Извлечение кофактора F420 для анализа длины хвоста полиглутамита из метаногенных чистых культур и образцов окружающей среды

Резюме

Метод извлечения кофактора _F420 из чистых культур оптимизирован для жидкостного хроматографического разделения и анализа длины хвоста _F420 в чистых культурах и образцах окружающей среды.

Аннотация

Кофактор _F420 играет центральную роль в качестве гидридного носителя в первичном и вторичном метаболизме многих бактериальных и архейных таксонов. Кофактор наиболее известен своей ролью в метаногенезе, где он облегчает термодинамически сложные реакции. Поскольку хвост полиглутамата варьируется по длине между различными организмами, анализ профиля длины может быть мощным инструментом для различения и характеристики различных групп и путей в различных местах обитания. Здесь протокол описывает экстракцию и оптимизацию обнаружения кофактора _F420 путем применения твердофазной экстракции в сочетании с высокоэффективным жидким хроматографическим анализом, независимым от культурных или молекулярно-биологических подходов. Метод применялся для получения дополнительной информации о экспрессии кофактора _F420 из микробных сообществ в почвах, анаэробном осадке и чистых культурах и оценивался путем пиковых экспериментов. Таким образом, исследование преуспело в создании различных профилей длины хвоста _F420 для гидрогенотрофных и ацетокластических метаногенов в контролируемых метаногенных чистых культурах, а также из образцов окружающей среды, таких как анаэробный осадок реактора и почвы.

Введение

_F420 является широко распространенным, но часто игнорируемым кофактором, который функционирует как облигатный двухэлектронный гидридный носитель в первичных и вторичных метаболических процессах как архей, так и бактерий1,2. _F420 представляет собой 5-деазафлавин и структурно похож на флавины, благодаря чему его химические и биологические свойства более сопоставимы с свойствами NAD⁺ или NADP⁺. Благодаря замещению азота углеродом в положении 5 изоаллоксазинового кольца, он является сильным восстановителем, проявляя при этом низкий стандартный окислительно-восстановительный потенциал -340 ^мВ1,3. _F420 содержит 5-деазафлавиновое кольцо и 2-фосфо-L-лактатный линкер (_F420-0). Хвост олигоглутамата, содержащий мономеры глутамата n+1, может быть присоединен к молекуле (_F420-n+1)⁴.

Долгое время кофактор _F420 был связан исключительно с археями и актинобактериями. Это в значительной степени было отменено. Недавние анализы показали, что _F420 распределен среди различных анаэробных и аэробных организмов типа Протеобактерий, Хлорофлекси и потенциально Фирмикутов, населяющих мириады мест обитания, таких как почвы, озера и кишечник ^{человека1,5}. В 2019 году Braga et ^al.6 показали, что протеобактерия Paraburkholderia rhizoxinica производит уникальное производное _F420, содержащее 3-фосфоглицерат вместо 2-фосфолактатного хвоста, который может быть широко распространен в различных местах обитания. В пределах домена Archaea, _F420 был обнаружен в нескольких линиях, включая метаногенный7, метанотрофический8,9 и сульфатредуцирующий ^{порядки10}, и предполагается, что он производится в Thaumarchaeota11. _F420 наиболее известен как незаменимый окислительно-восстановительный коэнзим в гидрогенотрофном и метилотрофном метаногенезе. Восстановленная форма _F420 (_F420H2) функционирует как донор электронов для восстановления метилентетрагидрометаноптерина (метилен-H4MPT, Mer) и метенил-H4MPT12,13. Он также может быть использован в качестве носителя электронов в _{H2-независимых} путях переноса электронов метаногенов, содержащих цитохромы12,14. Более того, окисленная форма _F420 обладает характерной сине-зеленой флуоресценцией при возбуждении при 420 нм, что облегчает обнаружение метаногенов микроскопически (рис. 1). Благодаря низкому окислительно-восстановительному потенциалу _F420 способствует (i) экзогенному восстановлению широкого спектра непокорных или токсичных органических соединений, (ii) синтезу тетрациклиновых и линкозамидных антибиотиков или фитотоксинов в стрептомицетах (тип актинобактерий) и (iii) устойчивости к окислительному или нитрозативному стрессу или другим неблагоприятным условиям у микобактерий (тип Актинобактерий)^1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. Следовательно, _{F420-зависимые} оксидоредуктазы являются перспективными биокатализаторами для промышленных и фармацевтических целей, а также для биоремедиации загрязненных ^сред1,23. Несмотря на эти недавние результаты, точные роли кофактора _F420 все еще незначительно известны в актинобактериях или других бактериальных типах.

