Reconstruire le rétinoblastome humain in vitro

Résumé

Nous décrivons une méthode de génération de rétinoblastome humain (RB) en introduisant des mutations bialléliques RB1 dans les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh). Les lignées cellulaires RB pourraient également être cultivées avec succès en utilisant le RB isolé dans une boîte.

Résumé

La RB humaine est un cancer pédiatrique, qui est mortel si aucun traitement n’est administré. Comme la RB provient de précurseurs de cônes, ce qui est relativement rare dans les modèles de rongeurs, en ce qui concerne les différences inter-espèces entre les humains et les rongeurs, un modèle de maladie dérivé de l’homme est plus bénéfique pour découvrir les mécanismes de la RB humaine et rechercher les cibles thérapeutiques. Ici, le protocole décrit la génération de deux lignées de CSEh génétiquement modifiées avec une mutation ponctuelle RB1 biallélique (RB1 Mut/^Mut) et une mutation knockout RB1 (RB1-^/-), respectivement. Au cours du processus de développement rétinien, la formation de RB est observée. Les lignées cellulaires RB sont également établies en se séparant des organoïdes RB. Au total, en différenciant les lignées de CSEh génétiquement modifiées en organoïdes rétiniens à l’aide d’un protocole de différenciation combinée 2D et 3D, nous avons réussi à reconstruire la RB humaine dans une boîte et à identifier son origine conique-précurseur. Il fournirait un modèle de maladie utile pour observer la genèse, la prolifération et la croissance du rétinoblastome, ainsi que pour développer de nouveaux agents thérapeutiques.

Introduction

Le rétinoblastome humain (RB) est une tumeur rare et mortelle dérivée des précurseurs du cône rétinien ^1,2,3, est le type le plus courant de malignité intraoculaire dans l’enfance⁴. L’inactivation homozygote du gène RB1 est la lésion génétique initiatrice de RB⁵. Cependant, les souris porteuses de mutations RB1 ne parviennent pas à former la tumeur rétinienne². Bien que les tumeurs de souris puissent être générées avec la combinaison de mutations Rb1 et d’autres modifications génétiques, elles n’ont toujours pas les caractéristiques de RB⁶ humain. Grâce au développement de la différenciation organoïde rétinienne, le RB dérivé de l’hESC a pu être obtenu, affichant les caractères de RB¹ humain.

De nombreux protocoles de différenciation organoïde rétinienne ont été établis au cours de la dernière décennie, notamment 2D⁷, 3D⁸ et une combinaison de 2D et 3D⁹. La méthode utilisée ici pour générer le RB humain est la consolidation de la culture adhérente et de la culture flottante⁹. En différenciant les CSEh mutés RB1 en organoïdes rétiniens, la formation de RB est détectée vers le jour 45, puis elle prolifère rapidement vers le jour 60. Au jour 90, l’isolement des RB et la génération de la lignée cellulaire RB sont possibles; de plus, la RB entoure presque tous les organoïdes rétiniens au jour 120.

La RB dérivée de la CSEh est un modèle innovant pour explorer l’origine, la tumorigenèse et les traitements de la RB. Dans ce protocole, la génération de CSEh d’édition de gènes, la différenciation de RB et la caractérisation de RB sont décrites en détail.

Protocole

Cette étude est approuvée par le Comité d’éthique institutionnel de l’hôpital Tongren de Pékin, Capital Medical University. Les CSEh H9 sont obtenues auprès de l’Institut de recherche WiCell.

