Décellularisation pour la préparation d’une matrice cutanée acellulaire humaine hautement préservée pour la médecine régénérative

Résumé

La peau humaine décellularisée convient à la régénération des tissus. Un problème majeur de la décellularisation est la préservation de l’architecture native, ainsi que le contenu approprié des protéines structurelles, des glycosaminoglycanes (GAG) et des facteurs de croissance. La méthode proposée permet une décellularisation rapide et efficace, produisant une peau décellularisée avec des caractéristiques natives bien préservées.

Résumé

La matrice extracellulaire (ECM) fournit des stimuli biophysiques et biochimiques pour soutenir l’auto-renouvellement, la prolifération, la survie et la différenciation des cellules environnantes en raison de sa teneur en diverses molécules bioactives. En raison de ces caractéristiques, l’ECM a récemment été considéré comme un candidat prometteur pour la création d’échafaudages biologiques visant à stimuler la régénération des tissus. Des études émergentes ont démontré que les tissus humains décellularisés pourraient ressembler à l’ECM native dans leurs profils structurels et biochimiques, préservant l’architecture tridimensionnelle (3D) et le contenu des molécules biologiques fondamentales. Par conséquent, la MEC décellularisée peut être utilisée pour favoriser le remodelage tissulaire, la réparation et la reconstruction fonctionnelle de nombreux organes. Le choix de la procédure de décellularisation appropriée est crucial pour obtenir des tissus acellulaires qui conservent les caractéristiques du microenvironnement idéal pour les cellules.

Le protocole décrit ici fournit une description détaillée, étape par étape, de la méthode de décellularisation pour obtenir une MEC biologique acellulaire reproductible et efficace. Des fragments de peau de patients subissant une chirurgie plastique ont été réduits et décellularisés à l’aide d’une combinaison de dodécylsulfate de sodium (SDS), de Triton X-100 et d’antibiotiques. Pour favoriser le transport régulier et homogène de la solution à travers les échantillons, ceux-ci ont été enfermés dans des cassettes d’enrobage afin d’assurer une protection contre les agressions mécaniques. Après la procédure de décellularisation, la couleur blanche comme neige des fragments de peau indiquait une décellularisation complète et réussie. De plus, les échantillons décellularisés ont montré une architecture intacte et bien conservée. Les résultats suggèrent que la méthode de décellularisation proposée était efficace, rapide et reproductible et protégeait les échantillons des dommages architecturaux.

Introduction

L’ECM sert d’échafaudage pour les cellules, les soutenant à travers une architecture complexe maintenue par différents composants, et c’est l’un des principaux facteurs responsables des propriétés mécaniques du cœur et de la fonction du tissu cardiaque ^1,2. De plus en plus de preuves suggèrent que l’ECM joue un rôle actif dans le remodelage des tissus, ce qui rend obsolète l’hypothèse conventionnelle selon laquelle l’ECM est un composant passif 3,4,5,6. Le rôle de l’ECM est de fournir des signaux biophysiques et biochimiques aux cellules résidentes. Il est bien établi que ces signaux peuvent influencer de nombreux comportements cellulaires fondamentaux, affectant leur fonction contractile, leur prolifération, leur migration et leur potentiel de différenciation ^7,8,9. Ainsi, l’ECM est de plus en plus utilisée dans l’ingénierie tissulaire et la médecine régénérative en tant qu’outil de soutien thérapeutique 9,10,11,12,13.

L’ECM se compose de plusieurs protéines telles que le collagène, l’élastine, la fibronectine, le protéoglycane et la laminine, ainsi que de facteurs de croissance liés à l’ECM, tous impliqués dans les mécanismes de régénération, tels que le recrutement, la migration et la différenciation cellulaires, ainsi que l’alignement et la prolifération cellulaires¹⁴. Les propriétés mécaniques des tissus ont également une grande importance dans la physiopathologie des organes. En effet, les modifications des propriétés mécaniques sont souvent associées à l’apparition et à l’évolution de plusieurs maladies. La raison réside dans le fait que lorsque l’ECM est modifiée, les signaux provenant de l’environnement induisent des changements dans l’expression des gènes et des protéines, conduisant à une déficience fonctionnelle^15,16.

Les thérapies régénératives pour la réparation des organes se concentrent actuellement sur la reproduction du microenvironnement sophistiqué du tissu natif pour guérir l’organe où le corps échoue. Malgré le rythme rapide de nombreuses approches d’ingénierie tissulaire, les tissus ne peuvent toujours pas être reproduits avec précision dans leur intégralité et leur complexité par des procédures artificielles. Les matériaux synthétiques ont été largement utilisés jusqu’à présent, car ils peuvent être ajustés de manière appropriée pour simuler les propriétés mécaniques et biochimiques du microenvironnement cellulaire. Néanmoins, ils ont des limites, telles que l’incapacité d’imiter les nombreuses interactions au sein du tissu natif, le coût des technologies pour les produire et le fait qu’ils sont moins naturels et biocompatibles que les tissus natifs 17,18,19. De plus, leur composition, principalement en termes de protéines et de facteurs solubles, diffère considérablement de la composition naturelle, qui est extrêmement difficile à reproduire²⁰.

