JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Saf kültürlerden kofaktör F420'nin çıkarılması için bir yöntem, saf kültür ve çevre örneklerinde F420 kuyruk uzunluğunun sıvı kromatografik ayrımı ve analizi için optimize edildi.

Özet

Kofaktör F420 , birçok bakteriyel ve arkeal taksonun birincil ve ikincil metabolizmasında hidrit taşıyıcısı olarak merkezi bir rol oynar. Kofaktör en çok termodinamik olarak zor reaksiyonları kolaylaştırdığı metanogenezdeki rolü ile bilinir. Poliglutamat kuyruk farklı organizmalar arasında uzunluk olarak değiştiğinden, uzunluk profili analizleri çeşitli habitatlardaki farklı grupları ve yolları ayırt etmek ve karakterize etmek için güçlü bir araç olabilir. Burada protokol, kültürel veya moleküler biyolojik yaklaşımlardan bağımsız olarak yüksek performanslı sıvı kromatografi analizi ile birlikte katı faz ekstraksiyonu uygulanarak kofaktör F420 tespitinin ekstraksiyonunu ve optimizasyonunu açıklar. Yöntem, topraklardaki mikrobiyal topluluklardan, anaerobik çamurlardan ve saf kültürlerden kofaktör F420'nin ifadesi hakkında ek bilgi edinmek için uygulandı ve dikenli deneylerle değerlendirildi. Böylece çalışma, kontrollü metanojenik saf kültürlerde hidrojenotrofik ve asetoklastik metanojenlerin yanı sıra anaerobik sindirici çamur ve topraklar gibi çevresel örneklerden farklı F420 kuyruk uzunluğu profilleri üretmeyi başardı.

Giriş

F420, hem Archaea hem de Bacteria1,2'nin birincil ve ikincil metabolik süreçlerinde zorunlu iki elektronlu hidrit taşıyıcısı olarak işlev gören yaygın ancak genellikle ihmal edilen bir kofaktördür. F420, 5 deazaflavindir ve yapısal olarak flavinlere benzer, böylece kimyasal ve biyolojik özellikleri NAD+ veya NADP + ile daha karşılaştırılabilir. İzoalloksiazin halkasının 5 pozisyonunda karbonlu azot ikamesi nedeniyle, güçlü bir redüktanttır, böylece -340 mV1,3 düşük standart redoks potansiyeli sergiler. F420, 5-deazaflavin halkası ve 2 fosfo-L-laktat bağlayıcıdan (F420-0) oluşur. Moleküle (F420-n+1)4 n+1 glutamat monomerleri içeren bir oligaoglutamat kuyruk takılabilir.

Uzun zamandır, cofactor F420 sadece Archaea ve Actinobacteria ile ilişkilendirilmiştir. Bu büyük ölçüde devrildi. Son analizler, F420'nin phyla Proteobacteria, Chloroflexi ve potansiyel olarak Firmicutes'in çeşitli anaerobik ve aerobik organizmaları arasında dağılmayan toprak, göl ve insan bağırsağı gibi sayısız habitatta yaşadığını ortaya koydu1,5. 2019'da Braga ve ark.6, proteobacterium Paraburkholderia rhizoxinica'nın çeşitli habitatlarda yaygın olabilecek 2 fosfolactate kuyruk yerine 3 fosfolycerat içeren benzersiz bir F420 türevi ürettiğini gösterdi. Archaea etki alanında, F420 metanojenik7, metanotrofik8,9 ve sülfat azaltıcı siparişler10 dahil olmak üzere çeşitli soylarda bulunmuştur ve Thaumarchaeota11'de üretilmesi beklenmiştir. F420 en iyi hidrojenotrofik ve methylotrofik metanogenezde temel bir redoks koenzim olarak bilinir. F420'nin (F420H2) azaltılmış formu, metilennetetrahydromethanopterin (metilen-H4MPT, Mer) ve metilen-H4MPT12,13'ün azaltılması için bir elektron donörü olarak işlev görse de işlev görsedir. Sitokrom içeren metanojenlerin H2 bağımsız elektron taşıma yollarında elektron taşıyıcı olarak da kullanılabilir12,14. Ayrıca, F420'nin oksitlenmiş formu, metanojenlerin mikroskobik olarak tespitini kolaylaştıran 420 nm'de eksize edilen karakteristik bir mavi-yeşil floresan vardır (Şekil 1). Düşük redoks potansiyeli nedeniyle, F420 (i) aksi takdirde recalcitrant veya toksik organik bileşiklerin geniş bir spektrumunun eksojen azaltılmasını kolaylaştırır, (ii) streptomisitlerde (phylum Actinobacteria) tetrasiklin ve linkozarit antibiyotiklerinin veya fitokoksinlerin sentezi ve (iii) mikobakterilerde oksidatif veya nitrosatif strese veya diğer elverişsiz durumlara karşı direnç (phylum Actinobacteria)1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. Sonuç olarak, F420 bağımlı oksidoreductases, endüstriyel ve farmasötik amaçlar için ve kontamine ortamların biyo-işletimi için biyokatalistler vaat ediyor1,23. Bu son bulgulara rağmen, kofaktör F420'nin kesin rolleri Actinobacteria veya diğer bakteriyel phyla'da hala marjinal olarak bilinmektedir.

