שיטת חיסון יעילה עבור Phytophthora capsici על צמחי פלפל שחור

Summary

הצמדת הראש הבסיסי של צמח הפלפל השחור היא שיטה קצרה וחסכונית בזמן כדי לפגוע בו. כאן סיפקנו שלבים מפורטים עם סרטון להדבקת צמחי פלפל שחור.

Abstract

פייפר ניגרום ל. (פלפל שחור) הוא גפן עצית טיפוסית שהיא גידול תבלינים חשוב מבחינה כלכלית ברחבי העולם. ייצור הפלפל השחור מושפע באופן משמעותי ממחלת ריקבון השורשים הנגרמת על ידי Phytophthora capsici, אשר השפיעה קשות על התפתחות התעשייה כבעיית "נקודת חנק". עם זאת, המנגנון הגנטי המולקולרי של עמידות בפלפל שחור אינו ברור, מה שמוביל להתקדמות איטית בפיתוח זנים חדשים של פלפל שחור. חיסון יעיל ומערכת דגימה מדויקת עבור Phytophthora capsici על צמחי פלפל שחור חיוניים לחקר האינטראקציה הזו בין צמחים לפתוגנים. המטרה העיקרית של מחקר זה היא להדגים מתודולוגיה מפורטת שבה הראש הבסיסי של פלפל שחור מחוסן עם Phytophthora capsici, תוך מתן התייחסות גם לחיסון של צמחי גפן עציים. הראש הבסיסי של צמח הפלפל השחור ננעץ כדי לפגוע בו, וכדורי תפטיר כיסו את שלושת החורים כדי לשמור על הלחות כדי שהפתוגן יוכל להדביק את הצמח היטב. שיטה זו מספקת דרך טובה יותר לפתור את חוסר היציבות הנגרם על ידי שיטות חיסון מסורתיות כולל סחף אדמה או טבילת שורשים. הוא גם מספק אמצעי מבטיח לחקר אופן הפעולה בין צמחים לבין פתוגנים צמחיים אחרים הנישאים בקרקע בגידול חקלאי מדויק.

Introduction

פלפל שחור (Piper nigrum L.) הוא מטפס עצי ואחד מגידולי התבלינים החשובים ביותר. הוא ידוע בשם "מלך התבלינים"¹ והוא מעובד ביותר מ -40 מדינות ואזורים ברחבי אסיה, אפריקה ואמריקה הלטינית. ריקבון שורש פיטופתורה הוא המחלה ההרסנית ביותר של פלפל שחור, והוא נגרם על ידי oomycete Phytophthora capsici. פתוגן זה מדביק גם קוקורביטים, חצילים, פלפלי צ'ילי ועגבניות ^2,3. עם פלפל שחור, יבול שלם יכול לפעמים להיות מרוסק על ידי מחלה זו. התרחבות אזורי שתילת הפלפלים מוגבלת כתוצאה מחוסר זמינותם של זנים עמידים, מה שעיכב משמעותית את התפתחות תעשיית הפלפל השחור הסינית. חיסון יעיל ומערכת דגימה מדויקת של Phytophthora capsici על צמחי פלפל שחור חיוניים לחקר האינטראקציה בין צמחים לפתוגנים.

זיהוי וסינון של עמידות במשאבי נבט הוא הדרישה הבסיסית לחקר הפתוגניות של הפתוגן וגידול וניצול של זנים עמידים. גישה נפוצה היא שימוש במגוון שיטות זיהוי המבוססות על מיני צמחים וקבוצות פתוגנים. שיטות הזיהוי הנוכחיות כוללות זיהוי אוכלוסייה, זיהוי אישי, זיהוי איברים, זיהוי רקמות, זיהוי תאים, זיהוי ביוכימי וזיהוי מולקולרי, אשר פותחו בשנים האחרונות ^4,5. הייתה הצלחה בתחומים אלה, אך יש גם בעיות רבות. לא משנה באיזו שיטה נבחרה, הדרישות הבסיסיות של זיהוי עמידות הצמחים הן עקביות, כולל מטרות ברורות, תוצאות אמינות ושיטות פשוטות, מהירות וקלות לסטנדרטיזציה. עיקרון זה חייב להתבצע גם בזיהוי עמידות פלפל שחור.

בתנאי שדה טבעיים, זיהוי עמידות למחלות יכול להיות מושפע מגורמים סביבתיים רבים. לכן, הוצע כי עלים מנותקים ושורשים מושקים ישמשו במעבדה כדי לזהות עמידות למחלות. עלים צעירים מצמחים בריאים חוסנו במבחנה במעבדה, ואזור העלים החולים נמדד על ידי חיסון הפתוגן על מנת לזהות את עמידותם למחלות של צמחים⁶. עם זאת, חיסון עלים במבחנה יכול לשמש רק לזיהוי התנגדות כללית ולא למחקרי אינטראקציה מולקולרית. למרות זאת, הסטטוס העמיד למחלה מופיע לעתים קרובות בחיסון השורש המושקה, וגורם לאי-ודאות במחקר המעקב אחר גידול מולקולרי לעמידות למחלות. לכן, שיטות זיהוי מהירות ופשוטות בתוך הבית הן חיוניות. מחקר זה נועד לספק שיטה לזיהוי עמידות במעבדה.

