Descelularización para la preparación de matriz de piel acelular humana altamente conservada para medicina regenerativa

Resumen

La piel humana descelularizada es adecuada para la regeneración de tejidos. Un problema importante de la descelularización es la preservación de la arquitectura nativa, junto con el contenido apropiado de proteínas estructurales, glicosaminoglicanos (GAG) y factores de crecimiento. El método propuesto permite una descelularización rápida y eficaz, produciendo una piel descelularizada con rasgos nativos bien conservados.

Resumen

La matriz extracelular (MEC) proporciona estímulos biofísicos y bioquímicos para apoyar la autorrenovación, proliferación, supervivencia y diferenciación de las células circundantes debido a su contenido de diversas moléculas bioactivas. Debido a estas características, el ECM ha sido considerado recientemente como un candidato prometedor para la creación de andamios biológicos para impulsar la regeneración de tejidos. Estudios recientes han demostrado que los tejidos humanos descelularizados podrían parecerse a la MEC nativa en sus perfiles estructurales y bioquímicos, preservando la arquitectura tridimensional (3D) y el contenido de moléculas biológicas fundamentales. Por lo tanto, la MEC descelularizada se puede emplear para promover la remodelación de tejidos, la reparación y la reconstrucción funcional de muchos órganos. La selección del procedimiento de descelularización adecuado es crucial para obtener tejidos acelulares que conserven las características del microambiente ideal para las células.

El protocolo descrito aquí proporciona una descripción detallada paso a paso del método de descelularización para obtener una MEC biológica libre de células reproducible y eficaz. Los fragmentos de piel de pacientes sometidos a cirugía plástica se redujeron y descelularizaron utilizando una combinación de dodecililsulfato de sodio (SDS), Triton X-100 y antibióticos. Para promover el transporte regular y homogéneo de la solución a través de las muestras, se encerraron en casetes de inclusión para garantizar la protección contra las agresiones mecánicas. Después del procedimiento de descelularización, el color blanco como la nieve de los fragmentos de piel indicó una descelularización completa y exitosa. Además, las muestras descelularizadas mostraron una arquitectura intacta y bien conservada. Los resultados sugieren que el método de descelularización propuesto fue efectivo, rápido y reproducible y protegió las muestras de daños arquitectónicos.

Introducción

La MEC sirve como un andamio para las células, sosteniéndolas a través de una arquitectura intrincada mantenida por diferentes componentes, y es uno de los principales factores responsables de las propiedades mecánicas del corazón y de la función del tejido cardíaco ^1,2. Cada vez hay más evidencias que sugieren que la MEC desempeña un papel activo en la remodelación de los tejidos, lo que hace obsoleta la suposición convencional de que la MEC es un componente pasivo 3,4,5,6. La función de la MEC es proporcionar señales biofísicas y bioquímicas a las células residentes. Está bien establecido que estas señales pueden influir en muchos comportamientos fundamentales de las células, afectando su función contráctil, proliferación, migración y potencial de diferenciación ^7,8,9. Así, la MEC se emplea cada vez más en la ingeniería de tejidos y en la medicina regenerativa como herramienta de apoyo terapéutico 9,10,11,12,13.

La MEC está formada por varias proteínas como el colágeno, la elastina, la fibronectina, el proteoglicano y la laminina, junto con factores de crecimiento unidos a la MEC, todos ellos implicados en los mecanismos de regeneración, como el reclutamiento, la migración y la diferenciación celular, así como en el alineamiento y la proliferación celular¹⁴. Las propiedades mecánicas de los tejidos también tienen gran relevancia en la fisiopatología de los órganos. De hecho, los cambios en las propiedades mecánicas a menudo se asocian con la aparición y la evolución de varias enfermedades. La razón reside en el hecho de que cuando se modifica la MEC, las señales provenientes del ambiente inducen cambios en la expresión de genes y proteínas, lo que lleva a un deterioro funcional^15,16.

Las terapias regenerativas para la reparación de órganos se centran actualmente en replicar el sofisticado microambiente del tejido nativo para curar el órgano donde el cuerpo falla. A pesar del rápido ritmo de muchos enfoques de ingeniería de tejidos, los tejidos aún no se pueden reproducir con precisión en su totalidad y complejidad mediante procedimientos artificiales. Los materiales sintéticos se han empleado en gran medida hasta ahora, ya que se pueden ajustar adecuadamente para simular las propiedades mecánicas y bioquímicas del microambiente celular. Sin embargo, tienen limitaciones, como la incapacidad de imitar las numerosas interacciones dentro del tejido nativo, el costo de las tecnologías para producirlas y el hecho de que son menos naturales y biocompatibles que el tejido nativo 17,18,19. Además, su composición, principalmente en términos de proteínas y factores solubles, difiere mucho de la natural, que es extremadamente difícil de replicar²⁰.

