豚のシスターナマグナにおける直接カニューレ移植

要約

この記事では、豚の水槽マグナに直接カニューレ移植のためのステップバイステップのプロトコルを提示します。

要約

リンパ系は、脳内の排液系であり、アストロサイト結合血管領域における脳脊髄液(CSF)の流れに依存し、アミロイドベータなどの神経毒性ペプチドのクリアランスに関与している。リンパ管機能の障害は、アルツハイマー病などの神経変性疾患の動物モデルにおける疾患病理を悪化させ、このクリアランスシステムを理解することの重要性を強調している。リンパ系は、システルナマグナカンヌレーション(CMc)によって研究されることが多く、トレーサーは脳脊髄液(CSF)に直接送達される。しかし、ほとんどの研究はげっ歯類で行われています。ここでは、ブタのCMc技術の適応を示す。豚のCMcを用いて、リンパ系は、精巣脳の高い光学解像度で研究することができ、そうすることでげっ歯類とヒトリンパ系の間の知識ギャップを埋める。

概要

脳脊髄液(CSF)は、中枢神経系(CNS)^1,2の内部および周囲に見られる血液の超浸透性^である。脳に浮力を与えたり、機械的な力を吸収することとは別に、CSFは^CNS3から代謝廃棄物を取り除く上で極めて重要な役割を果たしています。廃棄物のクリアランスは、動脈を貫通する血管周囲空間(PVS)を介して脳平在を通るCSFの対流を可能にする最近特徴付けられるリンパ系によって促進される^3,4,5。このプロセスは、^PVS4,6に結合した天体の端面に主に発現する水路であるアクアポリン^-4(AQP4)に依存することが示されている。リンパ系の研究は、高度な光顕微鏡または磁気共鳴画像法(MRI)のいずれかを使用して、蛍光/放射性トレーサーまたは造影剤を^{CSF7、8、9、10}、¹¹に導入した後、生体内およびエキビボイメージングの両方によって達成される。

脳のパレンチマに損傷を与えることなくCSFにトレーサーを導入する効果的な方法は、システルナマグナカンヌレーション(CMc)^12,13を介してです。すべてのリンパ節研究の大部分は、これまでのところげっ歯類で行われており、CMcの侵襲性が小さな哺乳類との作業の実用的なシンプルさに結合しているため、より高い哺乳類では避けられてきた。さらに、マウスの薄い頭蓋骨は、頭蓋窓を必要とせずに生体内イメージングを可能にし、その後、単純な脳抽出を可能に^する11,14。ヒトで行われた実験は、リンパ機能に関する貴重な巨視的なインビボデータを生み出したが、遠位腰椎におけるテレーサー注射に依存し、さらに、リンパ系の微小解剖学を捕捉するのに十分な解像度をもたらさないMRIを利用する^7,15,16.ヒトへの翻訳には、高等哺乳類におけるリンパ系のアーキテクチャと程度を理解することが不可欠です。ヒトへのリンパ翻訳を容易にするためには、高い認識と脳の複雑さの種間でリンパ系を直接比較できるように、げっ歯類で行われる技術を高等哺乳類に適用することが重要である¹⁷。豚と人間の脳は、折り畳まれた神経アーキテクチャを有する色素性であり、げっ歯類の脳はリセンスファーリックであり、それによって互いに大きな違いがある。全体的な大きさの面では、豚の脳は、また、人間に匹敵し、人間の脳よりも10〜15倍小さく、マウスの脳は3,000倍小さい¹⁸です。大型哺乳類におけるリンパ系をよりよく理解することにより、脳卒中、外傷性脳損傷および神経変性などの状態における将来の治療介入のためにヒトリンパ系を利用することができるかもしれない。インビボの豚における直接CMcは、より高い哺乳動物におけるリンパ系の高解像光顕微鏡を可能にする方法である。さらに、使用される豚の大きさに起因して、ヒトの手術に使用されるものと同様のモニタリングシステムを適用することが可能であり、それらがリンパ機能にどのように寄与するかを評価するために重要な機能を厳密に文書化および調節することが可能である。

プロトコル

すべての手続きは欧州指令2010/63/EUに従って実施され、マルメ・ルンド動物研究倫理委員会(Dnr 5.8.18-05527/2019)によって承認され、スウェーデン研究評議会のCODEXガイドラインに従って実施されました。

