Implantación directa de cánula en la Cisterna Magna de Cerdos

Resumen

Este artículo presenta un protocolo paso a paso para la implantación directa de cánulas en la cisterna magna de cerdos.

Resumen

El sistema glinfático es un sistema de eliminación de desechos en el cerebro que depende del flujo de líquido cefalorraquídeo (LCR) en espacios perivasculares unidos a astrocitos y se ha implicado en el aclaramiento de péptidos neurotóxicos como la beta amiloide. La función glinfática deteriorada exacerba la patología de la enfermedad en modelos animales de enfermedades neurodegenerativas, como el Alzheimer, lo que destaca la importancia de comprender este sistema de eliminación. El sistema glinfático a menudo se estudia mediante cánulaciones de cisterna magna (CMc), donde los trazadores se administran directamente en el líquido cefalorraquídeo (LCR). La mayoría de los estudios, sin embargo, se han llevado a cabo en roedores. Aquí, demostramos una adaptación de la técnica CMc en cerdos. Usando CMc en cerdos, el sistema glinfático se puede estudiar a una alta resolución óptica en cerebros giroencefálicos y, al hacerlo, cierra la brecha de conocimiento entre los roedores y los glinfáticos humanos.

Introducción

El líquido cefalorraquídeo (LCR) es un ultrafiltrato de sangre que se encuentra dentro y alrededor del sistema nervioso central (SNC)^1,2. Además de dar flotabilidad al cerebro o absorber fuerzas mecánicas dañinas, el LCR también juega un papel fundamental en la eliminación de desechos metabólicos del ^SNC3. La eliminación de residuos se ve facilitada por el sistema glinfático recientemente caracterizado que permite el flujo convectivo del LCR a través del parénquima cerebral a través de los espacios perivasculares (PVS), que rodean las arterias penetrantes3,4,5. Se ha demostrado que este proceso depende de la acuaporina-4 (AQP4), un canal de agua expresado principalmente en los extremos astrocíticos, unido al ^PVS4,6. El estudio del sistema glinfático se realiza mediante imágenes tanto in vivo como ex vivo, utilizando microscopía de luz avanzada o resonancia magnética (RM), tras la introducción de un marcador fluorescente/radiactivo o agente de contraste en el LCR7,8,9,10,11.

Una forma eficaz de introducir un trazador en el LCR sin sufrir daños en el parénquima cerebral es a través de la cánulación cisterna magna (CMc)^12,13. Una gran mayoría de todos los estudios glinfáticos, hasta ahora se han llevado a cabo en roedores y se han evitado en mamíferos superiores debido a la invasividad de CMc junto con la simplicidad práctica de trabajar con un mamífero pequeño. Además, los delgados cráneos de ratones permiten la obtención de imágenes in vivo sin necesidad de una ventana craneal y, posteriormente, permiten una extracción cerebral sin complicaciones11,14. Los experimentos realizados en humanos han arrojado valiosos datos macroscópicos in vivo sobre la función glinfática, pero se han basado en inyecciones de trazadores intratecales en la columna lumbar distal y, además, utilizan resonancia magnética que no produce la resolución suficiente para capturar la microanatomía del sistema glinfático7,15,16 . Comprender la arquitectura y la extensión del sistema glinfático en mamíferos superiores es esencial para su traducción a los humanos. Para facilitar la traducción glinfática a los seres humanos, es importante aplicar técnicas que se llevan a cabo en roedores a mamíferos superiores para permitir comparaciones directas del sistema glinfático entre especies de creciente cognición y complejidad ^cerebral17. Los cerebros de cerdos y humanos son giroencefálicos, poseen una neuroarquitectura plegada, mientras que los cerebros de roedores son lisencefálicos, por lo que tienen una diferencia sustancial entre sí. En términos del tamaño total, los cerebros de cerdo son, también, más comparables a los humanos, siendo 10-15 veces más pequeños que el cerebro humano, mientras que los cerebros de ratón son 3.000 veces más ^pequeños18. Al comprender mejor el sistema glinfático en grandes mamíferos, puede ser posible utilizar el sistema glinfático humano para futuras intervenciones terapéuticas en afecciones como accidente cerebrovascular, lesión cerebral traumática y neurodegeneración. CMc directo en cerdos in vivo es un método que permite la microscopía de luz de alta resolución del sistema glinfático en un mamífero superior. Además, debido al tamaño de los cerdos utilizados, es posible aplicar sistemas de monitoreo similares a los utilizados en cirugías humanas, lo que hace posible documentar y regular estrechamente las funciones vitales para evaluar cómo estas contribuyen a la función glinfática.

