Dezellularisierung zur Herstellung einer hochkonservierten humanen azellulären Hautmatrix für die regenerative Medizin

Zusammenfassung

Dezellularisierte menschliche Haut eignet sich für die Geweberegeneration. Ein Hauptproblem der Dezellularisierung ist die Erhaltung der nativen Architektur sowie der angemessene Gehalt an Strukturproteinen, Glykosaminoglykanen (GAGs) und Wachstumsfaktoren. Die vorgeschlagene Methode ermöglicht eine schnelle und effektive Dezellularisierung, wodurch dezellularisierte Haut mit gut erhaltenen nativen Merkmalen erzeugt wird.

Zusammenfassung

Die extrazelluläre Matrix (ECM) liefert biophysikalische und biochemische Stimuli, um die Selbsterneuerung, Proliferation, das Überleben und die Differenzierung der umgebenden Zellen aufgrund ihres Gehalts an verschiedenen bioaktiven Molekülen zu unterstützen. Aufgrund dieser Eigenschaften gilt die EZM in jüngster Zeit als vielversprechender Kandidat für die Herstellung biologischer Gerüste zur Förderung der Geweberegeneration. Neue Studien haben gezeigt, dass dezellularisierte menschliche Gewebe in ihren strukturellen und biochemischen Profilen der nativen EZM ähneln können, wobei die dreidimensionale (3D) Architektur und der Gehalt an grundlegenden biologischen Molekülen erhalten bleiben. Daher kann die dezellularisierte EZM eingesetzt werden, um den Gewebeumbau, die Reparatur und die funktionelle Rekonstruktion vieler Organe zu fördern. Die Auswahl des geeigneten Dezellularisierungsverfahrens ist entscheidend, um azelluläres Gewebe zu erhalten, das die Eigenschaften der idealen Mikroumgebung für Zellen beibehält.

Das hier beschriebene Protokoll bietet eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Beschreibung des Dezellularisierungsverfahrens zur Erzielung einer reproduzierbaren und effektiven zellfreien biologischen EZM. Hautfragmente von Patienten, die sich einer plastischen Operation unterzogen, wurden verkleinert und mit einer Kombination aus Natriumdodecylsulfat (SDS), Triton X-100 und Antibiotika dezellularisiert. Um einen gleichmäßigen und homogenen Transport der Lösung durch die Proben zu fördern, wurden diese in Einbettkassetten eingeschlossen, um den Schutz vor mechanischen Einwirkungen zu gewährleisten. Nach der Dezellularisierung zeigte die schneeweiße Farbe der Hautfragmente eine vollständige und erfolgreiche Dezellularisierung an. Zusätzlich zeigten dezellularisierte Proben eine intakte und gut erhaltene Architektur. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die vorgeschlagene Dezellularisierungsmethode effektiv, schnell und reproduzierbar war und die Proben vor architektonischen Schäden schützte.

Einleitung

Die EZM dient als Gerüst für die Zellen, indem sie sie durch eine komplizierte Architektur unterstützt, die von verschiedenen Komponenten aufrechterhalten wird, und sie ist einer der Hauptfaktoren, die für die mechanischen Eigenschaften des Herzens und der Funktion des Herzgewebes verantwortlich sind ^1,2. Immer mehr Hinweise deuten darauf hin, dass die EZM eine aktive Rolle beim Umbau des Gewebes spielt, so dass die konventionelle Annahme, dass die EZM eine passive Komponente ist, obsolet ist 3,4,5,6. Die Rolle der EZM besteht darin, den ansässigen Zellen biophysikalische und biochemische Signale zu geben. Es ist allgemein bekannt, dass diese Signale viele grundlegende Zellverhaltensweisen beeinflussen können, was sich auf ihre kontraktile Funktion, Proliferation, Migration und Differenzierungspotenzial auswirkt ^7,8,9. Daher wird die EZM zunehmend im Tissue Engineering und in der regenerativen Medizin als therapeutisches Unterstützungsinstrument eingesetzt 9,10,11,12,13.

Die EZM besteht aus mehreren Proteinen wie Kollagen, Elastin, Fibronektin, Proteoglykan und Laminin sowie EZM-gebundenen Wachstumsfaktoren, die alle an Regenerationsmechanismen wie Zellrekrutierung, -migration und -differenzierung sowie an der Zellausrichtung und -proliferation beteiligt sind¹⁴. Auch in der Physiopathologie der Organe haben die mechanischen Eigenschaften des Gewebes eine große Relevanz. In der Tat sind Veränderungen der mechanischen Eigenschaften oft mit dem Ausbruch und der Entwicklung mehrerer Krankheiten verbunden. Der Grund dafür liegt in der Tatsache, dass bei einer Modifikation der EZM Signale aus der Umwelt Veränderungen in der Gen- und Proteinexpression induzieren, was zu funktionellen Beeinträchtigungen führt^15,16.