F420 biyosentezi için en az üç yol vardır2,6,24. Başlangıçta, biyosentez yolu 5-deazaflavin biyosentez ve 2 fosfolactate metabolizma dalı olarak ayrılır. F420 molekülünün reaktif kısmı, tirozin ve 5-amino-6-ribitylamino-2,4(1H, 3H)-pyrimidinedione substratları kullanılarak FO-synthase yoluyla sentez edilir. Sonuç riboflavin seviyesi kromofor FO'dur. Şu anda kabul edilen laktat metabolizması dalında, L-laktat bir L-laktat kinaz (CofB) tarafından 2 fosfo-L-laktata ile fosforilasyon edilir; 2-fosfor-L-laktat, sırayla, 2-fosfor-L-laktat guanylyltransfeaz (CofC) tarafından L-lactyl-2-diphospho-5'-guanosine guanylated edilir. Bir sonraki adımda, L-lactyl-2-diphospho-5'-guanosine, F420-02'yi oluşturmak için 2 fosfo-L-laktat transferaz (CofD) ile FO'ya bağlanır. Son olarak, F420-0:ɣ-glutamil ligaz (CofE) enzimi glutamat monomerlerini F420-0'a bağlar ve son kofaktör6'yı değişen sayılarda oluşturur23,25. Farklı organizmalar, ekli glutamat kalıntılarının sayısında farklı desenler gösterir ve metanojenler için mikobakterilere göre daha kısa kuyruklar bulunur2,25,26. Genellikle, metanojenler kuyruk uzunluklarını iki ila üç arasında gösterir, asetoklastik metanojende beşe kadar, Methanosarcina sp., Mycobacterium sp.'de bulunan kuyruk uzunlukları ise beş ila yedi glutamat kalıntısı arasında değişmektedir2,25,26,27. Bununla birlikte, son bulgular, uzun zincirli F420'nin kısa zincirli F420'den daha yüksek bir benzeğe sahip F420 bağımlı oksitodikozlara bağlandığını göstermiştir; ayrıca, bağlı uzun zincirli F420, substrat benzeşimini arttırır, ancak ilgili enzimlerin ciro oranını azaltır23.

Kofaktör F420'nin tespiti genellikle floresansına dayanır. Böylece, oligo glutamat türevleri ters faz (RP)-HPLC27,28 kullanılarak ayrıldı. Son zamanlarda, Ney ve arkadaşları RP-HLPC'deki ayrımı başarıyla artırmak için negatif yüklü glutamat kuyruğu için iyon eşleştirme reaktifi olarak tetrabutylammonium hidroksit kullandılar5. Burada, sadece saf kültürlerden değil, aynı zamanda farklı çevresel örneklerden (yani topraklar ve digester çamuru) numunelerin hazırlanması, sonraki liziz, ekstraksiyon, saflaştırma, ayırma ve koordinasyon için bir yöntem sunuyoruz.

Protokol

NOT: Kofaktör F420'nin ekstraksiyonu ve analizi, numune lizisi, katı faz ekstraksiyonu (SPE) ile kofaktör ön saflaştırma ve floresan algılamalı iyon eşleştirilmiş-RP-HPLC (IP-RP-HPLC) ile kofaktör algılama dahil olmak üzere üç adımlı bir süreçtir. Başlamadan önce, malzemeleri ve reaktifleri Tablo 1'de belirtildiği gibi hazırlayın.