1. Génération de CSEh avec mutation RB1

1. Vecteur de ciblage CRISPR/Cas9 pour le KO (KO) de RB1.
   1. Concevez une paire d’ARNg. Pour l’ablation de RB1, cibler le premier exon de ce gène. La séquence d’amorce avant est CACCGCGGTGGCGGCCGTTTTTTTCGG, et la séquence d’amorce inverse est AAACCCGAAAAACGGCCGCCACCGC.
      REMARQUE: Pour la mutation RB1 spécifique, un modèle réparé est également requis. Dans ce protocole, la lignée cellulaire RB1-KO est utilisée comme exemple.
   2. Diger 1 μg de pX330-U6-Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro avec des enzymes de restriction BbsI (voir le tableau des matières) pendant 30 min à 37 °C en suivant les instructions du fabricant.
   3. Purifier les plasmides digérés à l’aide d’un kit de purification selon les instructions du fabricant.
      NOTE: Les réactions enzymatiques peuvent être nettoyées directement sans gel d’agarose à l’aide de la trousse de purification (voir le tableau des matériaux).
   4. Phosphoryler et recuire chaque paire d’oligos à l’aide de la kinase polynucléotidique T4 (PNK) (Table of Materials) avec la réaction comprenant 1 μL d’oligo1 (100 μM), 1 μL d’oligo2 (100 μM), 1 μL de 10x tampon de ligature T4, 6,5 μL de ddH2O et 0,5 μL deT4 PNK.
      REMARQUE : Les amorces avant et arrière de l’étape 1.1.1 sont une paire d’oligos. Phosphoryler et recuire les oligos dans un thermocycleur en utilisant les paramètres suivants: 37 °C pendant 30 min; 95 °C pendant 5 min; descendre jusqu’à 25 °C à 5 °C par minute.
   5. Diluer les oligos phosphorylés et recuits 200 fois en ajoutant 1 μL de réactif oligo à 199 μL d’eau exempte de nucléases à température ambiante (RT).
   6. Mettre en place la réaction de ligature et incuber à TA pendant 10 min en mélangeant les éléments suivants : 50 ng de plasmide digéré Bbs1 de l’étape 1.1.3, 1 μL d’oligo duplex de l’étape 1.1.5, 5 μL de tampon de ligature 2x, 1 μL de ligase et compléter jusqu’à 10 μL avec de l’eau sans nucléase.
   7. Transformez le mélange de ligature et séquencez les colonies positives pour l’étape suivante.
      REMARQUE: Utilisez l’amorce U6 avant ou arrière pour le séquençage.
      1. Décongeler les cellules compétentes sur la glace.
      2. Prélever 50 μL des cellules compétentes dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL.
      3. Ajouter 1 μL du mélange de ligature de l’étape 1.1.6 dans les cellules compétentes.
      4. Mélanger doucement en remontant et descendant le tube trois fois.
         REMARQUE: Ne pas vortex.
      5. Placer le mélange sur la glace pendant 30 min.
      6. Choc thermique du mélange à 42 °C pendant 90 s.
      7. Ajouter 950 μL de bouillon Luria-Bertani (LB) à température ambiante sans antibiotique dans le tube.
      8. Placer le tube dans un agitateur à 300 tr/min à 37 °C pendant 60 min.
      9. Réchauffer les plaques LB (peptone, peptone de caséine, chlorure de sodium, agar-agar et ampicilline) à 37 °C à l’avance.
      10. Étaler 50-100 μL des cellules et du mélange de ligature sur les plaques à TA.
      11. Incuber les plaques pendant la nuit à 37 °C.
      12. Prélever 12 colonies dans la plaque et les transférer dans le milieu LB avec de l’ampicilline. Placer le milieu sur un shaker à 300 tr/min pendant 60 min.
      13. Utiliser 1 μL de la solution bactérienne (de l’étape 1.1.7.12) comme modèle pour la PCR et sélectionner les colonies positives.
      14. Séquencez les colonies positives par les amorces U6, utilisez la colonie avec les séquences d’ARNg conçues à l’étape suivante.
   8. Extraire le plasmide à l’aide d’un kit midi (voir Tableau des matériaux).
      NOTE: La qualité et la quantité du plasmide à l’aide d’un mini kit ne sont pas suffisantes pour l’expérience de nucléofection suivante. Le kit midi ou maxi est plus adapté que le mini kit.