Regenerative Therapien für die Organreparatur konzentrieren sich derzeit darauf, die ausgeklügelte Mikroumgebung des nativen Gewebes zu replizieren, um das Organ dort zu heilen, wo der Körper versagt. Trotz des rasanten Tempos vieler Tissue-Engineering-Ansätze können die Gewebe durch künstliche Verfahren immer noch nicht in ihrer Gesamtheit und Komplexität genau reproduziert werden. Bisher werden vor allem synthetische Materialien eingesetzt, da sie entsprechend abgestimmt werden können, um die mechanischen und biochemischen Eigenschaften der zellulären Mikroumgebung zu simulieren. Dennoch haben sie Grenzen, wie z. B. die Unfähigkeit, die zahlreichen Wechselwirkungen innerhalb des nativen Gewebes nachzuahmen, die Kosten für Technologien zu ihrer Herstellung und die Tatsache, dass sie weniger natürlich und biokompatibel sind als natives Gewebe 17,18,19. Darüber hinaus unterscheidet sich ihre Zusammensetzung, vor allem in Bezug auf Proteine und lösliche Faktoren, stark von der natürlichen, die extrem schwer zu replizieren ist²⁰.

Der neueste Ansatz in der regenerativen Medizin, um die Lücke zwischen den bedürftigen Patienten und den Organtransplantationen zu schließen, besteht darin, Gerüste aus dezellularisierter extrazellulärer Matrix (d-ECM) herzustellen und sie mit den entsprechenden Zelltypen zu bestücken, um die geschädigten Organe zu regenerieren. Dezellularisierung ist der Prozess, bei dem die EZM aus ihren nativen Zellen und ihrem genetischen Material isoliert wird, um ein natürliches und biomimetisches Gerüst zu erzeugen, das in der Lage ist, die Immunantwort und Abstoßung nach der Implantation bei den Patienten zu vermeiden 21,22,23. Die so gewonnene EZM kann dann wieder bestückt werden, um funktionelles Gewebe herzustellen. Das Hauptproblem bei der Entwicklung eines d-ECM ist die Methode. Bei jeder Dezellularisierungstechnik bleibt das Hauptziel die Erhaltung der nativen ECM-Zusammensetzung, Steifigkeit und 3D-Struktur, und alle Strategien haben sowohl Vor- als auch Nachteile. Da die Eliminierung von zellulärem Inhalt und DNA aus dem Gewebe den Einsatz chemischer oder physikalischer Mittel oder die Kombination von beiden erfordert, verursacht jedes Dezellularisierungsverfahren in unterschiedlichem Maße die Störung der EZM. Daher ist es entscheidend, die Beschädigung des ECM 24,25,26 so gering wie möglich zu halten.

Die Nutzung der nativen ECM als Plattform für die Rekonstitution von nativer ECM in vitro ist sehr wünschenswert. Zu diesem Zweck wurden mehrere Dezellularisierungsprotokolle auf ein breites Spektrum von Geweben angewendet 27,28,29,30. Tatsächlich wurden seit den frühen Stadien der Dezellularisierungsforschung und der EZM-Entwicklung mehrere Gewebe wie Arterien, Aortenklappen und periphere Nerven sowohl von Tieren als auch von Menschen dezellularisiert, und einige d-ECMs sind immer noch kommerziell erhältlich und werden für den Gewebeersatz oder die Wundheilung verwendet 31,32,33. In jüngster Zeit hat sich die menschliche Haut aufgrund ihrer Zusammensetzung und mechanischen Eigenschaften auch als geeigneter Kandidat für die Herstellung von dezellularisierten Gerüsten für die Herzreparatur herausgestellt, die in der Lage sind, das regenerative Potenzial von kardialen Vorläuferzellen (CPCs) zu steigern und sich an die kardiale Kontraktilität anzupassen³⁴. Diese Arbeit beschreibt ein einfaches und schnelles Protokoll zur Herstellung von dezellularisierten Gerüsten aus adulter menschlicher Haut, das die Entwicklung eines d-ECM mit gut erhaltener Architektur ermöglicht.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokoll

Die Proben aus menschlichem Gewebe wurden nach den Prinzipien der Deklaration von Helsinki und unter Beachtung der Richtlinien des Universitätskrankenhauses "Federico II" entnommen. Alle an dieser Studie beteiligten Patienten stellten schriftliche Einverständniserklärungen zur Verfügung.