1. 準備

1. トレーサー
   1. 人工CSF(126 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.25 mM _NaH2PO4、2 mM _MgCl2、2 mM _CaCl2、10 mMグルコース、26 mM NaHCO3;pH 7.4)を準備する)
   2. 人工CSFの500 μLに、アレクサフルオール647(BSA-647)と共役したウシ血清(BSA)から10mgのアルブミンを加える。
   3. 5,000 x g で5分間遠心分離機を使用し、上清を使用してください。
2. カニューレ
   1. 静脈内(IV)ラインの女性ルアー接続に1mLの注射器を取り付け、3ウェイタップ10cm延長でタップします。
   2. 男性の端に18G針を取り付けます。
   3. 3ウェイストップロックを開けて、針からシリンジへの連続性を可能にします。
   4. 針を慎重に外し、約300μLの生理液をIVラインに吸引する。
   5. 生理食糸から針を取り出し、空気中に導入し、IVラインに小さな気泡(5〜10mm)を作り出します。
   6. 針をトレーサーに入れ、トレーサーの500 μLをすべて吸引します。IVラインの生理焼香は、気泡で目に見えて分離する必要があります。
   7. 針を捨てて、3ウェイストップロックを閉じます。
3. 動物
   1. タイルタミン(3.75mg/kg)およびゾラゼパム(3.75mg/kg)およびデクスメデトミジン(37.5 μg/kg)の筋肉内(i.m.)注射によって豚を鎮静する。それが意識を失うのを待ちます。
   2. 耳静脈に20Gカニューレを挿入して静脈内ラインを準備します。
      注:カニューレを通して生理食音の5-10 mLを注入することによって、カニューレが静脈内にあることを確認してください。静脈が見逃された場合、これは耳組織の小さな浮腫によって顕著になります。
   3. 手術中に呼吸数を調節できるように、豚を挿管します。
      注:豚の胸郭に圧力をかけ、強制的に期限切れの空気が挿管チューブから出ているかどうかを確認することで、挿管を成功させます。
   4. 挿管チューブを、14呼吸/分の呼吸速度に設定された人工呼吸器に取り付けます。
   5. パルスオキシメーターとカフをテールに接続して、心拍数(HR)、血圧(BP)、酸素飽和度(sats)を監視します。直腸温度計を挿入して、コア温度を監視します。
   6. ケタミン(5mg/kg/分)、ミダゾラム(0.25mg/kg/分)、フェンタニル(2.5 μg/kg/min)のIV袋を生理食い物で準備し、約2滴/秒で耳静脈を通して注入し始めます。
      注:手術を通して、注入速度は動物の生命力に基づいて増減する必要があるかもしれません。
   7. 豚が起こりやすい位置にあるとき、動物の頭と首の後ろを触診して、最初の胸椎の後頭部と脊椎と各耳の基部を見つけてマークします。
   8. 長手方向の軸に沿って、紋章と椎骨の間に直線を描きます。頭蓋骨の基部に従って、各耳の基部に紋章から2本の線を引きます(図1A)。
   9. 慎重に尾をクランプし、尾の反射の欠如を監視することにより、動物が深い眠りであることを確認してください。
      注意:動物がまだ反射的である場合、動物が反射を示さなくなるまで麻酔の注入速度を段階的に増加させる必要があります。