1. Örnek liziz

  1. Uygun tüplere (örneğin, 50 mL konik tüpler) 5 g'a kadar numune ekleyin.
  2. Numunelere 5 mL lizis tamponu (2x stok çözeltisi, Tablo 1) ekleyin.
  3. 0,5 g·mL-1'lik son konsantrasyona ulaşmak için damıtılmış su ile 10 mL'lik son hacme getirin.
  4. 20 s için seyreltilmiş örnekleri girdap.
  5. 121 °C'de 30 dakika otoklav.
  6. Orman toprağı gibi kuru numuneler için, seyreltilmiş numuneyi otoklavladıktan ve girdapladıktan sonra damıtılmış su ile 20 mL'lik son hacme getirin.
    DİkKAT: Otomatik kapanma sırasında sıcaklık artışı tüplerin patlamasına neden olabilir.

2. Katı fazlı ekstraksiyon (SPE) ile kofaktör F 420'nin ön saflaştırılması

NOT: SPE'nin tüm adımları oda sıcaklığında gerçekleştirilir

  1. Numuneleri oda sıcaklığına kadar soğutun.
  2. Otomatik kapatılmış numuneleri 11.000 x g'da 5 dakika santrifüj edin.
  3. 100 mg zayıf anion karışık mod polimerik sorbent ile dolu 5 mL SPE sütunları hazırlayın.
  4. Anion eşanjörü 3 mL metanol ile koşullandırılmıştır (durum çözeltisi, Tablo 1).
  5. Anion eşanjörü 3 mL damıtılmış su ile dengelenin (denge çözeltisi, Tablo 1).
  6. Santrifüjlü lisattan SPE sütununa 9,0 mL'ye kadar süpernatant yükleyin.
  7. Safsızlıkları 5 mL 25 mM amonyum asetatla yıkayın (SPE yıkama çözeltisi 1, Tablo 1).
  8. Safsızlıkları 5 mL metanol ile yıkayın (SPE yıkama çözeltisi 2, Tablo 1).
  9. F420 kofaktörini 1,0 mL elution tamponunda (Tablo 1) elüte edin.
    NOT: Taze elution tamponu hazırlayın. Uygulanan vakum ve elution tamponunun yüksek buhar basıncı nedeniyle, elüsyon hacimleri numuneden numuneye farklılık gösterebilir. Tüm numunelerde aynı son hacmin sabitlenebilmesi için, toplama kaplarının elution öncesi ve sonrası tartılması ve etkili elüasyon hacminin hesaplanması önerilir. Elution tamponu eklenerek farklılıkları dengeleyin.

3. Cofactor F420'nin tespiti

  1. Fırını 40 °C'ye ve floresan dedektörünü 420 nm yok olma dalga boylarına ve 470 nm emisyon dalga boylarına ayarlayın. A ve B mobil aşamalarını kullanarak degrade modu ile ayırmayı elde edin (Tablo 1): 0-3 dk: % 26 B; 3-24 dk: %26-%50 B; 24-25 dk: %50 B; 25-27 dk: %50-%26 B; 27-35 dk: 0,75 mL·dk-1 akış hızında %26 B.
    NOT: Sütunu en az %74 mobil faz A ve %26 mobil faz B'nin 3 sütun hacmiyle temizlenerek numune enjekte etmeden önce sütun koşullarının dengesini garanti edin (Tablo 1).
    1. 0,22 μm gözenek boyutuna sahip bir PTFE filtresi kullanarak SPE'den elde edilen örnekleri HPLC şişelerine filtreleyin.
      NOT: Gözenek boyutu 0,22 μm olan PTFE filtreleri önerilir.
    2. Kofaktör F420 bileşimini ve konsantrasyonunu analiz etmek için HPLC sistemine 50 μL eluted numune enjekte edin.
      NOT: Bu protokolde nicel standart kullanılmadıkça, numunelerin ve varyantların pik alanla karşılaştırılması gerekir.

Sonuçlar

Her ikisi de termofilik metanojenik Arkea olan Methanosarcina thermophila ve Methanoculleus thermophilus'un saf kültürleri, daha önce açıklandığı gibi uygun medyada yetiştirildi29,30. Metanosarcina thermophila için metanol enerji kaynağı olarak kullanılırken, H2/CO2'de Metanoculleus thermophilus yetiştirildi. Büyüme mikroskobik değerlendirme ile kontrol edilirken, aktivite daha ?...