L’approche de pointe en médecine régénérative pour réduire l’écart entre les patients dans le besoin et les greffes d’organes consiste à produire des échafaudages faits de matrice extracellulaire décellularisée (d-ECM) et à les repeupler avec les types de cellules appropriés pour régénérer les organes endommagés. La décellularisation est le processus dans lequel l’ECM est isolé de ses cellules natives et de son matériel génétique pour produire un échafaudage naturel et biomimétique, capable d’éviter la réponse immunitaire et le rejet une fois implanté chez les patients 21,22,23. L’ECM ainsi obtenue peut ensuite être repeuplée pour produire du tissu fonctionnel. L’enjeu majeur lors du développement d’un d-ECM est la méthode. Pour toute technique de décellularisation, l’objectif principal reste la préservation de la composition ECM native, de la rigidité et de la structure 3D, et toutes les stratégies présentent à la fois des avantages et des inconvénients. Étant donné que l’élimination du contenu cellulaire et de l’ADN du tissu nécessite l’utilisation d’agents chimiques ou physiques, ou la combinaison des deux, chaque procédure de décellularisation provoque, à des degrés divers, la perturbation de l’ECM. Par conséquent, il est crucial de minimiser les dommages à l’ECM 24,25,26.

L’utilisation de l’ECM native comme plate-forme pour la reconstitution de l’ECM native in vitro est hautement souhaitable. À cette fin, plusieurs protocoles de décellularisation ont été appliqués à un large éventail de tissus 27,28,29,30. En fait, depuis les premières étapes de la recherche sur la décellularisation et du développement de la MEC, plusieurs tissus, tels que les artères, les valves aortiques et les nerfs périphériques des animaux et des humains, ont été décellularisés, et certains d-ECM sont encore disponibles dans le commerce et utilisés pour le remplacement des tissus ou la cicatrisation des plaies31,32,33. Récemment, la peau humaine est également apparue comme un candidat approprié pour produire des échafaudages décellularisés pour la réparation cardiaque en raison de sa composition et de ses propriétés mécaniques, capables de stimuler le potentiel de régénération des cellules progénitrices cardiaques (CPC) et de s’adapter à la contractilité cardiaque³⁴. Cet article décrit un protocole simple et rapide pour produire des échafaudages décellularisés à partir de peau humaine adulte, permettant le développement d’un d-ECM avec une architecture bien préservée.

Protocole

Les échantillons de tissus humains ont été collectés conformément aux principes de la Déclaration d’Helsinki et en respectant les directives de l’hôpital universitaire « Federico II ». Tous les patients participant à cette étude ont fourni des formulaires de consentement écrits.

1. Préparation des solutions

1. Préparation de 1200 mL de solution décellularisante à 1 %
   1. Préparez 600 mL de solution Triton X-100 à 2 % en mesurant 588 mL d’eau doublement distillée dans un cylindre gradué et en le transférant dans un bécher de 1 L. À l’aide d’une pipette sérologique, ajouter 12 mL de Triton X-100 et une barre d’agitation dans le bécher. Placez le bécher sur un agitateur magnétique et mélangez la solution jusqu’à ce que le Triton X-100 soit complètement dissous.
   2. Arrêtez l’agitation. Retirez la barre d’agitation à l’aide d’un récupérateur de barre d’agitation. Conserver à température ambiante.
   3. Préparez 600 mL de solution SDS à 2 % en mesurant 550 mL d’eau doublement distillée dans un cylindre gradué et en le transférant dans un bécher de 1 L.
   4. Pesez 12 g de poudre SDS dans un bateau de pesée en plastique et transférez-le dans le bécher contenant l’eau distillée deux fois à l’étape 1.1.3.
      REMARQUE : L’étape 1.1.4 doit être effectuée sous une cagoule chimique, et l’utilisateur doit porter un équipement de protection individuelle.
   5. Ajoutez un agitateur, placez le bécher sur un agitateur magnétique et mélangez la solution jusqu’à ce que la FDS soit complètement dissoute.
   6. Arrêtez le processus d’agitation. Retirez la barre d’agitation à l’aide d’un récupérateur de barre d’agitation.
   7. Transférez la solution dans un cylindre gradué et ajustez le volume à 600 ml en ajoutant de l’eau distillée deux fois.
   8. Verser la solution Triton X-100 à 2 % préparée à l’étape 1.1.1 dans une bouteille de 2 L.
   9. Verser la solution de SDS à 2 % préparée aux étapes 1.1.3 à 1.1.7 dans la même bouteille de 2 L pour obtenir un volume total de 1200 mL.
   10. Couvrir de parafilm et mélanger délicatement par inversion pour obtenir une solution homogène.
   11. Transférez la solution mélangée dans une bouteille de 2 L à l’aide d’un entonnoir pour éviter la formation de mousse. Conserver la solution à +4 °C.
2. Préparation de 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS)
   1. Préparez 500 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) en dissolvant 0,1 g de phosphate de potassium monobasique, 0,1 g de chlorure de potassium, 4,0 g de chlorure de sodium et 0,575 g de phosphate de sodium dibasique dans de l’eau stérile bidistillée. Vérifiez la valeur du pH (7,4).
   2. Conserver à +4 °C jusqu’à utilisation.
3. Préparation de la solution antibiotique
   1. Peser 625 μg d’amphotéricine B dans un bateau de pesée en plastique.
   2. Pipeter 8 mL d’un mélange de pénicilline et de streptomycine (stylo/streptocoque) dans un tube de 15 mL.
   3. Ajouter l’amphotéricine B pesée au mélange stylo/streptocoque et ajuster le volume à 10 ml en ajoutant le mélange de pénicilline et de streptomycine (stylo/streptocoque). Boucher le tube et dissoudre l’amphotéricine B en secouant vigoureusement.

