Reconstruir el retinoblastoma humano in vitro

Resumen

Describimos un método para generar retinoblastoma humano (RB) mediante la introducción de mutaciones bialélicas RB1 en células madre embrionarias humanas (hESC). Las líneas celulares RB también podrían cultivarse con éxito utilizando el RB aislado en una placa.

Resumen

La RB humana es un cáncer pediátrico, que es letal si no se administra tratamiento. Como RB se origina a partir de precursores de conos, lo cual es relativamente raro en modelos de roedores, mientras que con respecto a las diferencias entre especies entre humanos y roedores, un modelo de enfermedad derivado de humanos es más beneficioso para descubrir los mecanismos de RB humano y buscar los objetivos de la terapia. En este documento, el protocolo describe la generación de dos líneas hESC editadas genéticamente con una mutación puntual RB1 bialélica (RB1 Mut/^Mut) y una mutación knockout RB1 (RB1-^/-), respectivamente. Durante el proceso de desarrollo de la retina, se observa la formación de RB. Las líneas celulares RB también se establecen segregando de los organoides RB. En conjunto, al diferenciar las líneas hESC editadas genéticamente en los organoides retinianos utilizando un protocolo de diferenciación combinada 2D y 3D, hemos reconstruido con éxito el RB humano en un plato e identificado su origen precursor de conos. Proporcionaría un modelo de enfermedad útil para observar la génesis, proliferación y crecimiento del retinoblastoma, así como para desarrollar nuevos agentes terapéuticos.

Introducción

El retinoblastoma humano (RB) es un tumor raro y mortal derivado de los precursores del cono retiniano ^1,2,3, es el tipo más común de neoplasia maligna intraocular en la infancia⁴. La inactivación homocigótica del gen RB1 es la lesión genética iniciadora en RB⁵. Sin embargo, los ratones con mutaciones RB1 no logran formar el tumor retiniano². Aunque los tumores de ratón podrían generarse con la combinación de mutaciones Rb1 y otras modificaciones genéticas, todavía carecen de las características de RB⁶ humano. Gracias al desarrollo de la diferenciación de organoides retinianos, se pudo obtener el RB derivado de hESC, mostrando los caracteres del RB¹ humano.

En la última década se han establecido numerosos protocolos para la diferenciación de organoides retinianos, incluidos 2D⁷, 3D⁸ y una combinación de 2D y 3D⁹. El método utilizado aquí para generar el RB humano es la consolidación de la cultura adherente y la cultura flotante⁹. Al diferenciar el hESC mutado RB1 en organoides retinianos, la formación de RB se detecta alrededor del día 45, y luego prolifera rápidamente alrededor del día 60. En el día 90, es posible el aislamiento de RB y la generación de la línea celular RB; además, la RB rodea a casi todos los organoides retinianos en el día 120.

La RB derivada de hESC es un modelo innovador para explorar el origen, la tumorigénesis y los tratamientos para la RB. En este protocolo, se describe en detalle la generación de hESC de edición génica, la diferenciación de RB y la caracterización de RB.

Protocolo

Este estudio está aprobado por el Comité de Ética institucional del Hospital Tongren de Beijing, Universidad Médica Capital. Las hESC H9 se obtienen del Instituto de Investigación WiCell.