1. Herstellung von Lösungen

1. Zubereitung von 1200 mL 1%iger Dezellularisierungslösung
   1. Bereiten Sie 600 ml 2%ige Triton X-100-Lösung vor, indem Sie 588 ml doppelt destilliertes Wasser in einem Messzylinder abmessen und in ein 1-Liter-Becherglas umfüllen. Geben Sie mit einer serologischen Pipette 12 ml Triton X-100 und einen Rührstab in das Becherglas. Stellen Sie das Becherglas auf einen Magnetrührer und mischen Sie die Lösung, bis sich der Triton X-100 vollständig aufgelöst hat.
   2. Stoppt die Aufregung. Entfernen Sie den Rührstab mit einem Rührstab-Retriever. Bei Raumtemperatur lagern.
   3. Bereiten Sie 600 mL 2%ige SDS-Lösung vor, indem 550 mL doppelt destilliertes Wasser in einem Messzylinder abgemessen und in ein 1-Liter-Becherglas umgefüllt werden.
   4. 12 g SDS-Pulver werden in einem Kunststoff-Wiegeschiffchen gewogen und in das Becherglas mit dem doppelt destillierten Wasser in Schritt 1.1.3 umgefüllt.
      HINWEIS: Schritt 1.1.4 muss unter einer Chemikalienhaube durchgeführt werden, und der Benutzer sollte persönliche Schutzausrüstung tragen.
   5. Fügen Sie einen Rührstab hinzu, stellen Sie das Becherglas auf einen Magnetrührer und mischen Sie die Lösung, bis sich das SDS vollständig aufgelöst hat.
   6. Stoppen Sie den Rührvorgang. Entfernen Sie den Rührstab mit einem Rührstab-Retriever.
   7. Übertragen Sie die Lösung in einen Messzylinder und stellen Sie das Volumen durch Zugabe von doppelt destilliertem Wasser auf 600 mL ein.
   8. Die in Schritt 1.1.1 hergestellte 2%ige Triton X-100-Lösung in einen 2-l-Zylinder geben.
   9. Gießen Sie 2%ige SDS-Lösung, die in den Schritten 1.1.3-1.1.7 hergestellt wurde, in denselben 2-l-Zylinder, um ein Gesamtvolumen von 1200 ml zu erhalten.
   10. Mit Parafilm bedecken und durch Inversion vorsichtig mischen, um eine homogene Lösung zu erhalten.
   11. Füllen Sie die gemischte Lösung mit einem Trichter in eine 2-Liter-Flasche um, um die Bildung von Schaum zu vermeiden. Lagern Sie die Lösung bei +4 °C.
2. Zubereitung von 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)
   1. Bereiten Sie 500 ml 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) vor, indem Sie 0,1 g monobasisches Kaliumphosphat, 0,1 g Kaliumchlorid, 4,0 g Natriumchlorid und 0,575 g zweibasisches Natriumphosphat in sterilem doppelt destilliertem Wasser auflösen. Prüfen Sie den pH-Wert (7,4).
   2. Bis zur Verwendung bei +4 °C lagern.
3. Herstellung der Antibiotikalösung
   1. Wiegen Sie 625 μg Amphotericin B in einem Plastik-Waagschiffchen.
   2. Pipettieren Sie 8 ml eines Penicillin-Streptomycin-Gemisches (Pen/Streptokokken) in ein 15-ml-Röhrchen.
   3. Geben Sie das gewogene Amphotericin B in das Pen/Streptokokken-Gemisch und stellen Sie das Volumen auf 10 ml ein, indem Sie Penicillin und Streptomycin (Pen/Streptokokken)-Gemisch hinzufügen. Verschließen Sie das Röhrchen und lösen Sie das Amphotericin B durch kräftiges Schütteln auf.

2. Tag 1 - Beginn des Dezellularisierungsverfahrens.

1. Gießen Sie 400 ml der Dezellularisierungslösung in ein 500-ml-Becherglas.
2. Fügen Sie 2,0 ml der Antibiotikalösung hinzu.