Tartışmalar

Metanojenik saf kültürlerden kofaktör F420'nin değerlendirilmesi için, ilgili mikroorganizmaların büyümesini ve aktivitesini (floresan mikroskopi) görselleştirmek için mikroskobik bir değerlendirme yapılabilir (Şekil 1). Doğal ortamlardan türeyen numuneler için, F420'yi tespit etmek veya ölçmek için mikroskopi kullanımı, diğer floresan mikroorganizmalar, organik ve inorganik parçacıklarla yapılan girişimler nedeniyle sınırlıdır. Bu bağlam...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Arınmış kofaktör F420'ye destek için Prof. Colin Jackson'a minnettarız. Bu araştırma Tirol bilim fonu (TWF) ve Universität Innsbruck (Publikationsfonds) tarafından desteklenmiştir. GPS, HK, SB, GG ve HB'nin desteğini büyük ölçüde kabul ediyoruz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Autoclave
Biocompatible HPLC system equipped with gradient modul, oven and fluorescence detectorShimadzuHPLC system
Centrifuge and rotor for 50 mL “Falcon” tubes (11.000 rcf) and appropriate tubes
HPLC Column: Gemini NX C18, 5 μm, 150 x 3 mmPhenomenexHPLC column
PTFE filter (pore size 0.22 µm) to remove particulate matter prior HPLC analysis
Resin for SPE: Strata-X-AW 33 μm as weak anion mixed-mode polymeric sorbentPhenomenexweak anion mixed-mode polymeric sorbent
Vacuum manifold for SPE and appropriate collection tubesSPE equipment
Vortex mixer