2. 手術

注:手術を通して、少なくとも1人の助手が光の出血を吸引し、切断された血管を焼灼する必要があります。

1. #21ブレードを持つメスを使用して、筋肉に縦線に沿って真皮切開を行います。
2. 2つの垂直な皮膚切開を肩に沿ってさらに伸ばし、長さは10〜15cm。
3. 後頭部の紋章から、各耳の基部まで沿って真皮切開を行う。
4. 解剖学的鉗子で後頭頂堤で形成された皮膚の角をつかみ、鼻隠しの上にメスの刃を軽く動かして下の筋肉から皮膚を慎重に分離し、鼻から尾根から尾根に移動する。皮膚が5つの切開のそれぞれに続いて切除されると、トラペジウス筋肉の一部が見えるはずです。
5. 真中にトラペジウスが一緒に来る約1センチのメスで縦切開を行います。
   注:筋肉を切断するとき、出血の傾向が高まっているので、発灼器は準備ができているはずです。より大きな容器が切断された場合、一方の人はガーゼですぐに圧縮し、もう一方の人はコーテライザーを使用する必要があります。
6. ストレートと湾曲した外科用鉗子を組み合わせて、筋肉の縦切りに沿って鈍い解剖を行う。これは、トラペジウスの腹だけでなく、基礎となる半脊柱のキャピタスビエンター筋肉を分離します。
7. メスで持続する筋線維を切断し、半脊髄炎のキャピタス複合体が見えるまで鈍い解剖を続ける。
8. 頭蓋骨の後部の側面に沿ってトラペジウスと半脊髄部の頭蓋のビエンター筋肉の起源を断ち切る。慎重に半脊髄キャピタス複合体が完全に見えるまで鈍い解剖を行うメスで縦方向にそれらを分離します。
9. 自己保持リトラクタを使用してトラペジウスおよび半脊髄炎のバイエンター筋肉を引き込む。
10. 半脊髄部の歯の複合体が正中に一緒に来る場合、メスの深さは約1cmの縦切開を行います。
    注:ここで追加の出血に注意してください。綿棒と焼灼の組み合わせを使用して、出血を管理することができます。
11. 外科的鉗子を用いて、アトラス(CI)の後部の側面が触知可能になるまで、筋肉腹の間の縦切りに沿って鈍い解剖を行う。
12. 頭蓋骨の後部側面に沿って半脊髄部の複雑な筋肉の起源を断ち切り、メスと鈍い解剖によって根底にある椎骨から縦方向に分離する。
13. 自己保持リトラクターの別のセットを使用して半脊柱キャピタス複合体筋肉を引き込みます.
14. メスを使用して、アトラスが頭蓋骨の基部と出会う領域の上にある残りの組織を慎重に取り除きます。
15. 動物の首の下に片方の腕を置き、アトラスと頭蓋骨の分岐点に片方の指を置き、同時に頭を高め、指で触手しながら首を曲げて、もう一方の手で水槽マグナを明らかにします。
    注:水槽マグナは、圧力が指で放出されるにつれて、少量のリバウンドを伴う強い弾性構造として触診する場合に認識できます。

3. 缶めと注入

注:このステップは少なくとも2人を必要とし、動物の頭部を上昇させ、首を曲げて行われます。

1. 一人の人が動物の頭と首を高め、曲げ、他の人が解剖学的位置をメモする水槽マグナの触診を確実にします。
2. ゆっくりと慎重にデュラを通して、長手方向の軸に斜めの角度でシステルナマグナに22 Gカニューレを導入します。
   注:これは脳に損傷を引き起こす可能性がありますので、深くカニューレを挿入しないでください。カニューレをどこまで挿入するかを知ることは、カニューレが硬膜を突き刺すのがどのように感じるかを理解する経験を伴います。本質的に、硬膜が穿孔されたのと同じように、カニューレはトレーサー注射に成功するのに十分な深さである。この深さは約3〜5ミリメートルですが、動物のサイズや年齢によって異なります。成功したカニューレは、カニューレを登る明確な、拍動性CSFの視覚化を通してすぐに明らかであるべきです。最良の結果を得るためには、硬膜穿刺の理解を得るために安楽死動物で事前にいくつかの缶詰を練習することをお勧めします。
3. カニューレから針を引っ込み、ロックにキャップを置きます。
4. まず、スーパーグルーとカニューレが組織に入るアクセラレータを適用し、続いて歯科用セメントを塗布します。セメントが固まるまで5分待ちます。
5. 慎重にカニューレからキャップを取り外し、前に準備したIVラインタップの男性の端に10cmの延長線を付けて、トレーサーを付けてカニューレに取り付けます。
6. トレーサーを手でゆっくりと注入するか、マイクロ注入ポンプを100 μL/minの速度で注入します。3つの方法のIVラインタップを10cmの延長で取り外し、キャップに置き換えます。トレーサーはカニューレの基部で目に見える脈動であるはずです(補足ビデオ1)。
   注:手で注入する場合は、トレーサーがカニューレシャフトにまだ見えるまで、歯科用セメントがシャフトを覆っている場所の約1〜2mm上までこれを行います。
7. 注射後、いくつかの屈曲を維持するために首の下にサンドバッグを置きます。その後、頭部が解放され、動物は休息しやすい位置に残される。
8. 自己保持リトラクターを解放し、彼らが前に横たわっていたように筋肉を配置します。外科用タオルクランプを使用して筋肉の上に皮膚を一緒に持って来ます。
9. タオルクランプと切開をガーゼで覆い、毛布を覆って熱損失を抑えます。
10. トレーサーがi.vによって動物を安楽死させる前に所望の時間循環することを許可する。ペントバルビタール注射(140mg/kg)。聴診器で聴診時に心臓の音が出ない場合に安楽死を確認する。

