体外重建人视网膜母细胞瘤

摘要

我们描述了一种通过在人胚胎干细胞（hESC）中引入双等位基因RB1突变来产生人视网膜母细胞瘤（RB）的方法。RB细胞系也可以在培养皿中使用分离的RB成功培养。

摘要

人类RB是小儿癌症，如果不进行治疗，它是致命的。由于RB起源于锥形前体，在啮齿动物模型中比较少见，同时关于人类与啮齿动物的种间差异，源自人类的疾病模型更有利于揭示人类RB的机制，寻找治疗目标。在此，该协议描述了两个基因编辑的hESC系的产生，分别具有双等位基因RB1点突变（RB1 Mut / ^Mut）和RB1敲除突变（RB1-^/-）。在视网膜发育过程中，观察到RB的形成。RB细胞系也是通过从RB类器官中分离而建立的。总之，通过使用2D和3D组合分化方案将基因编辑的hESC系分化为视网膜类器官，我们已经成功地在培养皿中重建了人类RB并确定了其锥体前体起源。它将为观察视网膜母细胞瘤的发生、增殖和生长以及进一步开发新型治疗剂提供有用的疾病模型。

引言

人视网膜母细胞瘤（RB）是一种罕见的致命肿瘤，来源于视网膜视锥细胞^前体1，²，^3，是儿童期最常见的眼内恶性肿瘤类型⁴。RB1 基因的纯合失活是 RB⁵ 的起始遗传病变。然而，具有RB1突变的小鼠无法形成视网膜肿瘤²。尽管小鼠肿瘤可以通过Rb1突变和其他基因修饰的组合产生，但它们仍然缺乏人类RB⁶的特征。由于视网膜类器官分化的发展，可以获得hESC衍生的RB，显示人类RB¹的特征。

在过去的十年中，已经建立了许多用于视网膜类器官分化的方案，包括2D⁷，3D⁸以及2D和3D⁹的组合。这里用于生成人类RB的方法是粘附培养物和^{浮动培养物}的合并9。通过将 RB1 突变的hESC分化为视网膜类器官，在第45天左右检测到RB的形成，然后在第60天左右迅速增殖。在第90天，可以分离RBs并生成RB细胞系;此外，RB在第120天包围几乎所有视网膜类器官。