Существует, по крайней мере, три пути биосинтеза _F4202,6,24. Вначале путь биосинтеза расщепляется на 5-деазафлавиновый биосинтез и 2-фосфолактатную ветвь метаболизма. Реакционноспособную часть молекулы _F420 синтезируют через _{FO-синтазу} с использованием субстратов тирозина и 5-амино-6-рибитиламино-2,4(1H, 3H)-пиримидиндиона. Результатом является уровень рибофлавина хромофора _FO. В пределах принятой в настоящее время ветви метаболизма лактата L-лактат фосфорилируется до 2-фосфо-L-лактата L-лактат-киназой (CofB); 2-фосфо-L-лактат, в свою очередь, гуанилируется до L-лактил-2-дифосфо-5'-гуанозина 2-фосфо-L-лактат гуанилилтрансферазой (CofC). На следующем этапе L-лактил-2-дифосфо-5'-гуанозин связывается с _FO 2-фосфо-L-лактат-трансферазой (CofD) с образованием _F420-02. Наконец, фермент _F420-0:ɣ-глутамиллигаза (CofE) связывает мономеры глутамата до _F420-0, образуя конечный кофактор6 в различных ^{количествах23,25}. Различные организмы демонстрируют разные закономерности в количестве прикрепленных остатков глутамата, причем более короткие хвосты обнаруживаются для метаногенов, чем у микобактерий2,25,26. Как правило, метаногены показывают длину хвоста от двух до трех, с пятью в ацетокластическом метаногене, Methanosarcina sp., в то время как длина хвоста, обнаруженная в Mycobacterium sp., варьировалась от пяти до семи остатков глутамата2,25,26,27. Однако недавние результаты показали, что длинноцепочечный _F420 связывается с _{F420-зависимыми} оксидоредуктазами с более высоким сродством, чем короткоцепочечный _F420; кроме того, связанный длинноцепочечный _F420 увеличивает сродство субстрата, но уменьшает скорость оборота соответствующих ^{ферментов23}.

Обнаружение кофактора _F420 часто основывается на его флуоресценции. Таким образом, его производные олиго глутамата были разделены с использованием обратной фазы (RP)-^HPLC27,28. Недавно Ney et al. использовали гидроксид тетрабутиламмония в качестве реагента ионного спаривания для отрицательно заряженного хвоста глутамата для успешного улучшения разделения на RP-HLPC5. Здесь мы представляем способ подготовки образцов, последующего лизиса, экстракции, очистки, разделения и количественной оценки кофактора _F420 не только из чистых культур, но и из различных образцов окружающей среды (т.е. почв и осадка реактора).

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Экстракция и анализ кофактора _F420 представляет собой трехэтапный процесс, включающий лизис образца, предварительную очистку кофактора с помощью твердофазной экстракции (SPE) и обнаружение кофакторов с помощью ионно-парного RP-ВЭЖХ (IP-RP-HPLC) с флуоресцентным обнаружением. Перед началом работы подготовьте материалы и реагенты, как указано в таблице 1.

1. Лизис образца

1. Добавьте до 5 г образца в соответствующие пробирки (например, конические пробирки по 50 мл).
2. Добавьте к образцам 5 мл лизисного буфера (2x запасной раствор, таблица 1).
3. Довести до конечного объема 10 мл с дистиллированной водой до достижения конечной концентрации 0,5 г·^мл-1.
4. Вихрь разбавленных образцов в течение 20 с.
5. Автоклав в течение 30 мин при 121 °C.
6. Для сухих образцов, таких как лесная почва, доведите до конечного объема 20 мл с дистиллированной водой после автоклавирования и вихрь разбавленного образца.
   ВНИМАНИЕ: Повышение температуры во время автоклавирования может привести к разрыву трубок.

