Un método de inoculación eficaz para Phytophthora capsici en plantas de pimienta negra

Resumen

Pinchar la cabeza basal de la planta de pimienta negra es un método breve y que ahorra tiempo para dañarla. Aquí, proporcionamos pasos detallados con un video para infectar plantas de pimienta negra.

Resumen

Piper nigrum L. (pimienta negra) es una vid leñosa típica que es un cultivo de especias económicamente importante en todo el mundo. La producción de pimienta negra se ve afectada significativamente por la enfermedad de la podredumbre de la raíz causada por Phytophthora capsici, que ha influido seriamente en el desarrollo de la industria como un problema de "punto de estrangulamiento". Sin embargo, el mecanismo genético molecular de resistencia en la pimienta negra no está claro, lo que lleva a un progreso lento en el desarrollo de nuevas variedades de pimienta negra. Una inoculación efectiva y un sistema de muestreo preciso para Phytophthora capsici en plantas de pimienta negra es esencial para estudiar esta interacción planta-patógeno. El objetivo principal de este estudio es demostrar una metodología detallada donde la cabeza basal de la pimienta negra se inocula con Phytophthora capsici, al tiempo que proporciona una referencia para la inoculación de plantas de vid leñosa. La cabeza basal de la planta de pimienta negra fue pinchada para dañarla, y los gránulos miceliales cubrieron los tres agujeros para retener la humedad y así el patógeno pudiera infectar bien la planta. Este método proporciona una mejor manera de resolver la inestabilidad causada por los métodos tradicionales de inoculación, incluido el empapamiento del suelo o la inmersión de la raíz. También proporciona un medio prometedor para estudiar el modo de acción entre las plantas y otros patógenos de plantas transmitidos por el suelo en el mejoramiento agrícola de precisión.

Introducción

La pimienta negra (Piper nigrum L.) es una trepadora leñosa y uno de los cultivos de especias más importantes. Es conocido como el "Rey de las Especias"¹ y se cultiva en más de 40 países y regiones de Asia, África y América Latina. La podredumbre de la raíz de Phytophthora es la enfermedad más devastadora de la pimienta negra, y es causada por el oomiceto Phytophthora capsici. Este patógeno también infecta cucurbitáceas, berenjenas, chiles y tomates ^2,3. Con la pimienta negra, un cultivo entero a veces puede ser diezmado por esta enfermedad. La expansión de las áreas de siembra de pimiento está restringida como resultado de la falta de disponibilidad de variedades resistentes, lo que ha obstaculizado significativamente el desarrollo de la industria china de la pimienta negra. Una inoculación efectiva y un sistema de muestreo preciso para Phytophthora capsici en plantas de pimienta negra son esenciales para estudiar esta interacción planta-patógeno.

La identificación y el cribado de la resistencia en los recursos de germoplasma es el requisito básico para investigar la patogenicidad del patógeno y el mejoramiento y la utilización de variedades resistentes. Un enfoque ampliamente utilizado es utilizar una variedad de métodos de identificación basados en especies de plantas y grupos de patógenos. Los métodos de identificación actuales incluyen la identificación de poblaciones, la identificación individual, la identificación de órganos, la identificación de tejidos, la identificación celular, la identificación bioquímica y la identificación molecular, que se han desarrollado en los últimos años ^4,5. Ha habido éxito en estas áreas, pero también hay muchos problemas. No importa qué método se elija, los requisitos básicos de la identificación de la resistencia de la planta son consistentes, incluidos objetivos claros, resultados confiables y métodos que son simples, rápidos y fáciles de estandarizar. Este principio también debe seguirse en la identificación de la resistencia a la pimienta negra.

En condiciones de campo natural, la identificación de la resistencia a las enfermedades puede verse influenciada por muchos factores ambientales. Por lo tanto, se propuso que las hojas separadas y las raíces irrigadas se utilizaran en el laboratorio para identificar la resistencia a las enfermedades. Las hojas jóvenes de plantas sanas se inocularon in vitro en el laboratorio, y el área de hojas enfermas se midió inoculando el patógeno para identificar la resistencia a las enfermedades de las plantas⁶. Sin embargo, la inoculación foliar in vitro solo se puede utilizar para la identificación de resistencia general y no para estudios de interacción molecular. A pesar de esto, el estado de resistencia a la enfermedad a menudo se presenta en la inoculación radicular irrigada, causando incertidumbre en el estudio de seguimiento del mejoramiento molecular para la resistencia a la enfermedad. Por lo tanto, los métodos de detección de interiores rápidos y simples son esenciales. Este estudio tiene como objetivo proporcionar un método para la identificación de resistencias en el laboratorio.

Protocolo

1. Preparación de plantas de corte de pimienta negra para la infección

1. Tome un corte de cinco nodos, de aproximadamente 40 cm de largo con un diámetro de 0,5 cm, de una rama ortotrópica sana y de crecimiento vigoroso de pimienta negra con un cuchillo de poda desinfectado o secateurs. Pode los tres nodos inferiores de las ramas plagiotrópicas, con los dos nodos superiores restantes con aproximadamente 10 hojas intactas.
2. Prepare sustrato de enraizamiento que contenga tierra y estiércol animal (estiércol de vaca o estiércol de oveja) en una proporción de 1: 1. Autoclave el sustrato de enraizamiento a 121 °C durante 20 min.
3. Inserte los esquejes en el sustrato de enraizamiento en un ángulo de aproximadamente 50 °, con el tercer nodo simplemente tocando la superficie del sustrato y la yema axilar en este nodo por encima del sustrato.
   NOTA: La bolsa utilizada aquí tiene las siguientes dimensiones: altura de 40-60 cm, diámetro de 25-30 cm.
4. Vierta 10-20 L de agua sobre las raíces de la planta. Coloque los esquejes en un invernadero con un 90% de sombra a una temperatura de 25-30 ° C para el enraizamiento y el crecimiento.

2. Propagación de Phytophthora capsici (P. capsici)

NOTA: Se mantiene un stock de cultivo de Phytophthora capsici en el laboratorio de protección vegetal del Instituto de Investigación de Especias y Bebidas, Academia China de Ciencias Agrícolas Tropicales⁷.

1. Cepille y limpie los tubérculos de papa con agua corriente del grifo y luego corte 200 g de papas en cubos de 1 cm³. Coloque algunos de los cubos en un vaso de precipitados que contenga 800 ml de agua de doble destilación (ddH₂O) y hierva durante 20 minutos.
2. Filtre el caldo a través de una gasa doble utilizando la filtración por gravedad. Preparar el agar de dextrosa de patata (PDA) añadiendo 20 g de dextrosa y 15 g de agar al filtrado y rematando el volumen hasta 1 L con ddH₂O. Autoclave la mezcla a 121 °C durante 20 min⁸.
3. Vierta 20 ml del PDA esterilizado en forma líquida en una placa de Petri redonda de 9 cm de diámetro dentro de una campana de flujo de aire laminar. Deje las placas PDA con tapas abiertas dentro de la campana de flujo de aire laminar durante la noche como un medio para evitar la condensación.
4. Use un lazo de inoculación para recoger micelios de la cepa de Phytophthora capsici dentro de un tubo de ensayo. Coloque el inóculo con el lado micelial en contacto con el PDA en una placa de Petri.

3. Infección de pimienta negra

1. Incubación
   1. Identifique un área de 5 cm por encima de la superficie del sustrato y cerca de las raíces en el tallo para la inoculación.
   2. Extraiga un disco de micelio de 0,5 cm de diámetro en el borde de crecimiento del cultivo de Phytophthora capsici en PDA en una placa de Petri utilizando un barrenador tapón.
   3. Dañe el tallo con una aguja de jeringa y haga tres agujeros en un patrón triangular en el área de inoculación seleccionada. Cubra cada orificio con un disco micelio. Coloque los orificios cerca uno del otro para asegurarse de que el área herida esté completamente cubierta con los discos miceliales.
   4. Cubra los discos miceliales con almohadillas de algodón humedecidas esterilizadas como un medio para evitar el secado. Ata la almohadilla al tallo con una tira de polietileno para mantener la posición de los discos inoculantes.
      NOTA: A las 8 h después de la inoculación, los agujeros inoculados se volvieron negros y la lesión se extendió a medida que pasaba el tiempo. Las hojas se volvieron amarillas y se cayeron, y la planta inoculada murió 7-10 días después de la inoculación. No se desarrollaron lesiones en las plantas de control. La mayoría de los genes se expresaron de manera diferente después de la inoculación con Phytophthora capsici en comparación con el grupo control. El análisis histopatológico de los tejidos infectados demostró que Phytophthora capsici colonizó en el xilema.
2. Muestrear los materiales vegetales de interés y almacenarlos a -80 °C en nitrógeno líquido para su uso en estudios posteriores.
   NOTA: El nitrógeno líquido, las bolsas de plástico, los rotuladores, las cizallas de ramas y otros materiales se prepararon antes de los experimentos.
3. Después de muestrear los materiales vegetales específicos para su uso, autoclave todos los materiales vegetales restantes, el cultivo y el medio de cultivo de Phytophthora capsici sobrantes, y todos los instrumentos y artículos de laboratorio utilizados en este trabajo de inoculación.

Resultados

La Figura 1 muestra los síntomas de las hojas de pimienta negra después de la inoculación de P. capsici . La Figura 2 muestra los síntomas de los tallos de pimienta negra después de la inoculación de P. capsici . El patógeno infectó la pimienta negra en el tallo basal; síntomas que incluyen amarilleo de las hojas, aparición de marchitamiento, pardeamiento del xilema y ennegrecimiento de los vasos que aparecen gradualmente. 

Discusión

En este estudio, la cabeza basal fue pinchada para dañar y proporcionar un sistema de inoculación eficaz en la planta de pimienta negra. Los gránulos de micelio cubrieron los tres orificios para retener la humedad y permitir que el patógeno infecte bien la planta. Después de la inoculación, las hojas se volvieron amarillas y se cayeron y las plantas inoculadas murieron. No se desarrollaron lesiones en las plantas de control. La mayoría de los genes se expresaron de manera diferente después de la inoculación con ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar powder	Solarbio	A8190
Clean bench	Haier
Dextrose	Xilong Scientific	15700501
High temperature sterilizing oven	Zaelway
Petri dish plates	Biosharp	BS-90-D