hESC 衍生的 RB 是一种探索 RB 起源、肿瘤发生和治疗的创新模型。在该协议中，详细描述了基因编辑hESC的产生，RB的分化和RB的表征。

研究方案

本研究经首都医科大学附属北京同仁医院机构伦理委员会批准。H9 hESCs是从WiCell研究所获得的。

1. RB1 突变hESC的产生

1. 用于敲除RB1（KO）的CRISPR / Cas9靶向载体。
   1. 设计一对sgRNA。对于 RB1的消融，靶向该基因的第一个外显子。正向引物序列为CACCGCGGTGGCGGCCGTTTTTCGG，反向引物序列为AAACCCGAAAAACCCGCCCCACCGC。
      注意:对于特定的 RB1 突变，还需要修复的模板。在该协议中， 使用RB1-KO细胞系作为示例。
   2. 按照制造商的说明，在37°C下用BbsI限制性内切酶（参见 材料表）消化1μgpX330-U6-嵌合BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro30分钟。
   3. 根据制造商的说明，使用纯化试剂盒纯化消化的质粒。
      注意:酶促反应可以使用纯化试剂盒直接净化，无需琼脂糖凝胶（见 材料表）。
   4. 使用 T4 多核苷酸激酶 （PNK）（材料表）磷酸化和退火每对寡核苷酸，反应包括 1 μL 寡核苷酸1 （100 μM）、1 μL 寡核苷酸 2 （100 μM）、1 μL 10x T4 连接缓冲液、6.5 μL ddH₂O 和 0.5 μL T4 PNK。
      注意:步骤1.1.1中的正向和反向引物是一对寡核苷酸。使用以下参数在热循环仪中磷酸化和退火寡核苷酸:37°C30分钟;95°C5分钟;以每分钟5°C的速度下降至25°C。
   5. 通过在室温 （RT） 下将 1 μL 寡核苷酸试剂加入 199 μL 无核酸酶水中，将磷酸化和退火的寡核苷酸稀释 200 倍。
   6. 设置连接反应并通过混合以下内容在室温下孵育10分钟:步骤1.1.3中的50ng Bbs1消化质粒，步骤1.1.5中的1μL寡核苷酸双链，5μL 2x连接缓冲液，1μL连接酶，并使用无核酸酶水加至10μL。
   7. 转化连接混合物并对阳性菌落进行测序以进行下一步。
      注意:使用 U6 正向或反向引物进行测序。
      1. 在冰上解冻感受态细胞。
      2. 在 1.5 mL 微量离心管中取 50 μL 感受态细胞。
      3. 将步骤 1.1.6 中的 1 μL 连接混合物加入感受态细胞中。
      4. 通过上下移液管三次轻轻混合。
         注意:不要涡旋。
      5. 将混合物放在冰上30分钟。
      6. 在42°C下热冲击混合物90秒。
      7. 向试管中加入 950 μL 不含抗生素的室温 Luria-Bertani （LB） 肉汤。
      8. 将管子置于37°C下以300rpm的振荡器中放置60分钟。
      9. 提前将LB板（蛋白胨，酪蛋白蛋白胨，氯化钠，琼脂和氨苄西林）加热至37°C。
      10. 在室温下将 50-100 μL 细胞和连接混合物散布到平板上。
      11. 将板在37°C孵育过夜。
      12. 从平板中取出12个菌落，并用氨苄西林将它们转移到LB培养基中。将培养基放在300rpm的摇床上60分钟。
      13. 使用 1 μL 细菌溶液（来自步骤 1.1.7.12）作为 PCR 模板并选择阳性菌落。
      14. 通过U6引物对阳性菌落进行测序，在下一步中使用具有设计的sgRNA序列的菌落。
   8. 使用中型试剂盒提取质粒（参见材料表）。
      注意:使用迷你试剂盒的质粒的质量和数量不足以进行以下核转染实验。迷笛或超长套件比迷你套件更合适。
2. HESC培养和核细胞移植。
   注意:将所有试剂预热至室温。
   1. 将 1 x 10 6 H9 细胞解冻到含有 10 μM Y-27632（ROCK 抑制剂）和 2 mL 新鲜 ncEpic-hiPSC/hESC 培养基的预包被⁶ 孔板中。
      注意:使用前在37°C下用1%生长因子降低的基底膜基质涂覆6孔板至少30分钟。
   2. 第二天，除去上清液，用 1x Dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 冲洗细胞，然后加入 2 mL 新鲜的 ncEpic-hiPSC/hESC 培养基。
   3. 在接下来的3-5天内，每天用2mL新鲜的ncEpic-hiPSC / hESC培养基更换培养基，直到细胞生长至约80%汇合。
   4. 传代一次或两次以调整hESC的状态。
      注意:识别hESC状态的最简单方法是形态。
   5. 在6孔板中培养未分化的H9细胞，直到它们达到80%汇合。
   6. 在核转染前2小时更换培养基，用2mL新鲜的ncEpic-hiPSC / hESC培养基与10μMY-27632混合，并使用1%生长因子降低基底膜基质预涂12孔板的一个孔。
   7. 吸出培养基并用 1 mL 预热的 DPBS 冲洗。
   8. 取出DPBS并与1mL细胞解离酶（参见 材料表）在37°C孵育3.5分钟。
   9. 向细胞中加入 1 mL 新鲜的 ncEpic-hiPSC/hESC 培养基并移液两次，使 H9 细胞制成单细胞悬液。
   10. 取出 100 μL 混合物进行细胞计数，并将其余的转移到 15 mL 离心管中，其中装有另外 2 mL ncEpic-hiPSC/hESC 培养基。
   11. 以200 x g 离心5分钟。除去上清液，将大约 2 x 10⁶ 个细胞重悬到 100 μL 反应体积中。根据制造商的方案，优化细胞、质粒、核子和反应条件的体积。有关本协议中使用的核连接系统，请参阅 材料表 。
       注意:通常，在核转过程中不允许有气泡。
   12. 转染后，将细胞转移到预包被的12孔板中，补充1.5mL ncEpic-hiPSC / hESC培养基和10μMY-27632，然后在37°C，5%CO₂ 培养箱中培养细胞。
   13. 每天更换培养基。48小时后，加入2μg/ mL嘌呤霉素用于细胞选择约一周。
       注意:许多细胞在前 3 天内死亡。剩余的细胞可能会在嘌呤霉素选择后的下周内增殖并生成集落。在选择周内，确保培养基始终含有 2 μg/mL 嘌呤霉素。
   14. 在显微镜下手动挑选菌落。
       注意:菌落形态与hES菌落相同。在培养基中用 10 μL 白色/正常移液器吸头将菌落切成碎片（每个菌落 2-6 个），并将一个菌落转移到 12 孔板的一个预包被孔中。
   15. 首先，鉴定RB1突变和脱靶情况（表1），然后多能性表征RB1敲除H9细胞系。
       注意:使用PCR和sanger测序检测 RB1 突变和脱靶情况。通过 RT-PCR 和免疫荧光鉴定多能性标志物。