2. Jour 1 - démarrez la procédure de décellularisation.

1. Versez 400 ml de la solution décellularisante dans un bécher de 500 ml.
2. Ajouter 2,0 ml de la solution antibiotique.

3. Préparation des échantillons de peau

1. Lavez l’échantillon de peau humaine de l’abdomen des patients subissant une abdominoplastie dans un plateau en plastique en le mettant à l’envers et en le retournant dans une solution physiologique isotonique de NaCl à 0,9 % pour éliminer l’excès de sang et d’autres fluides biologiques.
2. Épilez les cheveux à l’aide d’une pince fine et de graisse à l’aide de gros ciseaux chirurgicaux.
3. Placez l’échantillon de peau sur la planche de dissection et disséquez-le à l’aide d’un scalpel, avec les graduations sur la planche de dissection comme référence pour obtenir des fragments de 3 cm x 2,5 cm (longueur par largeur), en évitant les cicatrices et les zones sales ou brûlées du tissu.
4. Placez chaque fragment dans une cassette d’enrobage, fermez-la et assurez-vous que toutes les cassettes sont correctement verrouillées pour éviter les fuites de l’échantillon pendant la procédure de décellularisation.
5. Placez un maximum de quatre cassettes d’enrobage avec des échantillons dans un bécher avec la solution de décellularisation. Ajoutez une barre d’agitation. Couvrir d’une feuille d’aluminium, en inscrivant sur le dessus toutes les informations permettant d’identifier l’échantillon et l’heure de début de la procédure.
6. Placez le bécher sur l’agitateur magnétique et démarrez l’agitation à une vitesse de rotation de 150 tr/min. Arrêtez l’agitation. Retirez la feuille d’aluminium recouvrant le bécher et retirez les cassettes d’enrobage à l’aide d’une longue pince.
   REMARQUE : Après avoir arrêté l’agitation, vérifiez la clarté de la solution. Modifier la durée de l’agitation (moins ou plus de 8 heures) en fonction du degré de l’opacification due à la libération de débris cellulaires.
7. Placez chaque cassette dans une parabole de 100 mm. Remplacez la solution décellularisante en répétant les étapes 3.5-3.6 pendant la nuit.

4. Jour 2 - vérifiez l’état des échantillons de peau.

1. Arrêtez le processus d’agitation. Retirez la feuille d’aluminium recouvrant le bécher et retirez les cassettes d’enrobage à l’aide d’une longue pince.
2. Placez chaque cassette dans une parabole de 100 mm et ouvrez-la. Vérifiez la couleur de l’échantillon.
   REMARQUE : Les échantillons peuvent montrer un changement de couleur du beige indigène au blanc comme neige.
3. Supprimez les poils résiduels et détachez l’épiderme du derme. Remplacez la solution décellularisante en répétant les étapes 3.5-3.6.
4. Arrêtez l’agitation après 8 h. Répétez les étapes 4.1 et 4.2 jusqu’à ce que l’échantillon apparaisse blanc comme neige. Arrêtez la procédure de décellularisation.
   REMARQUE : Le temps d’exposition à l’action des détergents peut être prolongé si nécessaire.
5. Mesurez 400 ml de 1x PBS dans un cylindre de 500 ml, versez-le dans un bécher de 500 ml et ajoutez 2 ml du mélange streptocoque/amphotéricine B. Ajoutez une barre d’agitation.
6. Placez un maximum de quatre cassettes contenant les échantillons dans chaque bécher avec la solution 1x PBS/antibiotiques. Couvrir d’une feuille d’aluminium et écrire toutes les informations sur le dessus comme à l’étape 3.5.
7. Placez le bécher sur un agitateur magnétique et démarrez l’agitation à une vitesse de rotation de 150 tr/min pendant la nuit, à température ambiante.