El enfoque de vanguardia en medicina regenerativa para reducir la brecha entre los pacientes que lo necesitan y los trasplantes de órganos es producir andamios hechos de matriz extracelular descelularizada (d-ECM) y repoblarlos con los tipos de células adecuados para regenerar los órganos dañados. La descelularización es el proceso en el que la MEC se aísla de sus células nativas y de su material genético para producir un andamiaje natural y biomimético, capaz de evitar la respuesta inmune y el rechazo una vez implantado en los pacientes 21,22,23. La MEC así obtenida puede ser repoblada para producir tejido funcional. El principal problema a la hora de desarrollar un d-ECM es el método. Para cualquier técnica de descelularización, el objetivo principal sigue siendo la preservación de la composición, la rigidez y la estructura 3D nativas de la ECM, y todas las estrategias tienen ventajas e inconvenientes. Debido a que la eliminación del contenido celular y el ADN del tejido requiere el uso de agentes químicos o físicos, o la combinación de ambos, cada procedimiento de descelularización causa, en diferentes grados, la interrupción de la MEC. Por lo tanto, es crucial minimizar el daño al ECM 24,25,26.

Es muy deseable la utilización de la MEC nativa como plataforma para la reconstitución de la MEC nativa in vitro. Para ello, se han aplicado varios protocolos de descelularización a una amplia gama de tejidos 27,28,29,30. De hecho, desde las primeras etapas de la investigación sobre la descelularización y el desarrollo de la MEC, varios tejidos, como arterias, válvulas aórticas y nervios periféricos, tanto de animales como de humanos, se han descelularizado, y algunos d-ECM todavía están disponibles comercialmente y se utilizan para el reemplazo de tejidos o la cicatrización de heridas 31,32,33. Recientemente, la piel humana también ha surgido como un candidato adecuado para producir andamios descelularizados para la reparación cardíaca debido a su composición y propiedades mecánicas, capaces de aumentar el potencial regenerativo de las células progenitoras cardíacas (CPC) y adaptarse a la contractilidad cardíaca³⁴. En este trabajo se describe un protocolo simple y rápido para producir andamios descelularizados a partir de piel humana adulta, permitiendo el desarrollo de un d-ECM con una arquitectura bien conservada.

Protocolo

Los especímenes de tejido humano se recolectaron de acuerdo con los principios de la Declaración de Helsinki y observando las directrices del Hospital Universitario "Federico II". Todos los pacientes que participaron en este estudio proporcionaron formularios de consentimiento por escrito.

1. Preparación de soluciones

1. Preparación de 1200 mL de solución descelularizante al 1%
   1. Prepare 600 mL de solución de Triton X-100 al 2% midiendo 588 mL de agua bidestilada en un cilindro graduado y transfiriéndolo a un vaso de precipitados de 1 L. Con una pipeta serológica, añada 12 ml de Triton X-100 y una barra agitadora al vaso de precipitados. Coloque el vaso de precipitados en un agitador magnético y mezcle la solución hasta que el Triton X-100 se disuelva por completo.
   2. Detén la agitación. Retire la barra de agitación con un recuperador de barra de agitación. Almacene a temperatura ambiente.
   3. Prepare 600 mL de solución SDS al 2% midiendo 550 mL de agua bidestilada en un cilindro graduado y transfiriéndolo a un vaso de precipitados de 1 L.
   4. Pesar 12 g de polvo de FDS en un recipiente de pesaje de plástico y transferirlo al vaso de precipitados que contiene el agua bidestilada en el paso 1.1.3.
      NOTA: El paso 1.1.4 debe realizarse bajo una cubierta química y el usuario debe usar equipo de protección personal.
   5. Agregue una barra de agitación, coloque el vaso de precipitados en un agitador magnético y mezcle la solución hasta que la FDS se disuelva por completo.
   6. Detenga el proceso de agitación. Retire la barra de agitación con un recuperador de barra de agitación.
   7. Transfiera la solución a un cilindro graduado y ajuste el volumen a 600 mL agregando agua destilada doble.
   8. Vierta la solución Triton X-100 al 2% preparada en el paso 1.1.1 en un cilindro de 2 L.
   9. Vierta la solución SDS al 2% preparada en los pasos 1.1.3-1.1.7 en el mismo cilindro de 2 L para obtener un volumen total de 1200 mL.
   10. Cubrir con parafilm y mezclar suavemente por inversión para obtener una solución homogénea.
   11. Transfiera la solución mezclada a una botella de 2 L usando un embudo para evitar la formación de espuma. Almacene la solución a +4 °C.
2. Preparación de 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS)
   1. Prepare 500 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x disolviendo 0,1 g de fosfato de potasio monobásico, 0,1 g de cloruro de potasio, 4,0 g de cloruro de sodio y 0,575 g de fosfato de sodio dibásico en agua estéril de doble destilación. Compruebe el valor de pH (7,4).
   2. Conservar a +4 °C hasta su uso.
3. Preparación de la solución antibiótica
   1. Pesar 625 μg de anfotericina B en un bote de pesaje de plástico.
   2. Pipetee 8 mL de una mezcla de penicilina y estreptomicina (pluma/estreptococo) en un tubo de 15 mL.
   3. Agregue la anfotericina B pesada a la mezcla de pluma/estreptococo y ajuste el volumen a 10 ml agregando la mezcla de penicilina y estreptomicina (pluma/estreptococo). Tape el tubo y disuelva la anfotericina B agitando vigorosamente.

