Implantation directe de canules dans la Cisterna Magna des porcs

Résumé

Cet article présente un protocole étape par étape pour l’implantation directe de canules dans la cisterna magna des porcs.

Résumé

Le système glymphatique est un système d’élimination des déchets dans le cerveau qui repose sur l’écoulement du liquide céphalo-rachidien (LCR) dans les espaces périvasculaires liés aux astrocytes et a été impliqué dans la clairance des peptides neurotoxiques tels que l’amyloïde-bêta. L’altération de la fonction glymphatique exacerbe la pathologie de la maladie dans les modèles animaux de maladies neurodégénératives, telles que la maladie d’Alzheimer, ce qui souligne l’importance de comprendre ce système de clairance. Le système glymphatique est souvent étudié par les canules cisterna magna (CMc), où les traceurs sont délivrés directement dans le liquide céphalo-rachidien (LCR). La plupart des études, cependant, ont été réalisées sur des rongeurs. Ici, nous démontrons une adaptation de la technique CMc chez les porcs. En utilisant CMc chez les porcs, le système glymphatique peut être étudié à une résolution optique élevée dans les cerveaux gyrencéphales et, ce faisant, combler le fossé des connaissances entre les rongeurs et les glymphatiques humains.

Introduction

Le liquide céphalo-rachidien (LCR) est un ultrafiltrat de sang qui se trouve à l’intérieur et autour du système nerveux central (SNC)^1,2. En plus de donner de la flottabilité au cerveau ou d’absorber les forces mécaniques dommageables, le LCR joue également un rôle central dans l’élimination des déchets métaboliques du ^SNC3. L’élimination des déchets est facilitée par le système glymphatique récemment caractérisé qui permet le flux convectif du LCR à travers le parenchyme cérébral via des espaces périvasculaires (PVS), qui encerclent les artères pénétrantes3,4,5. Il a été démontré que ce processus dépend de l’aquaporine-4 (AQP4), un canal d’eau exprimé principalement sur les pieds astrologiques, lié au ^PVS4,6. L’étude du système glymphatique est réalisée par imagerie in vivo et ex vivo, à l’aide de la microscopie optique avancée ou de l’imagerie par résonance magnétique (IRM), à la suite de l’introduction d’un traceur fluorescent / radioactif ou d’un agent de contraste dans le LCR7,8,9,10,11.

Un moyen efficace d’introduire un traceur dans le LCR sans subir de dommages au parenchyme cérébral consiste à utiliser la canulation cisterna magna (CMc)^12,13. Une grande majorité de toutes les études glymphatiques, jusqu’à présent, ont été réalisées chez des rongeurs et évitées chez les mammifères supérieurs en raison du caractère invasif du CMc associé à la simplicité pratique du travail avec un petit mammifère. De plus, les crânes minces de souris permettent l’imagerie in vivo sans avoir besoin d’une fenêtre crânienne et permettent par la suite une extraction cérébrale ^simple11,14. Les expériences menées chez l’homme ont fourni de précieuses données macroscopiques in vivo sur la fonction glymphatique, mais se sont appuyées sur des injections intrathécales de traceurs dans la colonne lombaire distale et, en outre, utilisent l’IRM qui ne donne pas une résolution suffisante pour capturer la microanatomie du système glymphatique7,15,16 . Comprendre l’architecture et l’étendue du système glymphatique chez les mammifères supérieurs est essentiel pour sa traduction chez l’homme. Afin de faciliter la traduction glymphatique chez l’homme, il est important d’appliquer les techniques qui sont effectuées chez les rongeurs aux mammifères supérieurs afin de permettre des comparaisons directes du système glymphatique entre les espèces de complexité croissante de la cognition et du ^cerveau17. Les cerveaux des porcs et des humains sont gyrencéphales, possédant une neuroarchitecture pliée, tandis que les cerveaux des rongeurs sont lissencéphales, ayant ainsi une différence substantielle entre eux. En termes de taille globale, les cerveaux de porc sont également plus comparables à ceux des humains, étant 10 à 15 fois plus petits que le cerveau humain, tandis que les cerveaux de souris sont 3 000 fois plus ^petits18. En comprenant mieux le système glymphatique chez les grands mammifères, il pourrait être possible d’utiliser le système glymphatique humain pour une intervention thérapeutique future dans des conditions telles que les accidents vasculaires cérébraux, les lésions cérébrales traumatiques et la neurodégénérescence. Le CMc direct chez les porcs in vivo est une méthode qui permet la microscopie optique à haute résolution du système glymphatique chez un mammifère supérieur. En outre, en raison de la taille des porcs utilisés, il est possible d’appliquer des systèmes de surveillance similaires à ceux utilisés dans les chirurgies humaines, ce qui permet de documenter et de réguler étroitement les fonctions vitales afin d’évaluer comment celles-ci contribuent à la fonction glymphatique.