3. Vorbereitung der Hautproben

1. Waschen Sie die menschliche Hautprobe aus dem Bauch von Patienten, die sich einer Bauchdeckenstraffung unterziehen, in einer Plastikschale, indem Sie sie in einer isotonischen physiologischen Lösung mit 0,9 % NaCl einklemmen und auf den Kopf stellen, um überschüssiges Blut und andere biologische Flüssigkeiten zu entfernen.
2. Entfernen Sie Haare mit einer feinen Pinzette und Fett mit einer großen chirurgischen Schere.
3. Legen Sie die Hautprobe auf das Präparierbrett und präparieren Sie sie mit einem Skalpell, wobei die Graduierungen auf dem Präparierbrett als Referenz dienen, um 3 cm x 2,5 cm große Fragmente (Länge x Breite) zu erhalten, wobei Narben und verschmutzte oder verbrannte Bereiche des Gewebes vermieden werden.
4. Legen Sie jedes Fragment in eine Einbettkassette, schließen Sie sie und stellen Sie sicher, dass alle Kassetten ordnungsgemäß verriegelt sind, um ein Auslaufen der Probe während des Dezellularisierungsvorgangs zu vermeiden.
5. Maximal vier Einbettkassetten mit Proben werden in ein Becherglas mit der Dezellularisierungslösung gegeben. Fügen Sie einen Rührstab hinzu. Decken Sie es mit Aluminiumfolie ab und schreiben Sie auf die Oberseite alle Informationen zur Identifizierung der Probe und der Startzeit des Eingriffs.
6. Stellen Sie das Becherglas auf den Magnetrührer und starten Sie das Rühren mit einer Drehzahl von 150 U/min. Stoppt die Aufregung. Entfernen Sie die Aluminiumfolie, die das Becherglas bedeckt, und nehmen Sie die Einbettkassetten mit einer langen Pinzette heraus.
   HINWEIS: Überprüfen Sie nach dem Stoppen des Rührens die Klarheit der Lösung. Ändern Sie die Dauer der Bewegung (weniger oder mehr als 8 Stunden) basierend auf dem Grad der Trübung aufgrund der Freisetzung von Zelltrümmern.
7. Legen Sie jede Kassette in eine 100-mm-Schüssel. Ersetzen Sie die Dezellularisierungslösung, indem Sie die Schritte 3.5-3.6 über Nacht wiederholen.

4. Tag 2 - Überprüfen Sie den Zustand der Hautproben.

1. Stoppen Sie den Rührvorgang. Entfernen Sie die Aluminiumfolie, die das Becherglas bedeckt, und nehmen Sie die Einbettkassetten mit einer langen Pinzette heraus.
2. Legen Sie jede Kassette in eine 100-mm-Schüssel und öffnen Sie diese. Überprüfen Sie die Farbe der Probe.
   HINWEIS: Die Muster können einen Farbwechsel von nativem Beige zu Schneeweiß zeigen.
3. Entfernen Sie Resthaare und lösen Sie die Epidermis von der Dermis. Ersetzen Sie die Dezellularisierungslösung, indem Sie die Schritte 3.5-3.6 wiederholen.
4. Stoppen Sie das Rühren nach 8 h. Wiederholen Sie die Schritte 4.1 bis 4.2, bis das Muster schneeweiß erscheint. Beenden Sie den Dezellularisierungsvorgang.
   HINWEIS: Die Zeit, in der Sie der Einwirkung von Reinigungsmitteln ausgesetzt sind, kann bei Bedarf verlängert werden.
5. Messen Sie 400 mL 1x PBS in einem 500 mL Zylinder, gießen Sie es in ein 500 mL Becherglas und fügen Sie 2 mL der Pen Strep/Amphotericin B-Mischung hinzu. Fügen Sie einen Rührstab hinzu.
6. In jedes Becherglas werden maximal vier Kassetten mit den Proben mit der 1x PBS/Antibiotika-Lösung gegeben. Mit Alufolie abdecken und alle Informationen wie in Schritt 3.5 auf die Oberseite schreiben.
7. Stellen Sie das Becherglas auf ein Magnetrührwerk und starten Sie das Rühren mit einer Drehzahl von 150 U/min über Nacht bei Raumtemperatur.