2. Culture HESC et nucléofection.
   REMARQUE: Préchauffez tous les réactifs à RT.
   1. Décongeler 1 x 10 6 cellules H9 dans une plaque pré-enduite de⁶ puits avec 10 μM Y-27632 (inhibiteur de ROCK) et 2 mL de milieu de culture ncEpic-hiPSC/CSEh frais.
      REMARQUE : Enduire la plaque à 6 puits d’une matrice membranaire basale à facteur de croissance réduit de 1 % pendant au moins 30 minutes à 37 °C avant utilisation.
   2. Le lendemain, retirez le surnageant, rincez les cellules avec 1x solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco, puis ajoutez 2 ml de milieu de culture frais ncEpic-hiPSC/hESC.
   3. Changez le milieu tous les jours avec 2 ml de milieu de culture frais ncEpic-hiPSC/hESC dans les 3 à 5 jours suivants jusqu’à ce que les cellules atteignent une confluence d’environ 80%.
   4. Passage une ou deux fois pour ajuster l’état du CSEh.
      NOTE: Le moyen le plus simple d’identifier l’état du CSEh est la morphologie.
   5. Culture des cellules H9 indifférenciées dans une plaque à 6 puits jusqu’à ce qu’elles atteignent 80% de confluence.
   6. Changer le milieu 2 h avant la nucléofection avec 2 mL de milieu de culture ncEpic-hiPSC/hESC frais mélangé à 10 μM de Y-27632 et précouvrir un puits d’une plaque de 12 puits en utilisant une matrice membranaire basale à facteur de croissance réduit de 1 %.
   7. Aspirer le milieu et rincer avec 1 mL de DPBS préchauffé.
   8. Retirer le DPBS et incuber avec 1 mL d’enzyme de dissociation cellulaire (voir le tableau des matières) pendant 3,5 min à 37 °C.
   9. Ajouter 1 mL de milieu de culture ncEpic-hiPSC/hESC frais aux cellules et pipeter deux fois pour transformer les cellules H9 en une seule suspension cellulaire.
   10. Prélever 100 μL du mélange pour le comptage cellulaire et transférer le reste dans un tube centrifuge de 15 mL contenant 2 mL supplémentaires de milieu de culture ncEpic-hiPSC/hESC à l’intérieur.
   11. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min. Retirer le surnageant et remettre en suspension environ 2 x 10⁶ cellules dans un volume de réaction de 100 μL. Selon le protocole du fabricant, optimiser le volume pour les cellules, les plasmides, le nucléofector et les conditions de réaction. Voir le tableau des matériaux pour le système de nucléofection utilisé dans ce protocole.
       REMARQUE: Généralement, les bulles ne sont pas autorisées pendant la nucléofection.
   12. Après la transfection, transférer les cellules dans la plaque précouverte de 12 puits, compléter avec 1,5 mL de milieu de culture ncEpic-hiPSC/hESC et 10 μM de Y-27632, puis cultiver les cellules dans un incubateur à 37 °C, 5% de CO₂ .
   13. Changez le support tous les jours. Après 48 h, ajouter 2 μg/mL de puromycine pour la sélection cellulaire environ une semaine.
       REMARQUE: De nombreuses cellules meurent au cours des 3 premiers jours. Les cellules restantes peuvent proliférer et se transformer en colonies la semaine suivante après la sélection de la puromycine. Au cours de la semaine de sélection, assurez-vous que le milieu contient toujours 2 μg/mL de puromycine.
   14. Choisissez les colonies manuellement au microscope.
       NOTE: La morphologie de la colonie est la même que celle de la colonie hES. Couper les colonies en morceaux (2 à 6 morceaux par colonie) à l’aide d’une pointe de pipette blanche/normale de 10 μL dans le milieu et transférer une colonie dans un puits préenduit d’une plaque de 12 puits.
   15. Tout d’abord, identifier les mutations RB1 et les situations hors cible (tableau 1), puis la pluripotence pour caractériser la lignée cellulaire H9 knockout RB1.
       REMARQUE: Détectez les mutations RB1 et les situations hors cible à l’aide de la PCR et du séquençage de sanger. Identifier les marqueurs de pluripotence par RT-PCR et immunofluorescence.