1. Generación de hESC mutado RB1

1. Vector de focalización CRISPR/Cas9 para el knockout (KO) de RB1.
   1. Diseña un par de sgRNA. Para la ablación de RB1, diríjase al primer exón de este gen. La secuencia de cebador hacia adelante es CACCGCGGTGGCGGCCGTTTTTCGG, y la secuencia de cebador inversa es AAACCCGAAAAACGGCCGCCACCGC.
      NOTA: Para la mutación RB1 específica, también se requiere una plantilla reparada. En este protocolo, la línea celular RB1-KO se utiliza como ejemplo.
   2. Digiera 1 μg de pX330-U6-Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro con enzimas de restricción BbsI (ver Tabla de materiales) durante 30 min a 37 °C siguiendo las instrucciones del fabricante.
   3. Purificar los plásmidos digeridos utilizando un kit de purificación de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
      NOTA: Las reacciones enzimáticas podrían limpiarse directamente sin gel de agarosa utilizando el kit de purificación (consulte la Tabla de materiales).
   4. Fosforilar y recalentar cada par de oligos utilizando la polinucleótido quinasa T4 (PNK) (Tabla de materiales) con la reacción que comprende 1 μL de oligo1 (100 μM), 1 μL de oligo2 (100 μM), 1 μL de tampón de ligadura T4 10x, 6.5 μL de ddH₂O y 0.5 μL de T4 PNK.
      NOTA: Los cebadores delantero e inverso del paso 1.1.1 son un par de oligos. Fosforilar y recocir los oligos en un termociclador utilizando los siguientes parámetros: 37 °C durante 30 min; 95 °C durante 5 min; rampa hasta 25 °C a 5 °C por minuto.
   5. Diluir los oligos fosforilados y recocidos 200 veces añadiendo 1 μL de oligoreactivo a 199 μL de agua libre de nucleasas a temperatura ambiente (RT).
   6. Configure la reacción de ligadura e incube en RT durante 10 min mezclando lo siguiente: 50 ng de plásmido digerido Bbs1 del paso 1.1.3, 1 μL de oligo dúplex del paso 1.1.5, 5 μL de tampón de ligadura 2x, 1 μL de ligasa y tope hasta 10 μL con agua libre de nucleasas.
   7. Transformar la mezcla de ligadura y secuenciar las colonias positivas para el siguiente paso.
      NOTA: Utilice U6 hacia adelante o hacia atrás para la secuenciación.
      1. Descongelar las células competentes en hielo.
      2. Tomar 50 μL de las células competentes en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
      3. Añadir 1 μL de la mezcla de ligadura del paso 1.1.6 en las células competentes.
      4. Mezclar suavemente pipeteando arriba y abajo del tubo tres veces.
         NOTA: No vorágre.
      5. Coloque la mezcla en hielo durante 30 minutos.
      6. Choque térmico de la mezcla a 42 °C durante 90 s.
      7. Agregue 950 μL de caldo Luria-Bertani (LB) a temperatura ambiente sin antibiótico al tubo.
      8. Colocar el tubo en una agitadora a 300 rpm a 37 °C durante 60 min.
      9. Caliente las placas LB (peptona, peptona de caseína, cloruro de sodio, agar-agar y ampicilina) a 37 °C por adelantado.
      10. Extienda 50-100 μL de las células y la mezcla de ligadura sobre las placas en RT.
      11. Incubar las placas durante la noche a 37 °C.
      12. Recoger 12 colonias de la placa y transferirlas al medio LB con ampicilina. Coloque el medio en una agitadora a 300 rpm durante 60 min.
      13. Utilice 1 μL de la solución bacteriana (del paso 1.1.7.12) como plantilla para la PCR y seleccione las colonias positivas.
      14. Secuencie las colonias positivas mediante los cebadores U6, use la colonia con las secuencias de sgRNA diseñadas en el siguiente paso.
   8. Extraiga el plásmido usando un kit midi (consulte la Tabla de materiales).
      NOTA: La calidad y la cantidad del plásmido usando un mini kit no son suficientes para el siguiente experimento de nucleofección. Midi o maxi kit es más adecuado que el mini kit.