Protocolo

Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con la directiva europea 2010/63/UE y fueron aprobados por el Comité Ético de Investigación Animal de Malmö-Lund (Dnr 5.8.18-05527/2019) y se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del CODEX del Consejo de Investigación de Suecia.

1. Preparación

1. Trazador
   1. Preparar LCR artificial (126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM _NaH2PO4, 2 mM _MgCl2, 2 mM _CaCl2, 10 mM glucosa, 26 mM NaHCO3; pH 7,4)
   2. A 500 μL de LCR artificial, añadir 10 mg de albúmina de suero bovino (BSA) conjugado con Alexa Fluor 647 (BSA-647).
   3. Centrifugar a 5.000 x g durante 5 min y utilizar el sobrenadante.
2. Cánula
   1. Conecte una jeringa de 1 ml a la conexión Luer hembra de la línea intravenosa (IV), grifo de 3 vías con una extensión de 10 cm.
   2. Coloque una aguja de 18 G en el extremo masculino.
   3. Abra el bloqueo de parada de 3 vías para permitir la continuidad desde la aguja hasta la jeringa.
   4. Desenfundar cuidadosamente la aguja y aspirar aproximadamente 300 μL de solución salina en la vía intravenosa.
   5. Retire la aguja de la solución salina y proceda a introducir un poco de aire para crear una pequeña burbuja de aire (5-10 mm) en la línea IV.
   6. Coloque la aguja en el marcador y aspire los 500 μL del trazador. La solución salina en la línea IV debe estar visiblemente separada por una burbuja de aire.
   7. Deseche la aguja y cierre la cerradura de parada de 3 vías.
3. Animal
   1. Sedar a un cerdo mediante inyección intramuscular (i.m.) de tiletamina (3,75 mg/kg) y zolazepam (3,75 mg/kg) y dexmedetomidina (37,5 μg/kg). Espera a que quede inconsciente.
   2. Prepare una vía intravenosa insertando una cánula de 20 G en la vena del oído.
      NOTA: Asegúrese de que la cánula esté en la vena inyectando 5-10 ml de solución salina a través de la cánula. Si se ha perdido la vena, esto se notará por un pequeño edema en el tejido del oído.
   3. Intubar al cerdo para asegurarse de que la frecuencia respiratoria se pueda regular durante toda la cirugía.
      NOTA: Asegure una intubación exitosa aplicando presión sobre el tórax del cerdo y confirme que el aire espirado por la fuerza está saliendo del tubo de intubación.
   4. Conecte el tubo de intubación a un ventilador a una frecuencia respiratoria de 14 respiraciones/min.
   5. Conecte un oxímetro de pulso y un manguito a la cola para controlar la frecuencia cardíaca (FC), la presión arterial (PA) y la saturación de oxígeno (sats). Inserte un termómetro rectal para controlar la temperatura central.
   6. Prepare una bolsa intravenosa de ketamina (5 mg/kg/min), midazolam (0,25 mg/kg/min) y fentanilo (2,5 μg/kg/min), en solución salina y comience a infundir a través de la vena del oído a aproximadamente 2 gotas/s.
      NOTA: A lo largo de la cirugía, la velocidad de infusión puede necesitar ser aumentada o disminuida en función de los signos vitales del animal.
   7. Con el cerdo en posición prona, palpa la parte posterior de la cabeza y el cuello del animal para localizar y marcar la cresta occipital y la columna vertebral de las primeras vértebras torácicas y la base de cada oreja.
   8. Dibuja una línea recta entre la cresta y las vértebras a lo largo del eje longitudinal. Dibuja dos líneas desde la cresta hasta la base de cada oreja siguiendo la base del cráneo (Figura 1A).
   9. Verifique que el animal esté en un sueño profundo sujetando cuidadosamente la cola y observando la ausencia de un reflejo de la cola.
      NOTA: Si el animal todavía es reflexivo, la velocidad de infusión de anestésico debe aumentarse gradualmente hasta que el animal ya no muestre un reflejo.