5. Tag 3 - eine abschließende Wäsche der Proben

1. Stoppt die Aufregung. Ersetzen Sie die 1x PBS-Lösung durch 400 mL doppelt destilliertes Wasser. Fügen Sie einen Rührstab hinzu. Mit Alufolie abdecken und alle Informationen wie in Schritt 3.5 darauf schreiben.
2. Stellen Sie das Becherglas auf einen Magnetrührer und starten Sie das Rühren bei einer Drehzahl von 150 U/min für 30 min.
3. Stoppen Sie den Rührvorgang. Entfernen Sie die Aluminiumfolie, die das Becherglas bedeckt, und nehmen Sie die Einbettkassetten mit einer langen Pinzette heraus.
4. Jede Einbettkassette mit der dezellularisierten Hautprobe wird in eine 100-mm-Schale gelegt. Öffnen Sie die Kassetten und trocknen Sie die Hautproben vorsichtig ab, indem Sie sie auf Labortücher tupfen.
5. Legen Sie jede dezellularisierte Hautprobe in ein Waagscherchen, das zuvor mit den Informationen über die Probe versehen war. Decken Sie das Boot mit Alufolie ab und schreiben Sie alle Informationen auf die Oberseite, um die Probe zu identifizieren. Bei - 80 °C lagern.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ergebnisse

Ziel des Protokolls war es, eine Haut-d-ECM-Probe aus biologischem Gewebe zu gewinnen, wobei eine gut organisierte 3D-Struktur und ein gut erhaltener Gehalt an biologischen Molekülen erhalten blieben (Abbildung 1). Diese Methode basiert in erster Linie auf dem ständigen Rühren der Proben in einer Lösung, die die Kombination der beiden Detergenzien Triton X-100 und SDS enthält, wodurch die für das native Gewebe typischen biologischen und strukturellen M...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Diskussion

Obwohl das oben beschriebene Protokoll im Vergleich zu zuvor veröffentlichten Protokollen optimiert und verbessert wurde, stellt es einige kritische Schritte dar, die Aufmerksamkeit und Präzision erfordern. Die Bildung von Schaum muss bei der Herstellung der Entzellularisierungslösung vermieden werden, um eine falsche Verdünnung der Reinigungsmittel zu verhindern. Dies könnte behoben werden, indem die Lösungen vorsichtig gegossen und an der Innenseite des Zylinders entlang fließen...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% NaCl isotonic Physiological solution	Sigma-Aldrich	S8776	0.9% in water
1 L beaker	VWR	511-0318	Clean and autoclave before use
10 mL serological pipet	Falcon	357551	Sterile,  polystyrene
100 mm plates	Falcon	351029	Treated, sterile cell culture dish
15 mL sterile tubes	Falcon	352097	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
1 L graduated cylinder	VWR	612-1524	Clean and autoclave before use
2 L bottle	VWR	215-1596	Clean and autoclave before use
25 mL serological pipet	Falcon	357525	Sterile,  polystyrene
2 L graduated cylinder	VWR	612-3072	Clean and autoclave before use
500 mL beaker	VWR	511-0317	Clean and autoclave before use
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	Y0000005	Powder
Dissecting board	VWR	100498-398	Made of high-density polyethylene.
Dissecting scalpel	VWR	233-5526	Sterile and disposable
Embedding cassettes	Diapath	070191	External dimensions: 40x26x7 mm (WxDxH)
Fine forceps	VWR	232-1317	Clean and autoclave before use
Funnel	VWR	221-1861	Clean and autoclave before use
Hexagonal weighing boats size M	Sigma-Aldrich	Z708585	Hexagonal, polystyrene, 51 mm Bottom I.D., 64 mm Top I.D.
Hexagonal weighing boats size S	Sigma-Aldrich	Z708577	Hexagonal, polystyrene, 25 mm Bottom I.D., 38 mm Top I.D.
Large surgical scissors	VWR	233-1211	Clean and autoclave before use
Long forceps	VWR	232-0096	Clean and autoclave before use
Penicillin and Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333-100ml	Stabilized, with 10.000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, 0.1 μm filtered. Store at -20°C.  The solution  should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles Solution.
Pipette gun	Eppendorf	613-2795	Eppendorf Easypet® 3
Plastic tray	VWR	BELAH162620000	Corrosion-proof polypropylene plastic tray
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P9333	Powder
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma-Aldrich	P5665	Powder
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653	Powder
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	62862	Powder
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma-Aldrich	94046	Powder
Spatula	VWR	RSGA038.210	Clean and autoclave before use
Spoon	VWR	231-1314	Clean and autoclave before use
Stir bar	VWR	442-0362	Clean and autoclave before use
Stir bar retriever	VWR	89026-262	Molded in pure, FDA-approved PTFE
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1	Liquid