2. Día 1: inicio del procedimiento de descelularización.

1. Vierta 400 ml de la solución descelularizante en un vaso de precipitados de 500 ml.
2. Agregue 2.0 mL de la solución antibiótica.

3. Preparación de muestras de piel

1. Lave la muestra de piel humana del abdomen de los pacientes que se someten a una abdominoplastia en una bandeja de plástico colocándola y volteándola boca abajo en una solución fisiológica isotónica de NaCl al 0,9% para eliminar el exceso de sangre y otros fluidos biológicos.
2. Retire el vello con pinzas finas y la grasa con tijeras quirúrgicas grandes.
3. Colocar la muestra de piel en la tabla de disección y diseccionarla con bisturí, tomando como referencia las graduaciones en la tabla de disección para obtener fragmentos de 3 cm x 2,5 cm (largo por ancho), evitando cicatrices y zonas sucias o quemadas del tejido.
4. Coloque cada fragmento en un casete de inclusión, ciérrelo y asegúrese de que todos los casetes estén debidamente bloqueados para evitar fugas de la muestra durante el procedimiento de descelularización.
5. Coloque un máximo de cuatro casetes de inclusión con muestras en un vaso de precipitados con la solución descelularizante. Agrega una barra para revolver. Cubrir con papel de aluminio, anotando en la parte superior toda la información para identificar la muestra y la hora de inicio del procedimiento.
6. Coloque el vaso de precipitados en el agitador magnético e inicie la agitación a una velocidad de rotación de 150 rpm. Detén la agitación. Retire el papel de aluminio que cubre el vaso de precipitados y extraiga los casetes de incrustación con pinzas largas.
   NOTA: Después de detener la agitación, verifique la claridad de la solución. Modificar la duración de la agitación (menos o más de 8 horas) en función del grado de enturbiamiento debido a la liberación de residuos celulares.
7. Coloque cada casete en un plato de 100 mm. Reemplace la solución descelularizante repitiendo los pasos 3.5-3.6 durante la noche.

4. Día 2: verifique el estado de las muestras de piel.

1. Detenga el proceso de agitación. Retire el papel de aluminio que cubre el vaso de precipitados y extraiga los casetes de incrustación con pinzas largas.
2. Coloque cada casete en un plato de 100 mm y ábralo. Comprueba el color de la muestra.
   NOTA: Las muestras pueden mostrar un cambio de color del beige nativo al blanco nieve.
3. Eliminar el vello residual y separar la epidermis de la dermis. Reemplace la solución descelularizante repitiendo los pasos 3.5-3.6.
4. Detenga la agitación después de 8 h. Repita los pasos 4.1-4.2 hasta que la muestra aparezca blanca como la nieve. Detenga el procedimiento de descelularización.
   NOTA: El tiempo de exposición a la acción de los detergentes puede extenderse si es necesario.
5. Mida 400 mL de 1x PBS en un cilindro de 500 mL, viértalo en un vaso de precipitados de 500 mL y agregue 2 mL de la mezcla de Pen Strep/Anfotericina B. Agrega una barra para revolver.
6. Coloque un máximo de cuatro casetes que contengan las muestras en cada vaso de precipitados con la solución de PBS/antibióticos. Cubra con papel de aluminio y escriba toda la información en la parte superior como en el paso 3.5.
7. Coloque el vaso de precipitados en un agitador magnético e inicie la agitación a una velocidad de rotación de 150 rpm durante la noche, a temperatura ambiente.