2. Cirugía

NOTA: Durante toda la cirugía, es necesario tener al menos un asistente para succionar el sangrado ligero y cauterizar los vasos cortados.

1. Usando un bisturí con una cuchilla # 21, haga una incisión dérmica a lo largo de la línea longitudinal hasta el músculo.
2. Extienda dos incisiones dérmicas perpendiculares más a lo largo de los hombros, de 10 a 15 cm de longitud.
3. Desde las crestas occipitales, haga incisiones dérmicas a lo largo de la línea hasta la base de cada oreja.
4. Agarrando las esquinas de la piel formadas en la cresta occipital con fórceps anatómicos, separe cuidadosamente la piel del músculo subyacente pasando ligeramente la hoja del bisturí sobre la fascia, moviéndose de la rostral a la caudal. Una vez que la piel ha sido resecada después de cada una de las cinco incisiones, las partes de los músculos trapecio deben ser visibles.
5. Haga una incisión longitudinal con el bisturí, de aproximadamente 1 cm de profundidad, donde el trapecio se une en la línea media.
   NOTA: Al cortar a través de los músculos, hay una mayor propensión al sangrado, por lo que el cauterizador debe estar listo. Si se corta un vaso más grande, una persona debe comprimirlo rápidamente con la gasa, mientras que la otra persona usa el cauterizador.
6. Usando una combinación de pinzas quirúrgicas rectas y curvas, realice una disección contundente trabajando a lo largo del corte longitudinal en los músculos. Esto separará los vientres del trapecio, así como el músculo semiespinal capitus biventer subyacente.
7. Corte cualquier fibra muscular persistente con un bisturí y continúe la disección contundente hasta que semispinalis capitus complexus se haga visible.
8. Cortar los orígenes de los músculos trapecio y semiespinalis capitus biventer a lo largo de la cara posterior del cráneo. Sepáralos cuidadosamente longitudinalmente con el bisturí realizando una disección roma hasta que el semispinalis capitus complexus sea completamente visible.
9. Retraiga los músculos trapecio y semiespinalis capitus biventer utilizando retractores autocontenedores.
10. Donde los vientres del semispinalis capitus complexus se unen en la línea media, haga una incisión longitudinal con el bisturí de aproximadamente 1 cm de profundidad.
    NOTA: Tenga en cuenta cualquier sangrado adicional aquí. El sangrado se puede controlar utilizando una combinación de hisopos de algodón y cauterización.
11. Usando pinzas quirúrgicas, realice una disección contundente trabajando a lo largo del corte longitudinal entre los vientres musculares hasta que el aspecto dorsal del atlas (IC) sea palpable.
12. Cortar los orígenes de los músculos semiespinalis capitus complexus a lo largo de la cara posterior del cráneo y separarlo longitudinalmente de las vértebras subyacentes mediante bisturí y disección roma.
13. Retraiga los músculos semiespinalis capitus complexus utilizando otro conjunto de retractores autocontenedores.
14. Con un bisturí, retire cuidadosamente cualquier tejido restante que cubra la región donde el atlas se encuentra con la base del cráneo.
15. Colocando un brazo debajo del cuello del animal y un dedo en la coyuntura del atlas y el cráneo, eleva simultáneamente la cabeza y flexiona el cuello mientras palpa con el dedo para revelar la cisterna magna usando la otra mano.
    NOTA: La cisterna magna es reconocible cuando se palpa como una estructura elástica fuerte con una pequeña cantidad de rebote a medida que se libera presión con el dedo.