Protocole

Toutes les procédures ont été effectuées conformément à la directive européenne 2010/63/UE et ont été approuvées par le comité d’éthique de Malmö-Lund sur la recherche animale (Dnr 5.8.18-05527/2019) et menées conformément aux directives CODEX du Conseil suédois de la recherche.

1. Préparation

1. Traceur
   1. Préparer le LCR artificiel (126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM _NaH2PO4, 2 mM _MgCl2, 2 mM _CaCl2, 10 mM de glucose, 26 mM NaHCO3; pH 7,4)
   2. À 500 μL de LCR artificiel, ajouter 10 mg d’albumine provenant du sérum bovin (BSA) conjugué avec Alexa Fluor 647 (BSA-647).
   3. Centrifugez à 5 000 x g pendant 5 min et utilisez le surnageant.
2. Canule
   1. Fixez une seringue de 1 mL à la connexion Luer femelle de la ligne intraveineuse (IV), robinet à 3 voies avec extension de 10 cm.
   2. Fixez une aiguille de 18 G à l’extrémité mâle.
   3. Ouvrez le verrou d’arrêt à 3 voies pour permettre la continuité de l’aiguille à la seringue.
   4. Dégainez soigneusement l’aiguille et aspirez environ 300 μL de la solution saline dans la ligne IV.
   5. Retirez l’aiguille de la solution saline et procédez à l’introduction dans un peu d’air pour créer une petite bulle d’air (5-10 mm) dans la ligne IV.
   6. Placez l’aiguille dans le traceur et aspirez les 500 μL du traceur. La solution saline dans la ligne IV doit être visiblement séparée par une bulle d’air.
   7. Jetez l’aiguille et fermez le verrou d’arrêt à 3 voies.
3. Animal
   1. Sédater un porc par injection intramusculaire (i.m.) de tilétamine (3,75 mg/kg) et de zolazépam (3,75 mg/kg) et de dexmédétomidine (37,5 μg/kg). Attendez qu’il devienne inconscient.
   2. Préparez une ligne intraveineuse en insérant une canule de 20 G dans la veine de l’oreille.
      REMARQUE: Assurez-vous que la canule est dans la veine en injectant 5-10 mL de solution saline à travers la canule. Si la veine a été manquée, cela sera perceptible par un petit œdème dans le tissu de l’oreille.
   3. Intuber le porc pour s’assurer que la fréquence respiratoire peut être régulée tout au long de la chirurgie.
      REMARQUE: Assurer une intubation réussie en appliquant une pression sur le thorax du porc et confirmer que de l’air expiré de force sort du tube d’intubation.
   4. Fixez le tube d’intubation à un ventilateur réglé sur un rythme respiratoire de 14 respirations / min.
   5. Connectez un oxymètre de pouls et un brassard à la queue pour surveiller la fréquence cardiaque (HR), la pression artérielle (BP) et la saturation en oxygène (sats). Insérez un thermomètre rectal pour surveiller la température centrale.
   6. Préparer un sac IV de kétamine (5 mg/kg/min), de midazolam (0,25 mg/kg/min) et de fentanyl (2,5 μg/kg/min), dans une solution saline et commencer à infuser dans la veine de l’oreille à environ 2 gouttes/s.
      REMARQUE: Tout au long de la chirurgie, le débit de perfusion peut devoir être augmenté ou diminué en fonction des signes vitaux de l’animal.
   7. Avec le cochon en position couchée, palper l’arrière de la tête et du cou de l’animal pour localiser et marquer la crête occipitale et la colonne vertébrale des premières vertèbres thoraciques et la base de chaque oreille.
   8. Tracez une ligne droite entre la crête et les vertèbres le long de l’axe longitudinal. Tracez deux lignes de la crête à la base de chaque oreille en suivant la base du crâne (Figure 1A).
   9. Vérifiez que l’animal est dans un sommeil profond en serrant soigneusement la queue et en surveillant l’absence de réflexe de queue.
      REMARQUE: Si l’animal est encore réflexif, le débit de perfusion d’anesthésique doit être augmenté progressivement jusqu’à ce que l’animal ne présente plus de réflexe.