Referanslar

  1. Greening, C., et al. Physiology, biochemistry, and applications of F420- and Fo-dependent redox reactions. Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 80 (2), 451-493 (2016).
  2. Bashiri, G., et al. A revised biosynthetic pathway for the cofactor F420 in prokaryotes. Nature Communications. 10 (1), 451 (2019).
  3. Grinter, R., Greening, C. Cofactor F420: an expanded view of its distribution, biosynthesis, and roles in bacteria and archaea. FEMS Microbiology Reviews. , (2021).
  4. Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. Proposed structure for coenzyme F 420 from methanobacterium. Biochemistry. 17 (22), 4583-4593 (1978).
  5. Ney, B., et al. The methanogenic redox cofactor F420 is widely synthesized by aerobic soil bacteria. The ISME Journal. 11 (1), 125-137 (2017).
  6. Braga, D., et al. Metabolic pathway rerouting in Paraburkholderia rhizoxinica evolved long-overlooked derivatives of coenzyme F420. ACS Chemical Biology. 14 (9), 2088-2094 (2019).
  7. Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. Distribution of coenzyme F420 and properties of its hydrolytic fragments. Journal of Bacteriology. 140 (1), 20-27 (1979).
  8. Michaelis, W., et al. Microbial reefs in the Black Sea fueled by anaerobic oxidation of methane. Science. 297 (5583), 1013-1015 (2002).
  9. Knittel, K., Lösekann, T., Boetius, A., Kort, R., Amann, R. Diversity and distribution of methanotrophic archaea at cold seeps. Applied and Environmental Microbiology. 71 (1), 467-479 (2005).
  10. Lin, X. -. L., White, R. H. Occurrence of Coenzyme F420 and Its y-Monoglutamyl derivative in nonmethanogenic archaebacteria. Journal of Bacteriology. 168 (1), 444-448 (1986).
  11. Spang, A., et al. The genome of the ammonia-oxidizing Candidatus Nitrososphaera gargensis: insights into metabolic versatility and environmental adaptations. Environmental Microbiology. 14 (12), 3122-3145 (2012).
  12. Mand, T. D., Metcalf, W. W. Energy conservation and hydrogenase function in methanogenic archaea, in particular the genus Methanosarcina. Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 83 (4), (2019).
  13. Lupa, B., Hendrickson, E. L., Leigh, J. A., Whitman, W. B. Formate-dependent H2 production by the mesophilic methanogen Methanococcus maripaludis. Applied and Environmental Microbiology. 74 (21), 6584-6590 (2008).
  14. Kulkarni, G., Mand, T. D., Metcalf, W. W. Energy conservation via hydrogen cycling in the methanogenic archaeon Methanosarcina barkeri. mBio. 9 (4), (2018).
  15. Purwantini, E., Gillis, T. P., Daniels, L. Presence of F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase in Mycobacterium and Nocardia species, but absence from Streptomyces and Corynebacterium species and methanogenic Archaea. FEMS Microbiology Letters. 146 (1), 129-134 (1997).
  16. Purwantini, E., Daniels, L. Purification of a novel coenzyme F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase from Mycobacterium smegmatis. Journal of Bacteriology. 178 (10), 2861-2866 (1996).
  17. McCormick, J. R. D., Morton, G. O. Identity of cosynthetic factor I of Streptomyces aureofaciens and fragment FO from coenzyme F420 of Methanobacterium species. Journal of the American Chemical Society. 104 (14), 4014-4015 (1982).
  18. Coats, J. H., Li, G. P., Kuo, M. -. S. T., Yurek, D. A. Discovery, production, and biological assay of an unusual flavenoid cofactor involved in lincomycin biosynthesis. The Journal of Antibiotics. 42 (3), 472-474 (1989).
  19. Bown, L., Altowairish, M. S., Fyans, J. K., Bignell, D. R. D. Production of the Streptomyces scabies coronafacoyl phytotoxins involves a novel biosynthetic pathway with an F420 -dependent oxidoreductase and a short-chain dehydrogenase/reductase. Molecular Microbiology. 101 (1), 122-135 (2016).
  20. Gurumurthy, M., et al. A novel F(420) -dependent anti-oxidant mechanism protects Mycobacterium tuberculosis against oxidative stress and bactericidal agents. Molecular microbiology. 87 (4), 744-755 (2013).
  21. Greening, C., et al. Mycobacterial F420H2-dependent reductases promiscuously reduce diverse compounds through a common mechanism. Frontiers in Microbiology. 8, 1000 (2017).
  22. Mathew, S., Trajkovic, M., Kumar, H., Nguyen, Q. -. T., Fraaije, M. W. Enantio- and regioselective ene-reductions using F420H2-dependent enzymes. Chemical Communications. 54 (79), 11208-11211 (2018).
  23. Ney, B., et al. Cofactor tail length modulates catalysis of bacterial F420-dependent oxidoreductases. Frontiers in Microbiology. 8, 1902 (2017).
  24. Grinter, R., et al. Cellular and structural basis of synthesis of the unique intermediate dehydro-F420-0 in mycobacteria. mSystems. 5 (3), (2020).
  25. Peck, M. W. Changes in concentrations of coenzyme F420 analogs during batch growth of Methanosarcina barkeri and Methanosarcina mazei. Applied and Environmental Microbiology. 55 (4), (1989).
  26. Gorris, L. G., vander Drift, C. Cofactor contents of methanogenic bacteria reviewed. BioFactors. 4 (3-4), 139-145 (1994).
  27. Bair, T. B., Isabelle, D. W., Daniels, L. Structures of coenzyme F(420) in Mycobacterium species. Archives of Microbiology. 176 (1-2), 37-43 (2001).
  28. Portillo, M. C., Gonzalez, J. M. Moonmilk deposits originate from specific bacterial communities in Altamira Cave (Spain). Microbial Ecology. 61, (2011).
  29. Wagner, A. O., et al. Medium preparation for the cultivation of microorganisms under strictly anaerobic/anoxic conditions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60155 (2019).
  30. Lackner, N., Hintersonnleitner, A., Wagner, A. O., Illmer, P. Hydrogenotrophic methanogenesis and autotrophic growth of Methanosarcina thermophila. Archaea. 2018 (5), 1-7 (2018).
  31. Wagner, A. O., Reitschuler, C., Illmer, P. Effect of different acetate: Propionate ratios on the methanogenic community during thermophilic anaerobic digestion in batch experiments. Biochemical Engineering Journal. 90, 154-161 (2014).
  32. Wagner, A. O., et al. Sample preparation, preservation, and storage for volatile fatty acid quantification in biogas plants. Engineering in Life Sciences. 17 (2), 132-139 (2017).
  33. Bashiri, G., Rehan, A. M., Greenwood, D. R., Dickson, J. M. J., Baker, E. N. Metabolic engineering of cofactor F420 production in Mycobacterium smegmatis. PloS one. 5 (12), 15803 (2010).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

evre BilimleriSay 176F420koenzim F420kofakt r F420redoks koenzimmetanogenezkat faz ekstraksiyonuF420 kuyruk uzunlu upoliglutamat kuyruk

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır