Visualizzazione dinamica plus-end dei microtubuli nel modello della malattia di Huntington basato sui fibroblasti cutanei primari umani

Riepilogo

Questo protocollo è dedicato alla visualizzazione plus-end dei microtubuli mediante trasfezione della proteina EB3 per studiarne le proprietà dinamiche in coltura cellulare primaria. Il protocollo è stato implementato su fibroblasti cutanei primari umani ottenuti da pazienti affetti da Malattia di Huntington.

Abstract

La trasfezione con una proteina marcatore di interesse marcata fluorescente in combinazione con la videomicroscopia time-lapse è un metodo classico di studio delle proprietà dinamiche del citoscheletro. Questo protocollo offre una tecnica per la trasfezione dei fibroblasti primari umani, che può essere difficile a causa delle specifiche delle condizioni di coltivazione delle cellule primarie. Inoltre, il mantenimento della proprietà dinamica del citoscheletro richiede un basso livello di trasfezione per ottenere un buon rapporto segnale-rumore senza causare la stabilizzazione dei microtubuli. È importante adottare misure per proteggere le cellule dallo stress indotto dalla luce e dallo sbiadimento del colorante fluorescente. Nel corso del nostro lavoro, abbiamo testato diversi metodi e protocolli di trasfezione, nonché diversi vettori per selezionare la migliore combinazione di condizioni adatte per gli studi sui fibroblasti primari umani. Abbiamo analizzato i video time-lapse risultanti e calcolato le dinamiche dei microtubuli utilizzando ImageJ. La dinamica delle estremità positive dei microtubuli nelle diverse parti cellulari non è simile, quindi abbiamo diviso l'analisi in sottogruppi: la regione centrosoma, la lamella e la coda dei fibroblasti. In particolare, questo protocollo può essere utilizzato per l'analisi in vitro della dinamica del citoscheletro in campioni di pazienti, consentendo il passo successivo verso la comprensione delle dinamiche del vario sviluppo della malattia.

Introduzione

La malattia di Huntington (HD) è una patologia neurodegenerativa incurabile causata da una mutazionina del gene che codifica per la proteina cacciatina (HTT). L'HTT è principalmente associata a vescicole e microtubuli ed è probabilmente coinvolta nei processi di trasporto dipendenti dai microtubuli^1,2. Per studiare l'influenza dell'HTT mutante sulla dinamica dei microtubuli, abbiamo utilizzato la visualizzazione in vitro della proteina EB3, che regola le proprietà dinamiche dei microtubuli legando e stabilizzando i plus-end in crescita. Per caricare EB3 etichettato in modo fluorescente nei fibroblasti della pelle umana, è stata applicata la trasfezione del plasmide. Abbiamo utilizzato la coltura primaria di fibroblasti ottenuta dalla biopsia cutanea dei pazienti MH per questo studio.

La mutazione nel gene della proteina HTT porta all'allungamento del tratto poliglutammina³. HTT ha un ruolo in tali processi cellulari come l'endocitosi⁴, il trasporto cellulare^1,2, la degradazione delle proteine⁵, ecc. Parte sostanziale di questi processi coinvolge vari elementi del citoscheletro cellulare, compresi i microtubuli.

Le cellule primarie umane sono il modello migliore per riprodurre il più fedelmente possibile gli eventi che si verificano nelle cellule dei pazienti. Per creare tali modelli, è necessario isolare le cellule dal materiale bioptico umano (ad esempio, da campioni chirurgici). La linea cellulare primaria risultante è adatta per studiare la patogenesi utilizzando vari metodi genetici, biochimici, molecolari e di biologia cellulare. Inoltre, le colture cellulari primarie umane fungono da precursore per la creazione di varie colture transdifferenziate e transgeniche⁶.

Tuttavia, a differenza delle colture cellulari immortalizzate, lo svantaggio significativo delle cellule primarie è la loro limitata capacità di passaggio. Pertanto, si consiglia di utilizzare le cellule nella fase dei primi passaggi (fino a 15). Le culture più vecchie degenerano molto rapidamente, perdendo le loro proprietà uniche. Pertanto, le cellule primarie appena ottenute dovrebbero essere mantenute congelate per la conservazione a lungo termine.

Le colture cellulari primarie sono suscettibili alle condizioni di coltivazione. Pertanto, spesso richiedono approcci unici e ottimizzazione delle condizioni di crescita. In particolare, i fibroblasti primari della pelle umana utilizzati nei nostri esperimenti sono esigenti sul substrato. Quindi, abbiamo usato vari rivestimenti aggiuntivi (ad esempio, gelatina o fibronectina) a seconda del tipo di esperimento.

Il citoscheletro cellulare determina la forma, la mobilità e la locomozione cellulare. La dinamica del citoscheletro è cruciale per molti processi intracellulari sia nell'interfase che nella mitosi. In particolare, il citoscheletro polimerizzato dalla tubulina, sono strutture altamente dinamiche e polari, consentendo il trasporto intracellulare diretto mediato da proteine motorie. Le estremità dei microtubuli sono in costante riarrangiamento, le loro fasi di assemblaggio si alternano alle fasi di smontaggio, e questo comportamento è chiamato "instabilità dinamica"^7,8,9. Varie proteine associate spostano l'equilibrio della reazione di polimerizzazione, portando alla formazione del polimero o alla formazione del monomero proteico. L'aggiunta di subunità di tubulina avviene principalmente all'estremità superiore dei microtubuli¹⁰. La famiglia delle proteine end-binding (EB) è composta da tre membri: EB1, EB2 ed EB3. Servono come proteine plus-end-tracking (+TIP) e regolano le proprietà dinamiche dei microtubuli legando e stabilizzando i loro plus-end in^{crescita 11}.

Molti studi utilizzano la microiniezione o la trasfezione di tubulina marcata con molecole fluorescenti con imaging time-lapse e analisi video per visualizzare i microtubuli in vitro. Questi metodi potrebbero essere invasivi e dannosi per le cellule, in particolare le cellule umane primarie. Il passo più impegnativo è trovare le condizioni per la trasfezione cellulare. Abbiamo cercato di raggiungere il più alto livello possibile di trasfezione senza influire sulla vitalità e sulla morfologia delle cellule native. Questo studio applica il metodo classico per studiare le differenze nella dinamica dei microtubuli nei fibroblasti cutanei di donatori sani e pazienti con malattia di Huntington.

Protocollo

Questo protocollo segue le linee guida del Centro federale di ricerca e clinica di medicina fisico-chimica dell'Agenzia federale di biologia medica datate 8 settembre 2015.

NOTA: la Figura 1 fornisce una panoramica del protocollo.

1. Ottenere una coltura primaria di fibroblasti cutanei umani (Figura 2)

1. Consegnare la biopsia a un laboratorio entro poche ore nel mezzo Modified Eagle Media (DMEM) di Dulbecco integrato con 50 μg / mL di penicillina e 50 U / mL di streptomicina.
   NOTA: Una biopsia cutanea deve essere eseguita in condizioni sterili da un medico dopo che un paziente ha firmato un consenso informato.
2. Posizionare il tessuto bioptico in una capsula di Petri di 6 cm insieme a una piccola quantità del mezzo.
3. Usando un bisturi sterile, tagliare il campione di biopsia in pezzi di circa 0,5-1 mm di dimensione. Posizionare 1-2 frammenti ottenuti in una capsula di Petri di 3,5 cm e posizionare una copertura sterile sopra i pezzi della biopsia. Aggiungere lentamente 1,5 mL di un mezzo di crescita alla seguente composizione: DMEM, 50 U / mL di penicillina-streptomicina e 10% di siero bovino fetale (FBS).
4. Fibroblasti di coltura nel terreno di crescita all'interno di un incubatore a CO₂ mantenuti al 5% di CO_2,37 °C, 80% di umidità.
   NOTA: Dopo 4-7 giorni, prima i cheratinociti, poi i fibroblasti, iniziano a migrare dal tessuto al fondo del piatto.

2. Conservazione, congelamento e scongelamento della cultura primaria

1. Rimuovere le cellule dal piatto di coltura (vedere punti 3.2-3.4).
2. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 mL e centrifugare per 5 minuti a 200 x g. Quindi scartare il surnatante e risospesciare il pellet cellulare in 900 μL di FBS raffreddato.
3. Trasferire in un tubo di crioconservazione goccia a goccia e aggiungere 100 μL di dimetilsolfossido (DMSO).
4. Posizionare la criosonda in un congelatore a bassa temperatura a -80 °C. Ventiquattro ore dopo, trasferire il crioviale in azoto liquido (-196 °C) per la conservazione a lungo termine.
5. Per scongelare le cellule crioconservate, rimuovere il crioviale dallo stoccaggio dell'azoto e, entro 1 minuto, trasferire 1 mL del contenuto in un tubo conico da 15 mL contenente 9 mL del mezzo di trasporto preriscaldato a 37 °C.
6. Risospese con cura e poi centrifugare il tubo per 5 min a 200 x g. Scartare il surnatante, risospesere il pellet cellulare nel volume richiesto del mezzo di crescita e posizionarlo su una capsula di Petri del diametro richiesto.

3. Coltivazione cellulare

1. Coprire il fondo del piatto con una soluzione di gelatina autoclavata allo 0,1% preparata in acqua distillata. Incubare per 15 min.
   NOTA: per la visualizzazione della trasfezione, devono essere utilizzate piastre con fondo di vetro (piastre confocali con spessore di vetro 170 μm).
2. Preparare un terreno di coltura con la seguente composizione: DMEM integrato con 10% FBS, 2 mM L-alanil-L-glutammina, 50 U / mL penicillina-streptomicina. Mescolare accuratamente e conservare a 4 °C. Riscaldare il mezzo a 37 °C prima di aggiungerlo alle celle.
3. Valutare la coltura al microscopio. Rimuovere il mezzo e lavare i fibroblasti con la soluzione di fosfato-sale di Dulbecco (DPBS).
4. Aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina allo 0,25% preriscaldata alle cellule. Controllare le cellule al microscopio se si staccano completamente dal substrato. Disattivare la tripsina con 1 mL del terreno di coltura.
5. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 ml. Centrifugare il tubo a 200 x g per 5 minuti, rimuovere il surnatante e risospescere il pellet cellulare in 1 mL del terreno di coltura.
6. Contare il numero di celle. Calcolare il numero richiesto di cellule per seminarle con una densità di 8-15 x^{10 3}/ cm² e risospese in 2 mL del terreno di coltura.
7. Rimuovere la soluzione di gelatina dalla capsula di coltura e aggiungere immediatamente 2 ml di sospensione cellulare. Coltivare i fibroblasti a 37 °C in un incubatore a CO_2.
8. Aggiorna il mezzo ogni 2-4 giorni.
   NOTA: Per gli esperimenti, utilizzare le celle di 4-11 passaggi.

4. Trasfezione

1. Sostituire il terreno di coltura con un terreno di coltura fresco 24 ore prima della trasfezione.
   NOTA: la confluenza cellulare deve essere del 70-80%.
2. Preparare un complesso DNA-lipidico basato sull'area e la densità della semina cellulare. Utilizzare agente di trasfezione a base di liposomi.
   NOTA: utilizzare la densità di semina delle celle come 1 x 10⁴ celle/cm².
3. Aggiungere 3 μL di reagente di trasfezione commerciale a 125 μL di mezzo essenziale minimo ottimale (Opti-MEM) non contenente antibiotici, senza toccare le pareti del tubo. Risospendare delicatamente.
4. Diluire il DNA plasmidico (GFP-EB3) aggiungendo 1 μg del DNA plasmidico a 125 μL di Opti-MEM. Risospendare delicatamente.
   NOTA: La codifica vettoriale di espressione GFP-EB3¹¹ è stata ricevuta come regalo gentile dal Dr. I. Kaverina (Vanderbilt University, Nashville) con il permesso del Dr. A. Akhmanova (Erasmus University, Rotterdam)¹¹.
5. Aggiungere DNA plasmidico diluito a ciascun tubo di reagente di trasfezione diluito (1:1). Incubare per 30 min.
6. Aggiungere il complesso DNA-lipidi alla capsula di Petri da 6 cm contenente cellule e mescolare con un'altalena cruciforme per 30 s. Incubare le cellule con un agente di trasfezione per 24 ore e poi passare a mezzo fresco. Analizzare l'efficienza della trasfezione dopo 24 ore e 48 ore.
   NOTA: 24 ore dopo la trasfezione, l'efficienza era del 10-15% e dopo 48 ore fino al 40%.

5. Preparazione per l'imaging

1. Prima dell'imaging dal vivo delle cellule, cambiare il terreno di coltura in un mezzo senza colorante indicatore di pH per ridurre l'autofluorescenza.
2. Applicare con attenzione l'olio minerale sulla superficie del mezzo per coprire completamente il mezzo, isolandolo dall'ambiente esterno per ridurre la penetrazione di O₂ e l'evaporazione del mezzo.
3. Utilizzare una lampada al mercurio e un obiettivo a immersione in olio 60x o 100x con un'apertura numerica elevata per scattare le immagini.
   NOTA: Per le osservazioni in vivo, il microscopio deve essere dotato di un incubatore per mantenere le condizioni necessarie per le cellule, compreso il riscaldamento della tabella degli oggetti e della lente a +37 °C, una camera chiusa con alimentazione di CO₂ e supporto del livello di umidità. Utilizzare acqua doppia distillata per creare umidità. Controllare il livello di acqua doppia distillata prima di filmare.
4. Posizionare il piatto confocale con le cellule nel supporto del microscopio prima dell'imaging. Assicurarsi che la parabola e la fotocamera siano saldamente attaccate al supporto per evitare la deriva durante lo scatto di immagini.

6. Impostazione dei parametri di imaging

1. Scegli i bassi valori di esposizione poiché la luce induce specie reattive dell'ossigeno (ROS) dannose per le cellule.
   NOTA: Per studiare la dinamica dei microtubuli nei fibroblasti cutanei umani, è stata selezionata un'esposizione di 300 ms.
2. Concentrati sull'oggetto di interesse.
   NOTA: per l'imaging time-lapse a lungo termine, utilizzare il sistema di stabilizzazione automatica della messa a fuoco per compensare un possibile spostamento lungo l'asse z.
3. Scegli le condizioni di imaging ottimali in base alla fotosensibilità delle cellule e al tasso di sbiadimento del fluorocromo.
   NOTA: poiché i microtubuli sono strutture altamente dinamiche, è possibile selezionare un intervallo di tempo ragionevolmente breve e la frequenza dei fotogrammi deve essere sufficientemente elevata. Per studiare la dinamica dei microtubuli nei fibroblasti cutanei, abbiamo usato ad una frequenza di 1 fotogramma/i per 3-5 min.
4. Quando selezionate l'oggetto successivo per ottenere l'immagine, allontanatevi dall'area già fotografata. Poiché quest'area era sotto l'influenza della luce, ci sarà un notevole foto-sbiancamento.
   NOTA: poiché è stata utilizzata una frequenza di imaging relativamente elevata, l'otturatore non si è chiuso tra le immagini e la lampada è stata accesa per l'intero periodo di imaging, motivo per cui lo sbiadimento è aumentato.
5. Scegli il video ottimale per studiare visivamente la dinamica dei microtubuli, tenendo conto della qualità della trasfezione, della qualità delle immagini dei microtubuli (rapporto segnale-rumore ottimale) e dell'assenza di deriva in caso di cellula analizzata (Figura 3).
6. Utilizzare i video selezionati per studiare le dinamiche plus-end dei microtubuli tracciandoli nel programma ImageJ o Fiji (Figura 4).
   NOTA: per le istruzioni per l'analisi quantitativa, vedere la Figura supplementare 2 e il Fascicolo supplementare 1.

Risultati

I filmati GFP-EB3 risultanti prodotti utilizzando il protocollo (Figura 1) illustrano le proprietà dinamiche dei microtubuli. I microtubuli sono coinvolti in diversi processi cellulari e le loro proprietà dinamiche influenzano varie caratteristiche vitali della coltura cellulare umana primaria dal materiale bioptico dei pazienti (Figura 2).

I seguenti parametri determinano l'instabilità dinamica dei microtubuli: i tassi di crescita...

Discussione

Risultati di migliore qualità per l'analisi dinamica dei microtubuli possono essere ottenuti da immagini microscopiche di alta qualità. È importante osservare tutte le condizioni necessarie per l'imaging time-lapse delle cellule viventi e regolare correttamente i parametri di imaging. L'uso di speciali piatti di coltura cellulare con un fondo di vetro (piatti confocali) è importante, poiché il vetro ha un diverso indice di rifrazione della luce rispetto alla plastica. Anche lo spessore del vetro e la sua uniformità...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instrumentation
Camera iXon DU897 EMCCD	Andor Technology
Eppendorf Centrifuge 5804 R	Eppendorf Corporate
Fluorescence filter set HYQ FITC	Nikon		Alternative: Leica, Olympus, Zeiss
LUNA-II Automated Cell Counte	Logos Biosystems	L40002
Microscope incubator for lifetime filming	Okolab	Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS
		Gas controller CO2-O2-UNIT-BL
Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13)	Nikon		Alternative: Leica, Olympus, Zeiss
Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E	Nikon		Alternative: Leica, Olympus, Zeiss
Software
Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c)	Open source image processing software
NIS Elements	Nikon		Alternative: Leica, Olympus, Zeiss
Additional reagents
Mineral oil (Light white oil)	MP	151694
Cell culture dish
Cell Culture Dish	SPL Lifesciences	20035
Confocal Dish (glass thickness 170 µm)	SPL Lifesciences	211350	Alternative: MatTek
Conical Centrifuge tube	SPL Lifesciences	50015
Cryogenic Vials	Corning-Costar	430659
Microcentrifuge Tube	Nest	615001
Cultivation
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	L3000001
Dimethyl sulfoxide	PanEko	135
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media)	PanEko	C420
DPBS (Dulbecco's phosphate-salt solution)	PanEko	P060
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	K053/SH30071.03
Gelatin (bovine skin)	PanEko	070
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050038
Opti-MEM (1x) + Glutamax	Gibco	519850026
Penicillin-streptomycin	PanEko	A063
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo Fisher Scientific	25200072
Transfection
Plasmid DNA with EB3-GFP	Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova [Erasmus University, Rotterdam]	Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003