Visualización dinámica de microtúbulos plus-end en el modelo de la enfermedad de Huntington basado en fibroblastos primarios de piel humana

Resumen

Este protocolo está dedicado a la visualización de microtúbulos plus-end mediante transfección de proteínas EB3 para estudiar sus propiedades dinámicas en cultivo celular primario. El protocolo se implementó en fibroblastos primarios de piel humana obtenidos de pacientes con enfermedad de Huntington.

Resumen

La transfección con una proteína marcadora de interés marcada fluorescentemente en combinación con videomicscopía de lapso de tiempo es un método clásico para estudiar las propiedades dinámicas del citoesqueleto. Este protocolo ofrece una técnica para la transfección de fibroblastos primarios humanos, que puede ser difícil debido a los detalles de las condiciones de cultivo de células primarias. Además, el mantenimiento de la propiedad dinámica del citoesqueleto requiere un bajo nivel de transfección para obtener una buena relación señal-ruido sin causar estabilización de microtúbulos. Es importante tomar medidas para proteger las células del estrés inducido por la luz y el desvanecimiento del tinte fluorescente. En el curso de nuestro trabajo, probamos diferentes métodos y protocolos de transfección, así como diferentes vectores para seleccionar la mejor combinación de condiciones adecuadas para estudios de fibroblastos primarios humanos. Analizamos los videos de lapso de tiempo resultantes y calculamos la dinámica de los microtúbulos utilizando ImageJ. La dinámica de los extremos positivos de los microtúbulos en las diferentes partes celulares no es similar, por lo que dividimos el análisis en subgrupos: la región del centrosoma, la lámina y la cola de los fibroblastos. En particular, este protocolo se puede utilizar para el análisis in vitro de la dinámica del citoesqueleto en muestras de pacientes, lo que permite el siguiente paso hacia la comprensión de la dinámica de los diversos desarrollos de la enfermedad.

Introducción

La enfermedad de Huntington (EH) es una patología neurodegenerativa incurable causada por un gen mutacionina que codifica la proteína cazadora (HTT). La HTT se asocia principalmente con vesículas y microtúbulos y probablemente esté involucrada en procesos de transporte dependientes de microtúbulos^1,2. Para estudiar la influencia de la HTT mutante en la dinámica de los microtúbulos, utilizamos la visualización in vitro de la proteína EB3, que regula las propiedades dinámicas de los microtúbulos uniéndose y estabilizando los extremos superiores en crecimiento. Para cargar EB3 marcado fluorescentemente en fibroblastos de piel humana, se aplicó transfección por plásmido. Para este estudio se utilizó el cultivo primario de fibroblastos obtenido de la biopsia de piel de los pacientes con EH.

La mutación en el gen de la proteína HTT conduce a la elongación del tracto de la poliglutamina³. HTT tiene un papel en procesos celulares tales como endocitosis^4,transporte celular^1,2,degradación de^{proteínas 5,}etc. Una parte sustancial de estos procesos involucra varios elementos del citoesqueleto celular, incluidos los microtúbulos.

Las células primarias humanas son el mejor modelo para reproducir los eventos que ocurren en las células de los pacientes lo más cerca posible. Para crear tales modelos, uno necesita aislar células de material de biopsia humana (por ejemplo, de muestras quirúrgicas). La línea celular primaria resultante es adecuada para estudiar la patogénesis utilizando varios métodos genéticos, bioquímicos, moleculares y de biología celular. Además, los cultivos celulares primarios humanos sirven como precursores para la creación de diversos cultivos transdiferenciados y transgénicos⁶.

Sin embargo, a diferencia de los cultivos celulares inmortalizados, la desventaja significativa de las células primarias es su limitada capacidad de paso. Por lo tanto, recomendamos el uso de células en la etapa de pasajes tempranos (hasta 15). Las culturas más antiguas degeneran muy rápidamente, perdiendo sus propiedades únicas. Por lo tanto, las células primarias recién obtenidas deben mantenerse congeladas para su almacenamiento a largo plazo.

Los cultivos celulares primarios son susceptibles a las condiciones de cultivo. Por lo tanto, a menudo requieren enfoques únicos y optimización de las condiciones de crecimiento. En particular, los fibroblastos primarios de la piel humana utilizados en nuestros experimentos son exigentes con el sustrato. Por lo tanto, utilizamos varios recubrimientos adicionales (por ejemplo, gelatina o fibronectina) dependiendo del tipo de experimento.

