Extracción del cofactor F420 para el análisis de la longitud de la cola de poliglutamato a partir de cultivos puros metanogénicos y muestras ambientales

Resumen

Se optimizó un método para la extracción del cofactor _F420 de cultivos puros para la separación cromatográfica líquida y el análisis de la longitud de la cola _F420 en cultivo puro y muestras ambientales.

Resumen

El cofactor _F420 juega un papel central como portador de hidruro en el metabolismo primario y secundario de muchos taxones bacterianos y arqueales. El cofactor es mejor conocido por su papel en la metanogénesis, donde facilita reacciones termodinámicamente difíciles. Como la cola de poliglutamato varía en longitud entre diferentes organismos, los análisis de perfil de longitud podrían ser una herramienta poderosa para distinguir y caracterizar diferentes grupos y vías en varios hábitats. Aquí, el protocolo describe la extracción y optimización de la detección del cofactor _F420 mediante la aplicación de la extracción en fase sólida combinada con el análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento independiente de los enfoques biológicos culturales o moleculares. El método se aplicó para obtener información adicional sobre la expresión del cofactor _F420 de las comunidades microbianas en suelos, lodos anaeróbicos y cultivos puros y se evaluó mediante experimentos de aumento. De este modo, el estudio logró generar diferentes perfiles de longitud de cola _F420 para metanógenos hidrogenotróficos y acetoclásticos en cultivos puros metanogénicos controlados, así como a partir de muestras ambientales como lodos de digestor anaeróbico y suelos.

Introducción

_F420 es un cofactor generalizado pero a menudo descuidado, que funciona como un transportador obligado de hidruro de dos electrones en los procesos metabólicos primarios y secundarios de archaea y bacteria1,2. _F420 es una 5-deazaflavina y estructuralmente similar a las flavinas, por lo que sus propiedades químicas y biológicas son más comparables con las de NAD⁺ o NADP⁺. Debido a la sustitución del nitrógeno por carbono en la posición 5 del anillo de isoaloxazina, es un fuerte reductor, exhibiendo así un bajo potencial redox estándar de -340

Protocolo

NOTA: La extracción y el análisis del cofactor _F420 es un proceso de tres pasos que incluye la lisis de la muestra, la prepurificación del cofactor a través de la extracción en fase sólida (SPE) y la detección del cofactor a través de RP-HPLC emparejado con iones (IP-RP-HPLC) con detección de fluorescencia. Antes de comenzar, prepare los materiales y reactivos como se indica en la Tabla 1.

1. Lisis de la muestra

1. Agregue hasta 5 g de muestra a los tubos apropiados (por ejemplo, tubos cónicos de 50 ml).
2. Añadir 5 ml del tampón de lisis (solución madre 2x, Tabla 1) a las muestras.....

Resultados

Los cultivos puros de Methanosarcina thermophila y Methanoculleus thermophilus, ambos arqueas metanogénicas termófilas, se cultivaron en medios adecuados como se describió ^{anteriormente29,30}. Para Methanosarcina thermophila, el metanol se utilizó como fuente de energía, mientras que Methanoculleus thermophilus se cultivó con _H2 / _CO2. El crecimiento se comprobó mediante evaluación microsc?.......

Discusión

Para la evaluación del cofactor _F420 a partir de cultivos metanogénicos puros, se puede realizar una evaluación microscópica para visualizar el crecimiento y la actividad (microscopía de fluorescencia) de los microorganismos involucrados (Figura 1). Para muestras procedentes de entornos naturales, el uso de microscopía para detectar o cuantificar _F420 es limitado debido a interferencias con otros microorganismos fluorescentes, partículas orgánicas e inorgánicas.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Autoclave
Biocompatible HPLC system equipped with gradient modul, oven and fluorescence detector	Shimadzu		HPLC system
Centrifuge and rotor for 50 mL “Falcon” tubes (11.000 rcf) and appropriate tubes
HPLC Column: Gemini NX C18, 5 μm, 150 x 3 mm	Phenomenex		HPLC column
PTFE filter (pore size 0.22 µm) to remove particulate matter prior HPLC analysis
Resin for SPE: Strata-X-AW 33 μm as weak anion mixed-mode polymeric sorbent	Phenomenex		weak anion mixed-mode polymeric sorbent
Vacuum manifold for SPE and appropriate collection tubes			SPE equipment
Vortex mixer