2.人视网膜母细胞瘤的产生

1. 维持RB1-KO hESC。
   1. 在生长因子降低的基底膜基质中培养基因编辑的H9细胞，用2mL ncEpic-hiPSC / hESC培养基包被6孔板，并每天更换培养基。
   2. 使用EDTA缓冲液在37°C下传代3.5分钟或在室温下5分钟。
      注意:EDTA缓冲液是1x DPBS，5 mM EDTA和0.9 mg / mL NaCl的混合物。
2. 视网膜细胞分化。
   注意:分化前准备培养基I。制备培养基 I，混合 24.5 mL Dulbecco 改良鹰培养基 （DMEM）/营养混合物 F-12（F12）-谷氨酰胺 （1x）、24.5 mL 神经元基础培养基、250 μL 100x 补充剂 A、500 μL 50x 补充剂 B、0.1 mM ß-巯基乙醇和 250 μL 100x L-谷氨酰胺。使用前将所有混合物预热至室温。
   1. 将 RB1-KO hESC在6孔板的一个孔中生长至80%汇合。
   2. 取出培养基并用 1 mL 的 1x DPBS 冲洗细胞。
   3. 使用1mL分散酶缓冲液（参见 材料表）在37°C下升高细胞集落5分钟。
      注意:在显微镜下检查细胞集落。通常，菌落边缘需要 5 分钟才能展开。
   4. 吸出分散酶缓冲液，并用 1 mL 的 1x DPBS 轻轻冲洗细胞一次。
   5. 将 1 mL 培养基 I 加入孔中。
   6. 将菌落切成块（每个菌落 6-9 片），培养基中装有 10 μL 白色/普通移液器吸头。
      注意:通常，大约60%-70%的细胞从孔中分离。使用细胞刮刀刮除培养基中剩余的细胞。
   7. 通过在 15 mL 管中以 200 x g 离心 5 分钟来收获所有细胞。
   8. 留下约 50 μL 上清液以将细胞分散在培养基中，然后通过轻轻搅拌将细胞与 250 μL 生长因子还原基底膜基质混合。
      注意:使用前将生长因子降低的基底膜基质保持在4°C或冰上。如果将其等分并储存在-20°C，则在使用前至少1小时将其置于4°C过夜或至少1小时。
   9. 将带有悬浮细胞的15mL管保持在37°C培养箱中20分钟。
      注意:确保细胞和生长因子还原的基底膜基质形成固化凝胶。
   10. 将 1 mL 培养基 I 加入 15 mL 管中，然后用 1 mL 移液管轻轻移取固化凝胶 2 至 3 次以分散团块。
   11. 加入 9 mL 培养基 I 并将细胞悬液转移到 10 cm 细胞培养皿中。
   12. 将培养皿移至含有5%CO₂ 的37°C培养箱中，并将日期设置为第0天。
   13. 在第1天使用显微镜检查细胞。
       注意:在培养皿中可以观察到数千个空心囊肿。平均而言，在一块凝胶中观察到3至4个囊肿。
   14. 在第 5 天更换培养基。将上清液收集到15mL管中，等待囊肿沉降到底部，然后取出培养基并用新鲜的培养基I代替。
       注意:如果培养基在第 4 天变黄，请在第 4 天更换培养基，否则在第 5 天更换培养基。将 10 mL 新鲜培养基 I 加入原培养皿中。数百个囊肿已经附着在培养表面;把它们留在那里。
   15. 将管中的囊肿分散到两个10厘米的培养皿中。
       注意:确保培养皿中至少有 300 个囊肿。如果囊肿不汇合，不要将囊肿分成其他菜肴;将它们放回原来的 10 厘米培养皿中。
   16. 在第7天，大多数囊肿（95%以上）附着在培养皿上，扩散并形成粘附菌落。
       注意:早在第3天，就可以观察到粘附的菌落。
   17. 在第10天，用新鲜的培养基I更换培养基，确保所有囊肿都附着在培养皿上。
   18. 在下一步之前，通过混合以下内容制备培养基II:36 mL DMEM，12 mL F12，2%补充剂B （v / v），0.1 mM MEM非必需氨基酸溶液（NEAA）。
   19. 确保在第13-17天之前将细胞分散开来。在第15天执行下一步，当细胞分散但不与邻近的菌落相互作用时。
   20. 用1mL DPBS冲洗细胞一次，并在37°C下加入1mL分散酶溶液5分钟。
       注意:在5分钟内，细胞边缘升高。
   21. 取出分散酶缓冲液，并用 1 mL 的 1x DPBS 轻轻冲洗培养物。
   22. 向每个 10 cm 培养皿中加入 10 mL 培养基 II，并在 37 °C、5% CO₂ 培养箱中培养。
   23. 贴壁培养物在24小时后自发脱落并组装成视网膜类器官。
       注意:许多不形成类器官的细胞将在接下来的 2 天内死亡。
   24. 分离三天后，从细胞培养皿中收集细胞，并使类器官沉淀在 15 mL 管中。
   25. 从管中取出上清液，并将类器官转移到装有10mL培养基II的新非粘附培养皿（培养皿）中，持续四天。
   26. 通过混合 DMEM:3:1 比例 （v/v）、2% 补充剂 B （v/v）、0.1 mM MEM 非必需氨基酸溶液 （NEAA）、8% 胎牛血清 （FBS） （v/v）、100 μM 牛磺酸和 2 mM 谷氨酰胺混合制备培养基 III。
   27. 分离一周后，将培养基更改为中III。
   28. 从这一天起，在培养基III中培养类器官，并每周更新培养基两次。
3. 建立RB细胞系。
   注意:所有试剂均在室温下预热。
   1. 在第90天，RBs（80%-90%）包含视网膜类器官。因此，选择90天的RB类器官来生成RB细胞系。
   2. 通过将罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）-1640培养基与10%FBS混合来制备1640培养基。
   3. 在RPMI-1640培养基的显微镜下用显微手术刀将RB切成碎片（每个RB20-25块）。
   4. 除去RPMI-1640培养基，并在37°C下用0.25%胰蛋白酶/ EDTA处理碎片10分钟。
   5. 加入RPMI-1640培养基结束反应，并以200× g 离心5分钟。
   6. 除去上清液并将细胞重悬于非贴壁培养皿中的1640培养基中。
   7. RB细胞系是一种浮动培养物。每周更换培养基两次，并在2周内传代RB细胞。
      注意:原代RB细胞的增殖速度非常慢。