2. Cultivo de HESC y nucleofección.
   NOTA: Precaliente todos los reactivos a RT.
   1. Descongele 1 x 10⁶ células H9 en una placa prerecubierta de 6 pocillos con 10 μM Y-27632 (inhibidor de ROCK) y 2 ml de medio de cultivo ncEpic-hiPSC/hESC fresco.
      NOTA: Cubra la placa de 6 pocillos con una matriz de membrana basal reducida con factor de crecimiento del 1% durante al menos 30 minutos a 37 °C antes de su uso.
   2. Al día siguiente, retire el sobrenadante, enjuague las células con 1x solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco y luego agregue 2 ml de medio de cultivo ncEpic-hiPSC/hESC fresco.
   3. Cambie el medio todos los días con 2 ml de medio de cultivo ncEpic-hiPSC/hESC fresco en los siguientes 3-5 días hasta que las células crezcan hasta alrededor del 80% de confluencia.
   4. Paso una o dos veces para ajustar el estado del hESC.
      NOTA: La forma más fácil de identificar el estado del hESC es la morfología.
   5. Cultivar las células H9 indiferenciadas en una placa de 6 pocillos hasta que alcancen el 80% de confluencia.
   6. Cambiar el medio 2 h antes de la nucleofección con 2 mL de medio de cultivo ncEpic-hiPSC/hESC fresco mezclado con 10 μM de Y-27632 y precubrir un pocillo de una placa de 12 pocillos utilizando una matriz de membrana basal reducida con factor de crecimiento al 1%.
   7. Aspirar el medio y enjuagar con 1 mL de DPBS precalentado.
   8. Retirar el DPBS e incubar con 1 ml de enzima de disociación celular (ver Tabla de materiales) durante 3,5 min a 37 °C.
   9. Añadir 1 ml de medio de cultivo ncEpic-hiPSC/hESC fresco a las células y pipetear dos veces para convertir las células H9 en una suspensión de una sola célula.
   10. Extraer 100 μL de la mezcla para el recuento celular y transferir el resto a un tubo de centrífuga de 15 ml que contenga otros 2 ml de medio de cultivo ncEpic-hiPSC/hESC en su interior.
   11. Centrifugar a 200 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender alrededor de 2 x 10⁶ células en un volumen de reacción de 100 μL. De acuerdo con el protocolo del fabricante, optimice el volumen para las células, plásmidos, nucleofector y condiciones de reacción. Consulte la Tabla de materiales para el sistema de nucleofección utilizado en este protocolo.
       NOTA: Generalmente, las burbujas no están permitidas durante la nucleofección.
   12. Después de la transfección, transfiera las células a la placa prerecubierta de 12 pocillos, complemente con 1,5 ml de medio de cultivo ncEpic-hiPSC/hESC y 10 μM de Y-27632, y luego cultive las células en una incubadora de_CO2 a 37 °C, al 5%.
   13. Cambie el medio diariamente. Después de 48 h, añadir 2 μg/ml de puromicina para la selección celular alrededor de una semana.
       NOTA: Numerosas células mueren durante los primeros 3 días. Las células restantes pueden proliferar y generarse en colonias en la semana siguiente después de la selección de puromicina. En la semana de selección, asegúrese de que el medio siempre contenga 2 μg/ml de puromicina.
   14. Elija las colonias manualmente bajo un microscopio.
       NOTA: La morfología de la colonia es la misma que la de la colonia hES. Cortar las colonias en trozos (2-6 trozos por colonia) con una punta de pipeta blanca/normal de 10 μL en el medio y transferir una colonia a un pocillo precubierto de una placa de 12 pocillos.
   15. Primero, identificar las mutaciones RB1 y las situaciones fuera del objetivo (Tabla 1), y luego la pluripotencia para caracterizar la línea celular H9 knockout RB1.
       NOTA: Detecte las mutaciones RB1 y las situaciones fuera del objetivo mediante PCR y secuenciación de Sanger. Identificar los marcadores de pluripotencia mediante RT-PCR e Inmunofluorescencia.