2. Génération du rétinoblastome humain

1. Maintenance de RB1-KO hESC.
   1. Cultivez les cellules H9 génétiquement modifiées dans une plaque à 6 puits recouverte d’une matrice membranaire basale à facteur de croissance réduit avec 2 mL de milieu de culture ncEpic-hiPSC/hESC et changez le milieu tous les jours.
   2. Passage à l’aide d’un tampon EDTA pendant 3,5 min à 37 °C ou 5 min à TA.
      REMARQUE: Le tampon EDTA est le mélange de 1x DPBS, 5 mM EDTA et 0,9 mg / mL de NaCl.
2. Différenciation des cellules rétiniennes.
   NOTE: Préparer le milieu I avant la différenciation. Pour préparer le milieu I, mélanger 24,5 mL de milieu aigle modifié (DMEM)/mélange nutritif F-12(F12)-glutamine (1x) de Dulbecco, 24,5 mL de milieu basal neuronal, 250 μL de supplément A 100x, 500 μL de supplément B 50x, 0,1 mM ß-mercaptoéthanol et 250 μL de 100x L-glutamine. Préchauffer tous les mélanges à TA avant utilisation.
   1. Augmenter le CSEh RB1-KO à 80% de confluence dans un puits d’une plaque de 6 puits.
   2. Retirer le milieu et rincer les cellules avec 1 mL de 1x DPBS.
   3. Élever les colonies cellulaires à l’aide de 1 mL de tampon de dispase (voir le tableau des matières) pendant 5 min à 37 °C.
      REMARQUE: Vérifiez les colonies cellulaires au microscope. Habituellement, il faut 5 minutes pour que le bord des colonies se déploie.
   4. Aspirer le tampon de dispase et rincer doucement les cellules une fois avec 1 mL de 1x DPBS.
   5. Ajouter 1 mL de Medium I dans le puits.
   6. Couper les colonies en morceaux (6-9 morceaux par colonie) avec un embout de pipette blanc/normal de 10 μL dans le milieu.
      REMARQUE: En général, environ 60% à 70% des cellules se détachent du puits. Utilisez un grattoir de cellules pour gratter les cellules restantes dans le milieu.
   7. Récolter toutes les cellules par centrifugation dans un tube de 15 mL à 200 x g pendant 5 min.
   8. Laisser environ 50 μL du surnageant disperser les cellules dans le milieu, puis mélanger les cellules avec 250 μL de matrice membranaire basale réduite en facteur de croissance par agitation douce.
      REMARQUE : Conserver la matrice de membrane basale à facteur de croissance réduit à 4 °C ou sur la glace avant utilisation. S’il est aliquote et conservé à -20 °C, placez-le à 4 °C pendant une nuit ou au moins 1 h avant utilisation.
   9. Conserver le tube de 15 ml avec les cellules en suspension dans un incubateur à 37 °C pendant 20 min.
      NOTE: Assurez-vous que les cellules et la matrice membranaire basale réduite du facteur de croissance forment un gel solidifié.
   10. Ajouter 1 mL de Medium I dans le tube de 15 mL, puis pipeter légèrement le gel solidifié deux à trois fois pour disperser la touffe avec une pipette de 1 mL.
   11. Ajouter 9 mL de milieu I et transférer la suspension cellulaire dans une boîte de culture cellulaire de 10 cm.
   12. Déplacez la capsule dans un incubateur à 37 °C avec 5% de CO₂ et définissez le jour comme jour 0.
   13. Examinez les cellules à l’aide d’un microscope le jour 1.
       REMARQUE: Des milliers de kystes creux ont pu être observés dans le plat. En moyenne, 3 à 4 kystes sont observés dans un morceau de gel.
   14. Changez le support le jour 5. Recueillir le surnageant dans un tube de 15 mL, attendre que les kystes se déposent au fond, puis retirer le milieu et le remplacer par du milieu I frais.
       REMARQUE: Si le milieu devient jaune le jour 4, changez-le le jour 4, sinon le jour 5. Ajouter 10 ml de Medium I frais dans le plat original. Des centaines de kystes se sont déjà attachés à la surface de culture; Gardez-les là.
   15. Disperser les kystes dans le tube en deux plats de 10 cm.
       REMARQUE: Assurez-vous qu’au moins 300 kystes sont dans un plat. Si les kystes ne sont pas confluents, ne séparez pas les kystes dans d’autres plats; Remettez-les dans le plat original de 10 cm.
   16. Au jour 7, la plupart des kystes (supérieurs à 95%) s’attachent au plat, s’étendent et forment des colonies adhérentes.
       NOTE: Dès le jour 3, les colonies adhérentes peuvent être observées.
   17. Le jour 10, changez le milieu avec du milieu I frais. Assurez-vous que tous les kystes sont attachés au plat.
   18. Préparer le milieu II avant l’étape suivante en mélangeant les éléments suivants : 36 mL de DMEM, 12 mL de F12, 2 % de supplément B (v/v), 0,1 mM de solution d’acides aminés non essentiels MEM (NEAA).
   19. Assurez-vous que les cellules sont réparties entre le jour 13 et le jour 17. Effectuez l’étape suivante le jour 15 lorsque les cellules sont dispersées mais n’interagissent pas avec les colonies voisines.
   20. Rincer les cellules une fois avec 1 mL de DPBS et ajouter 1 mL de solution de dispase pendant 5 min à 37 °C.
       REMARQUE: Dans les 5 minutes, le bord des cellules s’élève.
   21. Retirer le tampon de dispase et rincer doucement les cultures avec 1 mL de 1x DPBS.
   22. Ajouter 10 ml de Medium II à chaque plat de 10 cm et cultiver dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO₂ .
   23. Les cultures adhérentes se détachent spontanément après 24 heures et s’assemblent en organoïdes rétiniens.
       REMARQUE: De nombreuses cellules qui ne forment pas les organoïdes mourraient dans les 2 jours suivants.
   24. Trois jours après le détachement, prélever les cellules de la boîte de culture cellulaire et laisser les organoïdes se déposer dans un tube de 15 mL.
   25. Retirer le surnageant du tube et transférer les organoïdes dans une nouvelle boîte non adhérente (boîte de Pétri) avec 10 ml de milieu II pendant les quatre jours suivants.
   26. Préparer le milieu III en mélangeant DMEM : F12 dans un rapport de 3:1 (v/v), supplément B à 2 % (v/v), solution d’acides aminés non essentiels MEM à 0,1 mM (NEAA), sérum fœtal bovin (FBS) (v/v), 100 μM de taurine et 2 mM de glutamine.
   27. Une semaine après le détachement, changez le milieu en moyen III.
   28. À partir de ce jour, cultivez les organoïdes dans le milieu III et rafraîchissez le milieu deux fois par semaine.
3. Mise en place de la lignée cellulaire RB.
   REMARQUE: Tous les réactifs sont préchauffés à RT.
   1. Au jour 90, les RB (80%-90%) englobent les organoïdes rétiniens. Par conséquent, choisissez les organoïdes RB de 90 jours pour la génération de la lignée cellulaire RB.
   2. Préparez le milieu 1640 en mélangeant le milieu Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 avec 10% FBS.
   3. Couper le RB en morceaux (20-25 morceaux par RB) avec un couteau microchirurgical au microscope dans un milieu RPMI-1640.
   4. Retirer le milieu RPMI-1640 et traiter les morceaux avec 0,25% de trypsine/EDTA pendant 10 min à 37 °C.
   5. Ajouter le milieu RPMI-1640 pour terminer la réaction et centrifuger à 200 x g pendant 5 min.
   6. Retirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans un milieu 1640 dans un plat non adhérent.
   7. La lignée cellulaire RB est une culture flottante. Changez le milieu deux fois par semaine et passez les cellules RB dans les 2 semaines.
      REMARQUE: Le taux de prolifération des cellules RB primaires est assez lent.