2. Chirurgie

REMARQUE: Tout au long de la chirurgie, il est nécessaire d’avoir au moins un assistant pour aspirer le saignement léger et cautériser les vaisseaux sectionnés.

1. À l’aide d’un scalpel avec une lame # 21, faites une incision cutanée le long de la ligne longitudinale jusqu’au muscle.
2. Étendez deux incisions cutanées perpendiculaires plus loin le long des épaules, de 10 à 15 cm de long.
3. À partir des crêtes occipitales, faites des incisions cutanées le long de la ligne jusqu’à la base de chaque oreille.
4. En saisissant les coins de la peau formés à la crête occipitale avec une pince anatomique, séparez soigneusement la peau du muscle sous-jacent en faisant glisser légèrement la lame du scalpel sur le fascia, passant du rostral au caudal. Une fois que la peau a été réséquée après chacune des cinq incisions, des parties des muscles trapèzes doivent alors être visibles.
5. Faites une incision longitudinale avec le scalpel, d’environ 1 cm de profondeur, où le trapèze se réunit à la ligne médiane.
   REMARQUE: Lors de la coupe à travers les muscles, il y a une propension accrue à saigner, de sorte que le cautérisateur doit être prêt. Si un vaisseau plus gros est sectionné, une personne doit rapidement le comprimer avec la gaze, tandis que l’autre personne utilise le cautérisateur.
6. À l’aide d’une combinaison de pinces chirurgicales droites et incurvées, effectuez une dissection émoussée le long de la coupe longitudinale dans les muscles. Cela séparera le ventre du trapèze, ainsi que le muscle biventeur semispinalis capitus sous-jacent.
7. Coupez toutes les fibres musculaires persistantes avec un scalpel et continuez la dissection émoussée jusqu’à ce que semispinalis capitus complexus devienne visible.
8. Couper les origines des muscles biventeurs trapèze et semispinalis capitus le long de l’aspect postérieur du crâne. Séparez-les soigneusement longitudinalement avec le scalpel effectuant une dissection émoussée jusqu’à ce que le semispinalis capitus complexus soit entièrement visible.
9. Rétractez les muscles biventeurs trapèze et semispinalis capitus à l’aide de rétracteurs auto-retenus.
10. Là où les ventres du semispinalis capitus complexus se rejoignent dans la ligne médiane, faites une incision longitudinale avec le scalpel d’environ 1 cm de profondeur.
    REMARQUE: Soyez conscient de tout saignement supplémentaire ici. Les saignements peuvent être gérés à l’aide d’une combinaison de cotons-tiges et de cautérisation.
11. À l’aide d’une pince chirurgicale, effectuez une dissection contondante le long de la coupe longitudinale entre les ventres musculaires jusqu’à ce que l’aspect dorsal de l’atlas (IC) soit palpable.
12. Couper les origines des muscles semispinalis capitus complexus le long de l’aspect postérieur du crâne et le séparer longitudinalement des vertèbres sous-jacentes par scalpel et dissection contondante.
13. Rétractez les muscles semispinalis capitus complexus à l’aide d’un autre ensemble de rétracteurs auto-retenants.
14. À l’aide d’un scalpel, retirez soigneusement tout tissu restant recouvrant la région où l’atlas rencontre la base du crâne.
15. En plaçant un bras sous le cou de l’animal et un doigt à la jonction de l’atlas et du crâne, élevez simultanément la tête et fléchissez le cou tout en palpant avec le doigt pour révéler la cisterna magna à l’aide de l’autre main.
    REMARQUE: La cisterna magna est reconnaissable lors de la palpation comme une structure élastique forte avec une petite quantité de rebond lorsque la pression est libérée avec le doigt.

