido coprendolo con garza imbevuta di salina e riapplicando regolarmente la soluzione salina.
   5. Utilizzando 6-0 polidioxanone o sutura in polipropilene, posizionare una sutura di permanenza al margine inferiore dell'anastomosi e ritrarre delicatamente con uno snap. Legare con tre nodi.
   6. Posizionare una sutura di permanenza al margine superiore dell'anastomosi e ritrarre delicatamente con uno snap. Legare con sei nodi.
   7. Suturare il lato anteriore dell'anastomosi in modo continuo, prendendo morsi larghi 1 mm e distanti 1 mm con cura per evitare di prendere il retro.
   8. Una volta che la sutura ha raggiunto la sutura di permanenza inferiore, legare questi insieme ad altri sei nodi.
   9. Una volta completato il lato anteriore, capovolgere l'intestino e lo stomaco e passare la sutura di permanenza inferiore attraverso il difetto mesenterico. Riapplicare lo snap e ritrarre in modo inferiore.
   10. Per il lato posteriore dell'anastomosi, posizionare lo spessore pieno interrotto 6-0 suture, larghe 1 mm e distanziate di 1 mm l'una dall'altra, con cura per evitare di prendere il retro. Questi sono legati con sei nodi ciascuno.
       NOTA: Il lato anteriore dell'anastomosi viene suturato in modo continuo mentre il lato posteriore viene fatto in modo interrotto. Ciò previene la potenziale stenosi o stenosi associata a una chiusura circonferenziale continua.
   11. Verificare la perdita spingendo delicatamente il contenuto luminare attraverso l'anastomosi. Se ci sono aree con perdite, rinforzarle con cura con suture interrotte. Fare attenzione a evitare di prendere il backwall quando si rinforza con suture extra.
8. Giunonejejunostomia
   1. Dalla gastrojejunostomia, misurare 20 cm distally.
   2. Creare una jejunotomia sul lato antimesenterico usando il bisturi a 11 lame. Evita di fare la jejunotomia sulle patch di Peyer.
   3. Estendere questa jejunotomia usando micro forbici, in modo che sia delle stesse dimensioni dell'arto biliopancreatico. Assicurarsi che un batuffolo di cotone si adatti solo all'interno.
   4. Posizionare l'arto biliopancreatico in modo che non vi sia torsione del mesenterio.
   5. Eseguire l'anastomosi in modo simile alla gastrojejunostomia con suture di 6-0 stay sui lati superiore e inferiore. Il lato anteriore viene eseguito con suture continue mentre il lato posteriore viene eseguito con suture interrotte.
   6. Assicurarsi che l'intestino sia tenuto umido con soluzione salina durante questa anastomosi.
   7. Verificare la presenza di perdite spingendo delicatamente il contenuto luminare attraverso l'anastomosi. Se ci sono aree con perdite, rinforzarle con suture interrotte.
9. Riposizionare l'intestino e lo stomaco
   1. Assicurarsi che non vi sia torsione della busta, dello stomaco residuo o del fegato. Assicurarsi che il lobo sinistro del fegato sia anteriore allo stomaco e non intrappolato dietro la busta in quanto ciò può causare ischemia epatica compressiva.
   2. Posizionare l'intestino nell'addome nella sua posizione naturale in modo che non vi sia torsione.
10. Chiusura addominale
    1. Chiudere la fascia con poliglatina 3-0 in modo continuo. Può essere utilizzato anche polidioxanone 3-0.
    2. Chiudi la pelle con seta 2-0 in modo continuo.
11. Emergenza anestetica
    1. Diminuire l'isoflurane a zero ma continuare l'ossigeno supplementare.
    2. Somministrare un anestetico locale come blocco iniziale all'incisione.
    3. Somministrare 10 mL di destrosio sottocutaneo al 5% in soluzione salina normale (D5NS) nel tessuto sottocutaneo dietro il collo.
    4. Posizionare un collare di ratto elisabettiano prima che il topo sia completamente sveglio. Fai attenzione a adattarlo perfettamente ma non troppo stretto per causare disagio.
       NOTA: Il collare viene mantenuto fino al giorno 5 per prevenire la descienza della ferita.

2. Chirurgia sham

NOTA: L'intervento chirurgico sham viene eseguito in modo simile al RYGB, tuttavia, non vengono eseguite anastomosi.

1. Viene creata una gastrotomia e quindi chiusa con 6-0 polidioxanone o suture di polipropilene.
2. Una jejunotomia viene creata 7 cm distatale al legamento di Treitz e quindi chiusa con suture di polidiossanone o polipropilene 6-0.