3. Canulación e inyección

NOTA: Este paso también requiere al menos dos personas y se lleva a cabo con la cabeza del animal elevada y el cuello flexionado.

1. Asegúrese de que una persona eleve y flexione la cabeza y el cuello del animal mientras que la otra palpa para la cisterna magna tomando nota de su ubicación anatómica.
2. Introducir lenta y cuidadosamente una cánula de 22 G a través de la duramadre y en la cisterna magna en un ángulo oblicuo con respecto al eje longitudinal.
   NOTA: No inserte la cánula demasiado profunda, ya que esto puede causar daño al cerebro. Saber hasta dónde insertar la cánula viene con la experiencia en la comprensión de cómo se siente que la cánula perfore la duramadre. Esencialmente, al igual que la duramadre ha sido perforada, la cánula es lo suficientemente profunda como para una inyección de trazador exitosa. Esta profundidad es de aproximadamente 3-5 mm, pero diferirá según el tamaño o la edad del animal. La canulación exitosa debe ser inmediatamente evidente a través de la visualización de LCR claro y pulsátil que asciende por la cánula. Para obtener el mejor resultado, se recomienda practicar varias canulaciones de antemano en animales sacrificados para comprender la perforación dural.
3. Retire la aguja de la cánula y coloque una tapa en la cerradura.
4. Primero, aplique superpegamento y un acelerador donde la cánula ingresa al tejido, seguido de la aplicación del cemento dental. Espere 5 minutos para que el cemento se endurezca.
5. Retire con cuidado la tapa de la cánula y fije el extremo macho del grifo de la línea IV previamente preparado con una extensión de 10 cm, con el trazador, a la cánula.
6. Inyecte lentamente el marcador a mano o utilizando una bomba de microinfusión a una velocidad de 100 μL/min. Retire el grifo de línea IV de 3 vías con una extensión de 10 cm y reemplácelo con la tapa. El trazador ahora debe ser visible pulsando en la base de la cánula (Video suplementario 1).
   NOTA: Si se inyecta a mano, haga esto hasta que el trazador todavía esté visible en el eje de la cánula, aproximadamente 1-2 mm por encima de donde el cemento dental está cubriendo el eje.
7. Después de la inyección, coloque sacos de arena debajo del cuello para mantener un poco de flexión. La cabeza puede ser liberada, y el animal se deja en una posición prona en reposo.
8. Suelte los retractores autocontenetivos y coloque los músculos como se encuentran antes. Junte la piel sobre los músculos con pinzas de toalla quirúrgicas.
9. Cubra las abrazaderas de toalla y la incisión con una gasa y luego una manta para limitar la pérdida de calor.
10. Permita que el trazador circule durante el tiempo deseado antes de sacrificar al animal por i.v. Inyección de pentobarbital (140 mg/kg). Confirmar la eutanasia por la ausencia de sonidos cardíacos tras la auscultación con un estetoscopio.