3. Canulation et injection

REMARQUE: Cette étape nécessite également au moins deux personnes et est effectuée avec la tête de l’animal surélevée et le cou fléchi.

1. Assurez-vous qu’une personne élève et fléchit la tête et le cou de l’animal tandis que l’autre palpe pour la cisterna magna en notant son emplacement anatomique.
2. Introduire lentement et soigneusement une canule de 22 G à travers la dure-mère et dans la cisterna magna à un angle oblique par rapport à l’axe longitudinal.
   REMARQUE: N’insérez pas la canule trop profondément, car cela pourrait causer des dommages au cerveau. Savoir jusqu’où insérer la canule vient avec l’expérience de comprendre ce que l’on ressent pour la canule de percer la dure-mère. Essentiellement, tout comme la dure-mère a été percée, la canule est alors assez profonde pour une injection de traceur réussie. Cette profondeur est d’environ 3-5 mm mais diffère en fonction de la taille ou de l’âge de l’animal. Une canulation réussie doit être immédiatement évidente grâce à la visualisation d’un LCR clair et pulsatile remontant la canule. Pour le meilleur résultat, il est recommandé de pratiquer plusieurs canules au préalable chez les animaux euthanasiés pour comprendre le piercing dural.
3. Rétractez l’aiguille de la canule et placez un capuchon sur la serrure.
4. Tout d’abord, appliquez de la superglue et un accélérateur où la canule pénètre dans le tissu, suivi de l’application du ciment dentaire. Attendez 5 min pour que le ciment durcisse.
5. Retirez soigneusement le capuchon de la canule et fixez l’extrémité mâle du robinet de ligne IV préalablement préparé avec une extension de 10 cm, avec le traceur, à la canule.
6. Injecter lentement le traceur à la main ou à l’aide d’une micro-pompe à perfusion à une vitesse de 100 μL/min. Retirez le robinet de ligne IV à 3 voies avec une extension de 10 cm et remplacez-le par le capuchon. Tracer devrait maintenant être visible pulsé à la base de la canule (vidéo supplémentaire 1).
   REMARQUE: Si vous injectez à la main, faites-le jusqu’à ce que le traceur soit encore visible dans l’arbre de la canule, à environ 1-2 mm au-dessus de l’endroit où le ciment dentaire recouvre l’arbre.
7. Après l’injection, placez des sacs de sable sous le cou pour maintenir une certaine flexion. La tête peut alors être relâchée et l’animal est laissé dans une position couchée au repos.
8. Relâchez les rétracteurs auto-retenus et placez les muscles comme ils se trouvaient avant. Rassemblez la peau sur les muscles à l’aide de pinces à serviette chirurgicales.
9. Couvrez les pinces à serviette et l’incision avec de la gaze, puis une couverture pour limiter les pertes de chaleur.
10. Laissez le traceur circuler pendant le temps souhaité avant d’euthanasier l’animal par i.v. Injection de pentobarbital (140 mg/kg). Confirmer l’euthanasie par l’absence de sons cardiaques lors de l’auscultation avec un stéthoscope.