El citoesqueleto celular determina la forma celular, la movilidad y la locomoción. La dinámica del citoesqueleto es crucial para muchos procesos intracelulares tanto en interfase como en mitosis. En particular, el citoesqueleto polimerizado a partir de tubulina, son estructuras altamente dinámicas y polares, lo que permite el transporte intracelular dirigido mediado por proteínas motoras. Los extremos de los microtúbulos están en constante reordenamiento, sus fases de ensamblaje se alternan con las fases de desmontaje, y este comportamiento se denomina "inestabilidad dinámica"^7,8,9. Varias proteínas asociadas cambian el equilibrio de la reacción de polimerización, lo que lleva a la formación de polímeros o a la formación de monómeros de proteínas. La adición de subunidades de tubulina ocurre principalmente en el extremo superior de los microtúbulos¹⁰. La familia de proteínas de unión al final (EB) consta de tres miembros: EB1, EB2 y EB3. Sirven como proteínas de seguimiento de extremos más (+TIP) y regulan las propiedades dinámicas de los microtúbulos uniéndose y estabilizando sus extremos superiores en crecimiento¹¹.

Muchos estudios utilizan microinyección o transfección de tubulina marcada con moléculas fluorescentes con imágenes de lapso de tiempo y análisis de video para visualizar microtúbulos in vitro. Estos métodos pueden ser invasivos y dañinos para las células, especialmente las células humanas primarias. El paso más desafiante es encontrar las condiciones para la transfección celular. Intentamos alcanzar el nivel más alto posible de transfección sin afectar la viabilidad y la morfología celular nativa. Este estudio aplica el método clásico para estudiar las diferencias en la dinámica de los microtúbulos en fibroblastos de la piel de donantes sanos y pacientes con enfermedad de Huntington.

Protocolo

Este protocolo sigue las directrices del Centro Federal de Investigación y Clínica de Medicina Físico-Química de la Agencia Federal Médica Biológica de fecha 08 de septiembre de 2015.

NOTA: La Figura 1 ofrece una visión general del protocolo.

1. Obtención de un cultivo primario de fibroblastos de piel humana (Figura2)

1. Entregue la biopsia a un laboratorio en unas pocas horas en el medio Modified Eagle Media (DMEM) de Dulbecco suplementado con 50 μg/ml de penicilina y 50 U/ml de estreptomicina.
   NOTA: Una biopsia de piel debe ser realizada en condiciones estériles por un médico después de que un paciente firme un consentimiento informado.
2. Coloque el tejido de la biopsia en una placa de Petri de 6 cm junto con una pequeña cantidad del medio.
3. Usando un bisturí estéril, corte la muestra de biopsia en trozos de aproximadamente 0.5-1 mm de tamaño. Coloque 1-2 fragmentos obtenidos en una placa de Petri de 3,5 cm y coloque un cubrehojas estériles sobre las piezas de biopsia. Agregue lentamente 1.5 ml de un medio de crecimiento a la siguiente composición: DMEM, 50 U / ml de penicilina-estreptomicina y 10% de suero bovino fetal (FBS).
4. Cultivo de fibroblastos en el medio de crecimiento dentro de una incubadora de CO₂ mantenido al 5% de CO_2,37 °C, 80% de humedad.
   NOTA: Después de 4-7 días, primero los queratinocitos, luego los fibroblastos, comienzan a migrar del tejido al fondo del plato.

2. Almacenamiento, congelación y descongelación del cultivo primario

1. Retirar las células de la placa de cultivo (véanse los puntos 3.2 a 3.4).
2. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml y centrífuga durante 5 min a 200 x g. Luego deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 900 μL de FBS enfriado.
3. Transfiera a un tubo de criopreservación gota a gota y agregue 100 μL de dimetilsulfóxido (DMSO).
4. Coloque la criosonda en un congelador de baja temperatura a -80 °C. Veinticuatro horas después, transfiera el criovial a nitrógeno líquido (-196 ° C) para su almacenamiento a largo plazo.
5. Para descongelar las células criopreservadas, retire el criovial del almacenamiento de nitrógeno y, en 1 min, transfiera 1 mL del contenido a un tubo cónico de 15 mL que contenga 9 mL del medio de transporte precalentado a 37 °C.
6. Resuspender cuidadosamente y luego centrifugar el tubo durante 5 min a 200 x g. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet celular en el volumen requerido del medio de crecimiento y colóquelos en una placa de Petri del diámetro requerido.