Résultats

La procédure de génération RB est élucidée dans la figure 1, qui combine la culture adhérente et flottante. Il a été possible de récolter la RB humaine à partir de RB1-KO hESC et d’obtenir la lignée cellulaire RB en isolant les organoïdes RB.

Ici, le protocole fournit les détails de la différenciation en différentes étapes (Figure 2). Des sphères creuses se forment au cours des 3 premiers jours qui s’atta...

Discussion

Le rétinoblastome humain (RB) est causé par l’inactivation de RB1 et le dysfonctionnement de la protéine Rb. Dans ce protocole, le RB1-KO hESC est l’étape cruciale pour la génération de RB dans une boîte. Alors que même avec RB1-^/- hESC, il est possible qu’il n’y ait pas de formation de RB en raison des méthodes de différenciation organoïde rétinienne¹⁰. Dans ce protocole, le passage de la culture adhérente à la culture flottante est esse...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023
Anti-ARR3	Sigma	HPA063129	Antibody
Anti-CRX (M02)	Abnove	ABN-H00001406-M02	Antibody
Anti-Ki67	Abcam	ab15580	Antibody
Anti-Syk (D3Z1E)	Cell Signaling Technology	13198	Antibody
BbsI	NEB	R3539S	Restriction enzymes
Dispase (1U/mL)	Stemcell Technologies	7923
DMEM basic	Gibco	10566-016
DMEM/F-12-GlutaMAX	Gibco	10565-042
DMSO	Sigma	D2650
DPBS	Gibco	C141905005BT
EDTA	Thermo	15575020
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells	Biological Industry	04-002-1A
Glutamine	Gibco	35050-061
Ham's F-12 Nutrient Mix (Hams F12)	Gibco	11765-054
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X)	Sigma	M7145
Neurobasal Medium	Gibco	21103-049
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S	Lonza	V4XP-3032	Nucleofection kit
Pen Strep	Gibco	15140-122
Puromycin	Gene Operation	ISY1130- 0025MG
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28104
ncEpic-hiPSC/hESC culture medium	Nuwacell	RP01001	ncEpic-hiPSC/hESC culture medium in 1.2.1
Growth factor reduced basement membrane matrix	BD	356231	Matrigel in 1.2.1
Cell dissociation enzyme	Gibco	12563-011	TrypLE Express in 1.2.8
RNeasy Midi Kit	QIAGEN	75144
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74104
Supplement A	Life Technologies	17502-048	N-2 Supplement (100X), liquid, supplemet in medum I
Supplement B	Life Technologies	17105-041	B-27 Supplement (50X),liquid, supplemet in medum I,II,III
T4 Polynucleotide Kinase	Life Technologies	EK0032
Taurine	Sigma	T-8691-25G
Y-27632 2HCl	Selleck	S1049
pX330-U6- Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro	Addgene	42230
Nucleofector 4D	Lonza
RPMI	Sigma	R0883-500ML