结果

RB生成的过程在 图1中阐明，它结合了贴壁和浮动培养物。可以从 RB1-KO hESC中收获人RB，并通过分离RB类器官获得RB细胞系。

在这里，协议提供了不同阶段分化的细节（图2）。在前3天内形成空心球，附着在培养表面上然后膨胀（图2A-E）。从第15天开始，细胞升高并在悬浮中培养（

讨论

人视网膜母细胞瘤（RB）是由 RB1 失活和Rb蛋白功能障碍引起的。在该协议中， RB1-KO hESC是在培养皿中产生RB的关键步骤。虽然即使使用 RB1^-/- hESC，但由于视网膜类器官分化的方法，也有可能没有RB形成¹⁰。在该协议中，从贴壁培养到漂浮培养的转移在分化过程中至关重要。囊肿的密度、多能干细胞的类型和增殖速率都是影响脱离时间的变量。当细胞扩?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023
Anti-ARR3	Sigma	HPA063129	Antibody
Anti-CRX (M02)	Abnove	ABN-H00001406-M02	Antibody
Anti-Ki67	Abcam	ab15580	Antibody
Anti-Syk (D3Z1E)	Cell Signaling Technology	13198	Antibody
BbsI	NEB	R3539S	Restriction enzymes
Dispase (1U/mL)	Stemcell Technologies	7923
DMEM basic	Gibco	10566-016
DMEM/F-12-GlutaMAX	Gibco	10565-042
DMSO	Sigma	D2650
DPBS	Gibco	C141905005BT
EDTA	Thermo	15575020
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells	Biological Industry	04-002-1A
Glutamine	Gibco	35050-061
Ham's F-12 Nutrient Mix (Hams F12)	Gibco	11765-054
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X)	Sigma	M7145
Neurobasal Medium	Gibco	21103-049
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S	Lonza	V4XP-3032	Nucleofection kit
Pen Strep	Gibco	15140-122
Puromycin	Gene Operation	ISY1130- 0025MG
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28104
ncEpic-hiPSC/hESC culture medium	Nuwacell	RP01001	ncEpic-hiPSC/hESC culture medium in 1.2.1
Growth factor reduced basement membrane matrix	BD	356231	Matrigel in 1.2.1
Cell dissociation enzyme	Gibco	12563-011	TrypLE Express in 1.2.8
RNeasy Midi Kit	QIAGEN	75144
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74104
Supplement A	Life Technologies	17502-048	N-2 Supplement (100X), liquid, supplemet in medum I
Supplement B	Life Technologies	17105-041	B-27 Supplement (50X),liquid, supplemet in medum I,II,III
T4 Polynucleotide Kinase	Life Technologies	EK0032
Taurine	Sigma	T-8691-25G
Y-27632 2HCl	Selleck	S1049
pX330-U6- Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro	Addgene	42230
Nucleofector 4D	Lonza
RPMI	Sigma	R0883-500ML