4. Extracción y procesamiento cerebral

1. Usando un bisturí con 20 cuchillas, extienda la incisión dérmica longitudinal desde la cresta occipital hasta aproximadamente 7 cm por encima de la nariz.
2. Refleja la piel que recubre el aspecto dorsal del cráneo usando el bisturí.
   NOTA: Hay varias formas de cortar y eliminar el aspecto dorsal del cráneo de cerdo animal por animal. Lo que sigue es el procedimiento que ha funcionado con mayor frecuencia para este experimento.
3. Usando una sierra compacta de mano, haga un corte coronal en el cráneo, aproximadamente 3 cm por encima de las dos venas grandes que se ven saliendo del cráneo. Extienda a dos cortes verticales adicionales de los cortes coronales y dos cortes más para unir los cortes verticales en la línea media.
   NOTA: Mantenga un agarre firme de la sierra al hacer los cortes óseos del cráneo, ya que tenderá a alejarse al primer contacto con el hueso o tejido, lo que puede provocar una lesión grave.
4. Asegúrese de que los cortes del cráneo estén a través de todo el grosor del hueso siguiendo con un martillo y un cincel estrecho (10 mm) a cada uno de los cortes.
5. Usando el martillo, finalmente golpee un cincel ancho (25-30 mm) en el corte coronal. Con una persona apoyando la cabeza, asegúrese de que la otra persona aplique palanca en el cincel para abrir el cráneo dorsal.
6. Una vez que se haya extraído el fragmento de cráneo dorsal, diseccione la duramadre suprayacente con tijeras quirúrgicas curvas.
7. Use una espátula para cortar la médula espinal desde el cerebelo en el aspecto rostral. Luego proceda a guiar la espátula debajo del cerebro desde el frente, cortando los bulbos olfativos, la glándula pituitaria y los nervios craneales.
8. Coloque la espátula detrás del cerebelo y aplique una buena cantidad de presión para desalojar el cerebro de la cavidad craneal, levantándolo cuidadosamente una vez suelto.
9. Fijar inmediatamente todo el cerebro por inmersión tisular en paraformaldehído al 4% durante la noche.
   NOTA: Después de este paso, es posible llevar a cabo la imagen de todo el cerebro utilizando un estereoscopio (Figura 1E).
10. Al día siguiente, haga rodajas coronales del cerebro con un cuchillo de salmón y fije las rodajas durante la noche mediante la inmersión tisular en paraformaldehído al 4%.
11. Finalmente, coloque las rodajas en azida al 0,01% en PBS para almacenamiento a largo plazo.

Resultados

Una vez que el cerdo está inconsciente, se palpa y se marca su anatomía superficial, comenzando en la cresta occipital (OC) y trabajando hacia las vértebras torácicas (TV) y cada base de la oreja (EB). Es en esta línea que se realizan las incisiones dérmicas (Figura 1A). Las tres capas musculares que incluyen trapecio, semiespinalis capitus biventer y semiespinalis capitus complexus son resecadas y mantenidas abiertas por dos conjuntos de retractores autocontenedores para exponer la ci...

Discusión

A continuación, se describe, un protocolo detallado para realizar la canulación directa de la cisterna magna en cerdos, incluyendo la preparación necesaria, procedimiento quirúrgico, infusión trazadora y extracción del cerebro. Esto requiere de alguien con experiencia y certificación para trabajar con animales grandes. Si se lleva a cabo correctamente, esto permite la entrega de moléculas deseadas con garantía directamente en el LCR, después de lo cual se pueden utilizar una serie de diferentes modalidades avan...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.01% azide in PBS	Sigmaaldrich	S2002
18G needle	Mediq
1ml Syringe	FischerSci	15849152
20G cannula	Mediq	NA
22G cannula	Mediq	NA
4% paraformaldehyde	Sigmaaldrich	P6148
Anatomical forceps	NA	NA
Bovine serum albumin Alexa-Fluor 647 Conjugate	ThermoFischer	A34785	2 vials (10mg)
CaCl2	Sigmaaldrich	C1016
Chisel	ClasOhlson	40-8870
Dental cement	Agnthos	7508
compact saw	ClasOhlson	40-9517
Glucose	Sigmaaldrich	G8270
Hammer	ClasOhlson	40-7694
Insta-Set CA Accelerator	BSI-Inc	BSI-151
IV line TAP, 3-WAYS with 10cm extension	Bbraun	NA
KCl	Sigmaaldrich	P9333
Marker pen	NA	NA
MgCl2	Sigmaaldrich	M8266
MilliQ water	NA	NA
NaCL	Sigmaaldrich	S7653
NaH2PO4	Sigmaaldrich	S8282
NaHCO3	Sigmaaldrich	S5761
No. 20 scalpel blade	Agnthos	BB520
No. 21 Scalpel blade	Agnthos	BB521
No. 4 Scalpel handle	Agnthos	10004-13
Saline	Mediq	NA
Salmon knife	Fiskers	NA
Self-retaining retractors	NA	NA
Superglue	NA	NA
Surgical curved scissors	NA	NA
Surgical forceps	NA	NA
Surgical towel clamps	NA	NA