2. Generación de retinoblastoma humano

1. Mantenimiento de RB1-KO hESC.
   1. Cultive las células H9 editadas genéticamente en una matriz de membrana basal reducida con factor de crecimiento recubierta en placa de 6 pocillos con 2 ml de medio de cultivo ncEpic-hiPSC/hESC y cambie el medio todos los días.
   2. Paso utilizando tampón EDTA durante 3,5 min a 37 °C o 5 min a RT.
      NOTA: El tampón EDTA es la mezcla de 1x DPBS, 5 mM EDTA y 0.9 mg / ml de NaCl.
2. Diferenciación de células retinianas.
   NOTA: Prepare el Medio I antes de la diferenciación. Para preparar el Medio I, mezcle 24.5 ml de Medio Eagle Modificado (DMEM)/Mezcla de nutrientes F-12 (F12) -Glutamina (1x) de Dulbecco, 24.5 ml de medio basal neuronal, 250 μL de suplemento 100x A, 500 μL de suplemento 50x B, 0.1 mM ß-mercaptoetanol y 250 μL de 100x L-glutamina. Precaliente todas las mezclas a RT antes de usarlas.
   1. Cultive el RB1-KO hESC al 80% de confluencia en un pocillo de una placa de 6 pocillos.
   2. Retire el medio y enjuague las células con 1 ml de 1x DPBS.
   3. Elevar las colonias celulares usando 1 ml de tampón dispasa (ver Tabla de materiales) durante 5 min a 37 °C.
      NOTA: Compruebe las colonias celulares bajo un microscopio. Por lo general, el borde de las colonias tarda 5 minutos en desplegarse.
   4. Aspire el tampón dispasa y enjuague suavemente las células una vez con 1 ml de 1x DPBS.
   5. Agregue 1 ml de Medio I en el pozo.
   6. Cortar las colonias en trozos (6-9 piezas por colonia) con una punta de pipeta blanca/normal de 10 μL en el medio.
      NOTA: Generalmente, alrededor del 60% -70% de las células se desprenden del pozo. Use un raspador de células para raspar las células restantes en el medio.
   7. Cosechar todas las células centrifugando en un tubo de 15 ml a 200 x g durante 5 min.
   8. Deje alrededor de 50 μL del sobrenadante para dispersar las células en el medio, y luego mezcle las células con 250 μL de matriz de membrana basal reducida por factor de crecimiento mediante agitación suave.
      NOTA: Mantenga la matriz de membrana basal reducida con factor de crecimiento a 4 °C o en el hielo antes de usarla. Si se alícuota y se almacena a -20 °C, colóquelo a 4 °C durante la noche o al menos 1 h antes de su uso.
   9. Mantener el tubo de 15 ml con las células suspendidas en una incubadora a 37 °C durante 20 min.
      NOTA: Asegúrese de que las células y el factor de crecimiento reducido de la matriz de la membrana basal formen un gel solidificado.
   10. Agregue 1 ml de medio I en el tubo de 15 ml y luego pipetea ligeramente el gel solidificado dos o tres veces para dispersar el grupo con una pipeta de 1 ml.
   11. Añadir 9 ml de Medio I y transferir la suspensión celular a una placa de cultivo celular de 10 cm.
   12. Mover el plato a una incubadora a 37 °C con 5% de_CO2 y establecer el día como día 0.
   13. Examine las células con un microscopio el día 1.
       NOTA: Se pueden observar miles de quistes huecos en el plato. En promedio, se observan de 3 a 4 quistes en una pieza de gel.
   14. Cambiar el medio el día 5. Recoja el sobrenadante en un tubo de 15 ml, espere a que los quistes se asienten en el fondo y luego retire el medio y reemplácelo con un nuevo medio I.
       NOTA: Si el medio se vuelve amarillo el día 4, cambie el medio el día 4, de lo contrario el día 5. Agregue 10 ml de Medium I fresco en el plato original. Cientos de quistes ya se han adherido a la superficie del cultivo; Manténgalos allí.
   15. Dispersar los quistes en el tubo en dos platos de 10 cm.
       NOTA: Asegúrese de que al menos 300 quistes estén en un plato. Si los quistes no son confluentes, no separe los quistes en otros platos; Devuélvalos al plato original de 10 cm.
   16. En el día 7, la mayoría de los quistes (por encima del 95%) se adhieren al plato, se extienden y forman colonias adherentes.
       NOTA: Ya en el día 3, se pueden observar las colonias adherentes.
   17. El día 10, cambie el medio con el medio I fresco. Asegúrese de que todos los quistes estén unidos al plato.
   18. Prepare el medio II antes del siguiente paso mezclando lo siguiente: 36 ml de DMEM, 12 ml de F12, 2% de suplemento B (v / v), 0.1 mM MEM solución de aminoácidos no esenciales (NEAA).
   19. Asegúrese de que las células estén dispersas entre el día 13 y el 17. Realice el siguiente paso el día 15 cuando las células estén dispersas pero no interactúen con las colonias vecinas.
   20. Enjuague las células una vez con 1 ml de DPBS y agregue 1 ml de solución de dispasa durante 5 minutos a 37 °C.
       NOTA: Dentro de 5 minutos, el borde de las celdas se eleva.
   21. Retire el tampón de dispasas y enjuague suavemente los cultivos con 1 ml de 1x DPBS.
   22. Añadir 10 ml de Medio II a cada plato de 10 cm y cultivar en una incubadora de_CO2 al 5% a 37 °C.
   23. Los cultivos adherentes se desprenden espontáneamente después de 24 h y se ensamblan en organoides retinianos.
       NOTA: Numerosas células que no forman los organoides morirían en los siguientes 2 días.
   24. Tres días después del desprendimiento, recoger las células de la placa de cultivo celular y dejar que los organoides se asienten en un tubo de 15 ml.
   25. Retire el sobrenadante del tubo y transfiera los organoides a una nueva placa no adherente (placa de Petri) con 10 ml de Medio II durante los siguientes cuatro días.
   26. Prepare el Medio III mezclando DMEM: F12 en una proporción de 3:1 (v/v), suplemento B al 2% (v/v), solución de aminoácidos no esenciales MEM de 0,1 mM (NEAA), suero fetal bovino al 8% (FBS) (v/v), 100 μM de taurina y 2 mM de glutamina.
   27. Una semana después del desprendimiento, cambie el medio a Medio III.
   28. A partir de este día, cultive los organoides en Medio III y refresque el medio dos veces por semana.
3. Establecimiento de la línea celular RB.
   NOTA: Todos los reactivos se precalientan en RT.
   1. En el día 90, los RB (80%-90%) abarcan los organoides retinianos. Por lo tanto, elija los organoides RB de 90 días para la generación de la línea celular RB.
   2. Prepare el medio 1640 mezclando el medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 con 10% FBS.
   3. Corte el RB en trozos (20-25 trozos por RB) con un cuchillo microquirúrgico bajo un microscopio en medio RPMI-1640.
   4. Retirar el medio RPMI-1640 y tratar las piezas con tripsina/EDTA al 0,25% durante 10 min a 37 °C.
   5. Añadir el medio RPMI-1640 para finalizar la reacción y centrifugar a 200 x g durante 5 min.
   6. Retire el sobrenadante y resuspenda las células en medio 1640 en un plato no adherente.
   7. La línea celular RB es un cultivo flotante. Cambie el medio dos veces por semana y pase las células RB dentro de 2 semanas.
      NOTA: La tasa de proliferación de las células RB primarias es bastante lenta.