3. Assistenza postoperatoria

1. Assistenza postoperatoria
   1. Ospita i ratti singolarmente e tienili su piattaforme di filo rialzato fino a quando il cibo solido non viene reintrodotto per prevenire il consumo di biancheria da letto e ostruzione luminare.
      NOTA: La dieta postoperatoria viene ripresa gradualmente poiché l'edema alla gastrojejunostomia può causare ostruzione con la ripresa precoce della dieta solida.
   2. Ispezionare i piedi ogni giorno mentre i ratti sono su piattaforme di filo rialzato per eventuali cambiamenti della pelle.
   3. Mantenere i ratti con acqua e dieta orale di terapia di reidratazione per le prime 72 ore.
   4. Somministrare 10 mL di D5NS ogni 12 ore per le prime 72 h.
   5. Somministrare buprenorfina sottocutanea ad azione breve a 0,01 mg/kg se i ratti sembrano somministrare dolore. La scala della smorfia del ratto viene utilizzata per valutare il^{dolore 16}.
   6. Il giorno 3 postoperatorio, aggiungere la dieta liquida dei roditori. Continuare a fornire acqua e terapia di reidratazione orale.
   7. Il giorno 5 postoperatorio, riavviare la dieta ricca di grassi. Continuare a fornire acqua e dieta liquida. Togli il collare elisabettiano.
   8. Il giorno 7 postoperatorio, interrompere la dieta liquida.
   9. Rimuovere le suture cutanee il giorno postoperatorio 10-14.

Risultati

Animali e alloggi
36 ratti Wistar maschi erano alloggiati in coppia e venivano nutriti con una dieta sterile ad alto contenuto di grassi per roditori al 60% a partire da sei settimane dietà (Figura 2). A 16 settimane di età, sono stati sottoposti a RYGB o a un intervento chirurgico fittizio. Dopo la prima settimana postoperatoria, i ratti sono stati ripresi con una dieta ricca di grassi. Metà dei ratti sono stati eutanasiati a 2 settimane post-operatorie e l'altra met?...

Discussione

Rygb comporta la creazione di una piccola busta gastrica (meno di 30 mL) e la creazione di un arto biliopancreatico e di un arto Roux(figura 1). Negli esseri umani, l'arto biliopancreatico è tipicamente da 30 a 50 cm e trasporta secrezioni dal residuo gastrico, dal fegato e dal pancreas. L'arto Roux è tipicamente lungo da 75 a 150 cm ed è il canale principale per il cibo ingerito. Il canale comune è il restante piccolo distale intestinale a cui si uniscono i due arti ed è dove si verifi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-0 Silk Sutures	Ethicon	K533
3-0 Vicryl Sutures	Ethicon	J219H
4% Isoflurane	N/A	N/A
5% Dextrose and 0.9% Sodium Chloride Solution - 1000 mL	Baxter	2B1064
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-432-22
6-0 Prolene Sutures	Ethicon	8805H
Anesthetic Machine	N/A	N/A
Animal Hair Shaver	N/A	N/A
Betadine Solution	N/A	N/A
Castrojievo Needle Holder with lock 14 cm (smooth curved)	World Precision Instruments	503258
ECHELON FLEX Articulating Endoscopic Linear Cutter	Ethicon	EC45A
Economy Tweezers #4	World Precision Instruments	501978
ENDOPATH ETS Articulating Linear Cutter 45mm Reloads	Ethicon	6R45B
Far Infrared Warming Pad Controller with warming pad (15.2 cm W x 20.3 cm L), pad temperature probe, and 10 disposable, non-sterile sleeve protectors	Kent Scientific	RT-0515
Large Rat Elizabethan Collar	Kent Scientific	EC404VL-10
Liquid Diet Feeding Tube (150 mL)	Bio-Serv	9007
Liquid Diet Feeding Tube Holder (short adjustable)	Bio-Serv	9015
Micro Mosquito Forceps	World Precision Instruments	500452
Micro Scissors	World Precision Instruments	503365
Mouse Diet, High Fat Fat Calories (60%), Soft Pellets	Bio-Serv	S3282
No. 11 Blade and Scalpel Handle	N/A	N/A
OPMI Vario Surgical Microscope	ZEISS	S88
Raised Floor Grid	Tecniplast	GM500150 Raised Floor Grid
Rodent Liquid Diet, Lieber-DeCarli '82, Control, 4 Liters/Bag	Bio-Serv	F1259
Sodium Chloride Irrigation 0.9% Solution - 500 mL	Baxter	JF7633
Sterile Cotton Swabs	N/A	N/A
Sterile Drape	N/A	N/A
Sterile Towel	N/A	N/A
Thermal Cautery Unit	World Precision Instruments	501293