5. Día 3 - un lavado final de las muestras

1. Detén la agitación. Reemplace la solución 1x PBS con 400 mL de agua destilada doble. Agrega una barra para revolver. Cubra con papel de aluminio y escriba toda la información en la parte superior como en el paso 3.5.
2. Coloque el vaso de precipitados en un agitador magnético e inicie la agitación a una velocidad de rotación de 150 rpm durante 30 minutos.
3. Detenga el proceso de agitación. Retire el papel de aluminio que cubre el vaso de precipitados y extraiga los casetes de incrustación con pinzas largas.
4. Coloque cada casete de inclusión que contenga la muestra de piel descelularizada en un plato de 100 mm. Abra los casetes y seque suavemente las muestras de piel frotándolas con toallitas de laboratorio.
5. Colocar cada muestra de piel descelularizada en un recipiente de pesaje previamente marcado con la información sobre la muestra. Cubra el bote con papel de aluminio y escriba toda la información en la parte superior para identificar la muestra. Almacenar a -80 °C.

Resultados

El objetivo del protocolo fue obtener una muestra de d-ECM de piel a partir de tejido biológico, manteniendo una estructura 3D bien organizada y un contenido bien conservado de moléculas biológicas (Figura 1). Este método se basa principalmente en la agitación constante de las muestras en una solución que contiene la combinación de dos detergentes, Triton X-100 y SDS, preservando así las características biológicas y estructurales típicas del tejid...

Discusión

Aunque el protocolo descrito anteriormente se ha optimizado y mejorado en comparación con los protocolos publicados anteriormente, presenta algunos pasos críticos que requieren atención y precisión. Debe evitarse la formación de espuma durante la preparación de la solución descelularizante para evitar la dilución incorrecta de los detergentes. Esto podría abordarse vertiendo suavemente las soluciones y haciéndolas fluir a lo largo del lado interior del cilindro. Además, se deb...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% NaCl isotonic Physiological solution	Sigma-Aldrich	S8776	0.9% in water
1 L beaker	VWR	511-0318	Clean and autoclave before use
10 mL serological pipet	Falcon	357551	Sterile,  polystyrene
100 mm plates	Falcon	351029	Treated, sterile cell culture dish
15 mL sterile tubes	Falcon	352097	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
1 L graduated cylinder	VWR	612-1524	Clean and autoclave before use
2 L bottle	VWR	215-1596	Clean and autoclave before use
25 mL serological pipet	Falcon	357525	Sterile,  polystyrene
2 L graduated cylinder	VWR	612-3072	Clean and autoclave before use
500 mL beaker	VWR	511-0317	Clean and autoclave before use
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	Y0000005	Powder
Dissecting board	VWR	100498-398	Made of high-density polyethylene.
Dissecting scalpel	VWR	233-5526	Sterile and disposable
Embedding cassettes	Diapath	070191	External dimensions: 40x26x7 mm (WxDxH)
Fine forceps	VWR	232-1317	Clean and autoclave before use
Funnel	VWR	221-1861	Clean and autoclave before use
Hexagonal weighing boats size M	Sigma-Aldrich	Z708585	Hexagonal, polystyrene, 51 mm Bottom I.D., 64 mm Top I.D.
Hexagonal weighing boats size S	Sigma-Aldrich	Z708577	Hexagonal, polystyrene, 25 mm Bottom I.D., 38 mm Top I.D.
Large surgical scissors	VWR	233-1211	Clean and autoclave before use
Long forceps	VWR	232-0096	Clean and autoclave before use
Penicillin and Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333-100ml	Stabilized, with 10.000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, 0.1 μm filtered. Store at -20°C.  The solution  should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles Solution.
Pipette gun	Eppendorf	613-2795	Eppendorf Easypet® 3
Plastic tray	VWR	BELAH162620000	Corrosion-proof polypropylene plastic tray
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P9333	Powder
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma-Aldrich	P5665	Powder
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653	Powder
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	62862	Powder
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma-Aldrich	94046	Powder
Spatula	VWR	RSGA038.210	Clean and autoclave before use
Spoon	VWR	231-1314	Clean and autoclave before use
Stir bar	VWR	442-0362	Clean and autoclave before use
Stir bar retriever	VWR	89026-262	Molded in pure, FDA-approved PTFE
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1	Liquid