4. 脳の抽出と処理

1. 20枚刃のメスを使用して、後頭部の皮膚切開を後頭から鼻の上約7cmまで伸ばします。
2. メスを使用して頭蓋骨の後ろ面の上に皮膚を反射します。
   注:動物ごとに豚の頭蓋骨の後ろ面を切り取り、取り除く方法はいくつかあります。以下は、この実験で最も頻繁に行った手順です。
3. ハンドヘルドコンパクトソーを使用して、頭蓋骨を出て見られる2つの大きな静脈の上に約3cmの頭蓋骨にコロナカットを作ります。コロナカットからさらに2つの垂直カットとさらに2つのカットに拡張して、垂直カットを正線にまとめて表示します。
   注:頭蓋骨の骨の切り傷を作るときは、骨や組織との最初の接触で引き離される傾向があり、重傷を負う可能性がありますので、鋸のしっかりとしたグリップを維持してください。
4. 各カットにハンマーと狭いノミ(10mm)でフォローアップすることにより、頭蓋骨のカットが骨の全体の厚さを通っていることを確認してください。
5. ハンマーを使用して、最後に広いノミ(25〜30ミリメートル)をコロナカットにノックします。一人の人が頭を支えているので、他の人が胴体の頭蓋骨を開くためにノミにレバレッジを適用することを確認してください。
6. 後頭蓋の破片が取り除かれたら、湾曲した外科用ハサミを使って上にある硬膜を解剖する。
7. はらを使用して、小脳から脊髄を鼻孔の側面で重症化します。その後、脳の下のへらを前から導き、嗅球、下垂体、脳神経を切断する。
8. 小脳の後ろにへらを置き、脳を頭蓋腔から取り除くためにかなりの量の圧力をかけ、一度緩んだら慎重に持ち上げます。
9. すぐに一晩4%パラホルムアルデヒドに組織浸漬によって脳全体を固定します。
   注:このステップの後、ステレオスコープを使用して脳全体のイメージングを行うことが可能です(図1E)。
10. 翌日、サーモンナイフを使用して脳のコロナスライスを作り、4%パラホルムアルデヒドに組織浸漬して一晩スライスを固定します。
11. 最後に、スライスをPBSで0.01%のアジドに入れ、長期保存します。

結果

豚が意識を失うと触診され、その表面解剖学がマークされ、後頭部の堤(OC)から始まり、胸椎(TV)と各耳の基盤(EB)に向かって働く。真皮切開がなされるのはこれらの線に沿って行われる(図1A)。トラペジウス、半脊柱部バイエンター、半脊柱管鏡複合体を含む3つの筋肉層は、システルナマグナ(CM)を露出させるために2組の自己保持リトラクターによって切除され、開いたま...

ディスカッション

本明細書において、必要な準備、外科的処置、トレーサー注入および脳の抽出を含む豚におけるシステルナマグナの直接カヌル化を行う詳細なプロトコルについて説明する。これには、大きな動物を扱うための経験と認定を持つ人が必要です。正しく行えば、CSFに直接確実に望ましい分子を送達することができ、その後、一連の異なる高度な光イメージングモダリティを使用して、大型哺乳?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.01% azide in PBS	Sigmaaldrich	S2002
18G needle	Mediq
1ml Syringe	FischerSci	15849152
20G cannula	Mediq	NA
22G cannula	Mediq	NA
4% paraformaldehyde	Sigmaaldrich	P6148
Anatomical forceps	NA	NA
Bovine serum albumin Alexa-Fluor 647 Conjugate	ThermoFischer	A34785	2 vials (10mg)
CaCl2	Sigmaaldrich	C1016
Chisel	ClasOhlson	40-8870
Dental cement	Agnthos	7508
compact saw	ClasOhlson	40-9517
Glucose	Sigmaaldrich	G8270
Hammer	ClasOhlson	40-7694
Insta-Set CA Accelerator	BSI-Inc	BSI-151
IV line TAP, 3-WAYS with 10cm extension	Bbraun	NA
KCl	Sigmaaldrich	P9333
Marker pen	NA	NA
MgCl2	Sigmaaldrich	M8266
MilliQ water	NA	NA
NaCL	Sigmaaldrich	S7653
NaH2PO4	Sigmaaldrich	S8282
NaHCO3	Sigmaaldrich	S5761
No. 20 scalpel blade	Agnthos	BB520
No. 21 Scalpel blade	Agnthos	BB521
No. 4 Scalpel handle	Agnthos	10004-13
Saline	Mediq	NA
Salmon knife	Fiskers	NA
Self-retaining retractors	NA	NA
Superglue	NA	NA
Surgical curved scissors	NA	NA
Surgical forceps	NA	NA
Surgical towel clamps	NA	NA