3. Cultivo celular

1. Cubra el fondo del plato con una solución de gelatina al 0,1% en autoclave preparada en agua destilada. Incubar durante 15 min.
   NOTA: Para la visualización de la transfección, se deben utilizar platos con fondo de vidrio (platos confocales con espesor de vidrio de 170 μm).
2. Preparar un medio de cultivo que tenga la siguiente composición: DMEM suplementado con 10% fbs, 2 mM L-alanil-L-glutamina, 50 U/mL de penicilina-estreptomicina. Mezclar bien y conservar a 4 °C. Calentar el medio a 37 °C antes de añadirlo a las células.
3. Evaluar el cultivo bajo el microscopio. Retire el medio y lave los fibroblastos con la solución de sal de fosfato (DPBS) de Dulbecco.
4. Agregue 1 ml de solución de tripsina al 0,25% precalentada a las células. Revise las células bajo el microscopio si se desprenden completamente del sustrato. Desactivar la tripsina con 1 ml del medio de cultivo.
5. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar el tubo a 200 x g durante 5 min, retirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet celular en 1 ml del medio de cultivo.
6. Cuente el número de celdas. Calcular el número requerido de células para sembrarlas con una densidad de 8-15 x 10³/cm² y resuspend en 2 mL del medio de cultivo.
7. Retire la solución de gelatina de la placa de cultivo e inmediatamente agregue 2 ml de suspensión celular. Cultivar fibroblastos a 37 °C en una incubadora de CO_2.
8. Refresque el medio cada 2-4 días.
   NOTA: Para experimentos, use las celdas de 4-11 pasajes.

4. Transfección

1. Reemplace el medio de cultivo por un medio de cultivo fresco 24 h antes de la transfección.
   NOTA: La confluencia celular debe ser del 70-80%.
2. Prepare un complejo ADN-lípido basado en el área y la densidad de la siembra celular. Use un agente de transfección basado en liposomas.
   NOTA: Utilice la densidad de siembra celular como 1 x 10⁴ celdas/cm².
3. Añadir 3 μL de reactivo de transfección comercial a 125 μL de medio esencial mínimo óptimo (Opti-MEM) que no contenga antibióticos, sin tocar las paredes del tubo. Resuspendir suavemente.
4. Diluir el ADN plásmido (GFP-EB3) añadiendo 1 μg del ADN plásmido a 125 μL de Opti-MEM. Resuspendir suavemente.
   NOTA: La codificación del vector de expresión GFP-EB3¹¹ fue recibida como un amable regalo del Dr. I. Kaverina (Universidad de Vanderbilt, Nashville) con permiso del Dr. A. Akhmanova (Universidad Erasmus, Rotterdam)¹¹.
5. Agregue ADN plásmido diluido a cada tubo de reactivo de transfección diluido (1:1). Incubar durante 30 min.
6. Agregue el complejo ADN-lípido a las células que contienen la placa de Petri de 6 cm y mezcle con un giro cruciforme durante 30 s. Incubar las células con un agente de transfección durante 24 h y luego cambiar a medio fresco. Analizar la eficiencia de la transfección después de 24 h y 48 h.
   NOTA: 24 h después de la transfección, la eficiencia fue del 10-15%, y después de 48 h hasta el 40%.

5. Preparación para la obtención de imágenes

1. Antes de obtener imágenes en vivo de las células, cambie el medio de cultivo a un medio sin colorante indicador de pH para reducir la autofluorescencia.
2. Aplique cuidadosamente aceite mineral a la superficie del medio para cubrir completamente el medio, aislándolo del entorno externo para reducir la penetración de O₂ y la evaporación del medio.
3. Utilice una lámpara de mercurio y una lente de objetivo de inmersión en aceite de 60x o 100x con una apertura numérica alta para tomar las imágenes.
   NOTA: Para observaciones in vivo, el microscopio debe estar equipado con una incubadora para mantener las condiciones necesarias para las células, incluido el calentamiento de la mesa de objetos y la lente a +37 ° C, una cámara cerrada con suministro de CO₂ y soporte de nivel de humedad. Use agua destilada doble para crear humedad. Compruebe el nivel de agua destilada doble antes de filmar.
4. Coloque el plato confocal con las células en el soporte del microscopio antes de obtener imágenes. Asegúrese de que el plato y la cámara estén bien conectados al soporte para evitar la deriva mientras se toman imágenes.