4. Extraction et traitement du cerveau

1. À l’aide d’un scalpel à 20 lames, étendez l’incision cutanée longitudinale de la crête occipitale à environ 7 cm au-dessus du nez.
2. Réfléchissez la peau recouvrant l’aspect dorsal du crâne à l’aide du scalpel.
   REMARQUE: Il existe plusieurs façons de couper et d’enlever l’aspect dorsal du crâne de porc animal par animal. Ce qui suit est la procédure qui a fonctionné le plus souvent pour cette expérience.
3. À l’aide d’une scie compacte portative, faites une coupe coronale dans le crâne, à environ 3 cm au-dessus des deux grandes veines qui sortent du crâne. Étendez à deux autres coupes verticales à partir des coupes coronales et à deux autres coupes pour rapprocher les coupes verticales dans la ligne médiane.
   REMARQUE: Maintenez une prise ferme de la scie lorsque vous faites les coupes d’os du crâne, car elle aura tendance à s’éloigner au premier contact avec l’os ou le tissu, ce qui peut entraîner une blessure grave.
4. Assurez-vous que les coupes du crâne traversent toute l’épaisseur de l’os en suivant avec un marteau et un ciseau étroit (10 mm) à chacune des coupes.
5. À l’aide du marteau, frappez enfin un large ciseau (25-30 mm) dans la coupe coronale. Avec une personne soutenant la tête, assurez-vous que l’autre personne applique un effet de levier sur le ciseau pour grimacer le crâne dorsal.
6. Une fois le fragment de crâne dorsal retiré, disséquez la dure-mère sus-jacente à l’aide de ciseaux chirurgicaux incurvés.
7. Utilisez une spatule pour sévèrer la moelle épinière du cervelet à l’aspect rostral. Ensuite, guidez la spatule sous le cerveau par l’avant, en coupant les bulbes olfactifs, l’hypophyse et les nerfs crâniens.
8. Placez la spatule derrière le cervelet et appliquez une bonne pression pour déloger le cerveau de la cavité crânienne, en le soulevant soigneusement une fois lâche.
9. Fixez immédiatement tout le cerveau par immersion tissulaire dans 4% de paraformaldéhyde pendant la nuit.
   REMARQUE: Après cette étape, il est possible d’effectuer l’imagerie cérébrale entière à l’aide d’un stéréoscope (Figure 1E).
10. Le lendemain, faites des tranches coronales du cerveau à l’aide d’un couteau à saumon et fixez les tranches pendant la nuit par immersion tissulaire dans 4% de paraformaldéhyde.
11. Enfin, placez les tranches dans de l’azoture à 0,01% dans PBS pour un stockage à long terme.

Résultats

Une fois que le porc est inconscient, il est palpé et son anatomie de surface est marquée, en commençant par la crête occipitale (OC) et en travaillant vers les vertèbres thoraciques (TV) et chaque base de l’oreille (EB). C’est dans ce sens que sont pratiquées les incisions cutanées (Figure 1A). Les trois couches musculaires, dont le trapèze, le semispinalis capitus biventer et le semispinalis capitus complexus, sont réséquées et maintenues ouvertes par deux ensembles de rétr...

Discussion

Ici, est décrit, un protocole détaillé pour effectuer la canulation directe de la cisterna magna chez les porcs, y compris la préparation nécessaire, la procédure chirurgicale, la perfusion de traceur et l’extraction du cerveau. Cela nécessite une personne ayant de l’expérience et une certification pour travailler avec de gros animaux. S’il est effectué correctement, cela permet la livraison des molécules souhaitées avec caution directement dans le LCR, après quoi une série de différentes modalités a...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.01% azide in PBS	Sigmaaldrich	S2002
18G needle	Mediq
1ml Syringe	FischerSci	15849152
20G cannula	Mediq	NA
22G cannula	Mediq	NA
4% paraformaldehyde	Sigmaaldrich	P6148
Anatomical forceps	NA	NA
Bovine serum albumin Alexa-Fluor 647 Conjugate	ThermoFischer	A34785	2 vials (10mg)
CaCl2	Sigmaaldrich	C1016
Chisel	ClasOhlson	40-8870
Dental cement	Agnthos	7508
compact saw	ClasOhlson	40-9517
Glucose	Sigmaaldrich	G8270
Hammer	ClasOhlson	40-7694
Insta-Set CA Accelerator	BSI-Inc	BSI-151
IV line TAP, 3-WAYS with 10cm extension	Bbraun	NA
KCl	Sigmaaldrich	P9333
Marker pen	NA	NA
MgCl2	Sigmaaldrich	M8266
MilliQ water	NA	NA
NaCL	Sigmaaldrich	S7653
NaH2PO4	Sigmaaldrich	S8282
NaHCO3	Sigmaaldrich	S5761
No. 20 scalpel blade	Agnthos	BB520
No. 21 Scalpel blade	Agnthos	BB521
No. 4 Scalpel handle	Agnthos	10004-13
Saline	Mediq	NA
Salmon knife	Fiskers	NA
Self-retaining retractors	NA	NA
Superglue	NA	NA
Surgical curved scissors	NA	NA
Surgical forceps	NA	NA
Surgical towel clamps	NA	NA