5. Jour 3 - un lavage final des échantillons

1. Arrêtez l’agitation. Remplacez la solution 1x PBS par 400 mL d’eau doublement distillée. Ajoutez une barre d’agitation. Couvrir de papier d’aluminium et écrire toutes les informations sur le dessus comme à l’étape 3.5.
2. Placez le bécher sur un agitateur magnétique et démarrez l’agitation à une vitesse de rotation de 150 tr/min pendant 30 min.
3. Arrêtez le processus d’agitation. Retirez la feuille d’aluminium recouvrant le bécher et retirez les cassettes d’enrobage à l’aide d’une longue pince.
4. Placez chaque cassette d’enrobage contenant l’échantillon de peau décellularisée dans une boîte de 100 mm. Ouvrez les cassettes et séchez délicatement les échantillons de peau en les tamponnant sur des lingettes de laboratoire.
5. Placez chaque échantillon de peau décellularisée dans un bateau de pesée préalablement étiqueté avec les informations sur l’échantillon. Couvrez le bateau de papier d’aluminium et écrivez toutes les informations sur le dessus pour identifier l’échantillon. Conserver à - 80 °C.

Résultats

L’objectif du protocole était d’obtenir un échantillon de d-ECM cutané à partir de tissus biologiques, en maintenant une structure 3D bien organisée et un contenu bien préservé des molécules biologiques (Figure 1). Cette méthode est principalement basée sur l’agitation constante des échantillons dans une solution contenant la combinaison de deux détergents, Triton X-100 et SDS, préservant ainsi les caractéristiques biologiques et structur...

Discussion

Bien que le protocole décrit ci-dessus ait été optimisé et amélioré par rapport aux protocoles précédemment publiés, il présente quelques étapes critiques qui nécessitent attention et précision. La formation de mousse doit être évitée lors de la préparation de la solution de décellularisation pour éviter une dilution incorrecte des détergents. Cela pourrait être résolu en versant doucement les solutions et en les faisant couler le long de la face intérieure du cyli...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% NaCl isotonic Physiological solution	Sigma-Aldrich	S8776	0.9% in water
1 L beaker	VWR	511-0318	Clean and autoclave before use
10 mL serological pipet	Falcon	357551	Sterile,  polystyrene
100 mm plates	Falcon	351029	Treated, sterile cell culture dish
15 mL sterile tubes	Falcon	352097	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
1 L graduated cylinder	VWR	612-1524	Clean and autoclave before use
2 L bottle	VWR	215-1596	Clean and autoclave before use
25 mL serological pipet	Falcon	357525	Sterile,  polystyrene
2 L graduated cylinder	VWR	612-3072	Clean and autoclave before use
500 mL beaker	VWR	511-0317	Clean and autoclave before use
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	Y0000005	Powder
Dissecting board	VWR	100498-398	Made of high-density polyethylene.
Dissecting scalpel	VWR	233-5526	Sterile and disposable
Embedding cassettes	Diapath	070191	External dimensions: 40x26x7 mm (WxDxH)
Fine forceps	VWR	232-1317	Clean and autoclave before use
Funnel	VWR	221-1861	Clean and autoclave before use
Hexagonal weighing boats size M	Sigma-Aldrich	Z708585	Hexagonal, polystyrene, 51 mm Bottom I.D., 64 mm Top I.D.
Hexagonal weighing boats size S	Sigma-Aldrich	Z708577	Hexagonal, polystyrene, 25 mm Bottom I.D., 38 mm Top I.D.
Large surgical scissors	VWR	233-1211	Clean and autoclave before use
Long forceps	VWR	232-0096	Clean and autoclave before use
Penicillin and Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333-100ml	Stabilized, with 10.000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, 0.1 μm filtered. Store at -20°C.  The solution  should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles Solution.
Pipette gun	Eppendorf	613-2795	Eppendorf Easypet® 3
Plastic tray	VWR	BELAH162620000	Corrosion-proof polypropylene plastic tray
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P9333	Powder
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma-Aldrich	P5665	Powder
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653	Powder
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	62862	Powder
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma-Aldrich	94046	Powder
Spatula	VWR	RSGA038.210	Clean and autoclave before use
Spoon	VWR	231-1314	Clean and autoclave before use
Stir bar	VWR	442-0362	Clean and autoclave before use
Stir bar retriever	VWR	89026-262	Molded in pure, FDA-approved PTFE
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1	Liquid