6. Configuración de los parámetros de imagen

1. Elija los valores de exposición bajos, ya que la luz induce especies reactivas de oxígeno (ROS) que dañan las células.
   NOTA: Para estudiar la dinámica de los microtúbulos en fibroblastos de piel humana, se seleccionó una exposición de 300 ms.
2. Centrarse en el objeto de interés.
   NOTA: Para obtener imágenes de lapso de tiempo a largo plazo, utilice el sistema de estabilización automática del enfoque para compensar un posible cambio a lo largo del eje Z.
3. Elija las condiciones óptimas de imagen dependiendo de la fotosensibilidad de las células y la velocidad de desvanecimiento del fluorocromo.
   NOTA: Dado que los microtúbulos son estructuras altamente dinámicas, se puede seleccionar un intervalo de tiempo razonablemente corto y la velocidad de fotogramas debe ser lo suficientemente alta. Para investigar la dinámica de los microtúbulos en fibroblastos de la piel, se utilizó a una frecuencia de 1 fotograma/s durante 3-5 min.
4. Al seleccionar el siguiente objeto para obtener la imagen, aléjese del área ya fotografiada. Dado que esta área estaba bajo la influencia de la luz, habrá un fotoblanqueo notable.
   NOTA: Dado que se utilizó una frecuencia de imagen relativamente alta, el obturador no se cerró entre las imágenes y la lámpara se encendió durante todo el período de imágenes, por lo que aumentó el desvanecimiento.
5. Elija el video óptimo para estudiar visualmente la dinámica de los microtúbulos, teniendo en cuenta la calidad de la transfección, la calidad de las imágenes de los microtúbulos (relación óptima señal-ruido) y la ausencia de deriva en el caso de la célula analizada(Figura 3).
6. Utilice los videos seleccionados para estudiar la dinámica de los extremos superiores de los microtúbulos rastreándolos en el programa ImageJ o Fiji(Figura 4).
   NOTA: Para las instrucciones de análisis cuantitativo, consulte la Figura suplementaria 2 y el Archivo complementario 1.

Resultados

Las películas GFP-EB3 resultantes producidas utilizando el protocolo (Figura 1) ilustran las propiedades dinámicas de los microtúbulos. Los microtúbulos están involucrados en diferentes procesos celulares, y sus propiedades dinámicas afectan varias características de vida del cultivo celular humano primario a partir del material de biopsia de los pacientes (Figura 2).

Los siguientes parámetros determinan la inestabilidad diná...

Discusión

Se pueden obtener resultados de mejor calidad para el análisis dinámico de microtúbulos a partir de imágenes microscópicas de alta calidad. Es importante observar todas las condiciones necesarias para la obtención de imágenes de lapso de tiempo de las células vivas y ajustar correctamente los parámetros de la imagen. El uso de platos especiales de cultivo celular con un fondo de vidrio (platos confocales) es importante, ya que el vidrio tiene un índice de refracción de la luz diferente al plástico. El grosor ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instrumentation
Camera iXon DU897 EMCCD	Andor Technology
Eppendorf Centrifuge 5804 R	Eppendorf Corporate
Fluorescence filter set HYQ FITC	Nikon		Alternative: Leica, Olympus, Zeiss
LUNA-II Automated Cell Counte	Logos Biosystems	L40002
Microscope incubator for lifetime filming	Okolab	Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS
		Gas controller CO2-O2-UNIT-BL
Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13)	Nikon		Alternative: Leica, Olympus, Zeiss
Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E	Nikon		Alternative: Leica, Olympus, Zeiss
Software
Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c)	Open source image processing software
NIS Elements	Nikon		Alternative: Leica, Olympus, Zeiss
Additional reagents
Mineral oil (Light white oil)	MP	151694
Cell culture dish
Cell Culture Dish	SPL Lifesciences	20035
Confocal Dish (glass thickness 170 µm)	SPL Lifesciences	211350	Alternative: MatTek
Conical Centrifuge tube	SPL Lifesciences	50015
Cryogenic Vials	Corning-Costar	430659
Microcentrifuge Tube	Nest	615001
Cultivation
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	L3000001
Dimethyl sulfoxide	PanEko	135
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media)	PanEko	C420
DPBS (Dulbecco's phosphate-salt solution)	PanEko	P060
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	K053/SH30071.03
Gelatin (bovine skin)	PanEko	070
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050038
Opti-MEM (1x) + Glutamax	Gibco	519850026
Penicillin-streptomycin	PanEko	A063
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo Fisher Scientific	25200072
Transfection
Plasmid DNA with EB3-GFP	Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova [Erasmus University, Rotterdam]	Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003