Resultados

El procedimiento de generación de RB se dilucida en la Figura 1, que combina el cultivo adherente y flotante. Fue posible cosechar el RB humano de RB1-KO hESC y obtener la línea celular RB aislando los organoides RB.

Aquí, el protocolo proporciona los detalles de la diferenciación en diferentes etapas (Figura 2). Las esferas huecas se forman en los primeros 3 días que se adhieren a la superficie de cultivo y luego se exp...

Discusión

El retinoblastoma humano (RB) es causado por la inactivación de RB1 y la disfunción de la proteína Rb. En este protocolo, el RB1-KO hESC es el paso fundamental para la generación de RB en un plato. Mientras que incluso con RB1-^/- hESC, es posible que no haya formación de RB debido a los métodos de diferenciación de organoides^{retinianos 10}. En este protocolo, la transferencia de la cultura adherente a la cultura flotante es esencial en el proceso de dife...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023
Anti-ARR3	Sigma	HPA063129	Antibody
Anti-CRX (M02)	Abnove	ABN-H00001406-M02	Antibody
Anti-Ki67	Abcam	ab15580	Antibody
Anti-Syk (D3Z1E)	Cell Signaling Technology	13198	Antibody
BbsI	NEB	R3539S	Restriction enzymes
Dispase (1U/mL)	Stemcell Technologies	7923
DMEM basic	Gibco	10566-016
DMEM/F-12-GlutaMAX	Gibco	10565-042
DMSO	Sigma	D2650
DPBS	Gibco	C141905005BT
EDTA	Thermo	15575020
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells	Biological Industry	04-002-1A
Glutamine	Gibco	35050-061
Ham's F-12 Nutrient Mix (Hams F12)	Gibco	11765-054
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X)	Sigma	M7145
Neurobasal Medium	Gibco	21103-049
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S	Lonza	V4XP-3032	Nucleofection kit
Pen Strep	Gibco	15140-122
Puromycin	Gene Operation	ISY1130- 0025MG
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28104
ncEpic-hiPSC/hESC culture medium	Nuwacell	RP01001	ncEpic-hiPSC/hESC culture medium in 1.2.1
Growth factor reduced basement membrane matrix	BD	356231	Matrigel in 1.2.1
Cell dissociation enzyme	Gibco	12563-011	TrypLE Express in 1.2.8
RNeasy Midi Kit	QIAGEN	75144
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74104
Supplement A	Life Technologies	17502-048	N-2 Supplement (100X), liquid, supplemet in medum I
Supplement B	Life Technologies	17105-041	B-27 Supplement (50X),liquid, supplemet in medum I,II,III
T4 Polynucleotide Kinase	Life Technologies	EK0032
Taurine	Sigma	T-8691-25G
Y-27632 2HCl	Selleck	S1049
pX330-U6- Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro	Addgene	42230
Nucleofector 4D	Lonza
RPMI	Sigma	R0883-500ML