2. Предварительная очистка кофактора F ₄₂₀ методом твердофазной экстракции (SPE)

ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы SPE проводятся при комнатной температуре

1. Охладите образцы до комнатной температуры.
2. Центрифугировать автоклавные образцы в течение 5 мин при 11 000 х г.
3. Готовят 5 мл колонн SPE, заполненных 100 мг слабого анионного смешанного полимерного сорбента.
4. Кондиционируйте анионообменник 3 мл метанола (кондиционирующий раствор, табл. 1).
5. Уравновешивают анионообменник 3 мл дистиллированной воды (раствор равновесия, табл. 1).
6. Загрузите до 9,0 мл супернатанта из центрифугированного лизата на колонну SPE.
7. Смойте примеси 5 мл ацетата аммония 25 мМ (промывочный раствор SPE 1, таблица 1).
8. Смойте примеси 5 мл метанола (промывочный раствор SPE 2, таблица 1).
9. Элюируют кофактор _F420 в 1,0 мл буфера элюирования (табл. 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте свежий буфер элюирования. Из-за приложенного вакуума и высокого давления пара буфера элюирования объемы элюирования могут отличаться от образца к образцу. Чтобы обеспечить одинаковый конечный объем во всех образцах, рекомендуется взвесить сосуды для сбора до и после элюирования и рассчитать эффективный объем элюирования. Сбалансируйте различия путем добавления буфера элюирования.

3. Обнаружение кофактора _F420

1. Установите духовку на 40 °C и флуоресцентный детектор на 420 нм с длиной волны вымирания и длиной волны излучения 470 нм. Достижение разделения в режиме градиента с использованием подвижных фаз A и B (таблица 1): 0-3 мин: 26% B; 3-24 мин: 26%-50% B; 24-25 мин: 50% B; 25-27 мин: 50%-26% B; 27-35 мин: 26% В при расходе 0,75 мл·^мин-1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Гарантировать уравновешивание условий колонны перед впрыском образцов путем промывки колонны по меньшей мере 3-х колонными объемами 74% подвижной фазы А и 26% подвижной фазы В (таблица 1).
   1. Фильтруйте элюированные образцы из SPE во флаконы ВЭЖХ с помощью фильтра из PTFE с размером пор 0,22 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать фильтры из PTFE с размером пор 0,22 мкм.
   2. Вводят 50 мкл элюированного образца в систему ВЭЖХ для анализа состава и концентрации кофактора _F420 .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку в этом протоколе не используется количественный стандарт, образцы и варианты должны сравниваться по пиковой зоне.

Результаты

Чистые культуры Methanosarcina thermophila и Methanoculleus thermophilus, оба термофильные метаногенные археи, выращивались в подходящей среде, как описано ^{ранее29,30}. Для Methanosarcina thermophila метанол использовался в качестве источника энергии, тогда как Methanoculleus therm...

Обсуждение

Для оценки кофактора _F420 из метаногенных чистых культур может быть выполнена микроскопическая оценка для визуализации роста и активности (флуоресцентная микроскопия) вовлеченных микроорганизмов (фиг.1). Для образцов, полученных из природной среды, использование м...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Autoclave
Biocompatible HPLC system equipped with gradient modul, oven and fluorescence detector	Shimadzu		HPLC system
Centrifuge and rotor for 50 mL “Falcon” tubes (11.000 rcf) and appropriate tubes
HPLC Column: Gemini NX C18, 5 μm, 150 x 3 mm	Phenomenex		HPLC column
PTFE filter (pore size 0.22 µm) to remove particulate matter prior HPLC analysis
Resin for SPE: Strata-X-AW 33 μm as weak anion mixed-mode polymeric sorbent	Phenomenex		weak anion mixed-mode polymeric sorbent
Vacuum manifold for SPE and appropriate collection tubes			SPE equipment
Vortex mixer