Protocol

1. הכנת צמחי חיתוך פלפל שחור לזיהום

1. יש לבצע חיתוך של חמישה צמתים, באורך של כ-40 ס"מ בקוטר של 0.5 ס"מ, מענף אורתוטרופי בריא וצומח במרץ של פלפל שחור באמצעות סכין גיזום מחוטאת או פרשיות. גוזמים את שלושת הצמתים התחתונים של הענפים הפלגיוטרופיים, כאשר שני הצמתים העליונים נותרו עם כ-10 עלים שלמים.
2. הכינו מצע השתרשות המכיל אדמה וזבל בעלי חיים (גללי פרות או גללי כבשים) ביחס של 1:1. Autoclaveed את מצע ההשתרשות ב 121 °C (66 °F) למשך 20 דקות.
3. הכנס את החיתוכים למצע ההשתרשות בזווית של כ-50°, כאשר הצומת השלישי רק נוגע במשטח המצע ובניצן בית השחי בצומת זה מעל המצע.
   הערה: התיק המשמש כאן הוא בעל המידות הבאות: גובה של 40-60 ס"מ, קוטר של 25-30 ס"מ.
4. יוצקים 10-20 ליטר מים על שורשי הצמח. מקם את החיתוכים בחממה עם 90% צל בטמפרטורה של 25-30 מעלות צלזיוס להשתרשות וצמיחה.

2. התפשטות של פיטופתורה קפסיקי (P. capsici)

הערה: מלאי של תרבית Phytophthora capsici נשמר במעבדה להגנת הצומח של המכון לחקר התבלינים והמשקאות, האקדמיה הסינית למדעי החקלאות הטרופית⁷.

1. מברישים ומנקים את פקעות תפוחי האדמה תחת מי ברז זורמים ואז חותכים 200 גרם תפוחי אדמה לקוביות של 1 ס"מ³. מכניסים חלק מהקוביות לכוס המכילה 800 מ"ל של מים מזוקקים כפולים (ddH₂O) ומרתיחים במשך 20 דקות.
2. סנן את המרק באמצעות גזה כפולה באמצעות סינון כוח הכבידה. הכינו אגר דקסטרוז תפוחי אדמה (PDA) על ידי הוספת 20 גרם דקסטרוז ו-15 גרם אגר לתנין והגדלת הנפח עד 1 ליטר עם ddH₂O. אוטוקלאב את התערובת ב-121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות^ו-8 דקות.
3. יוצקים 20 מ"ל של מחשב כף היד המעוקר בצורה נוזלית לתוך צלחת פטרי עגולה בקוטר 9 ס"מ בתוך מכסה מנוע זרימת אוויר למינרי. השאירו את לוחות ה-PDA עם מכסים פתוחים בתוך מכסה המנוע של זרימת האוויר הלמינרי למשך הלילה כאמצעי למניעת עיבוי.
4. השתמשו בלולאת חיסון כדי לאסוף תפטירים ממלאי Phytophthora capsici בתוך מבחנה. הניחו את האינוקולום עם הצד התפטירי במגע עם ה-PDA בצלחת פטרי.

3. זיהום של פלפל שחור

1. דגירה
   1. זהה שטח של 5 ס"מ מעל פני המצע וקרוב לשורשים על הגבעול לצורך חיסון.
   2. ליבת דיסק של תפטירים בקוטר 0.5 ס"מ בקצה ההולך וגדל של תרבית הקפסולית Phytophthora על מחשב כף יד בצלחת פטרי באמצעות בור פקק.
   3. פגעו בגבעול באמצעות מחט מזרק ויצרו שלושה חורים בתבנית משולשת באזור החיסון שנבחר. מכסים כל חור בדיסקה תפטירית. מקם את החורים קרוב זה לזה כדי להבטיח שהאזור הפצוע מכוסה במלואו בדיסקות התפטיר.
   4. מכסים את הדיסקים התפטיריים בכריות כותנה מעוקרות ולחות כאמצעי למניעת ייבוש. קשרו את הפד לגבעול עם רצועת פוליאתילן כדי לשמור על מיקום הדיסקים המחוסנים.
      הערה: בשעה 8 שעות לאחר החיסון, החורים המחוסנים הפכו שחורים והנגע התארך ככל שחלף הזמן. העלים הפכו צהובים ונשרו, והצמח המחוסן מת 7-10 ימים לאחר החיסון. לא התפתחו נגעים בצמחי הבקרה. רוב הגנים התבטאו באופן שונה לאחר חיסון עם Phytophthora capsici בהשוואה לקבוצת הביקורת. ניתוח היסטופתולוגי של הרקמות הנגועות הראה כי פיטופתורה קפסיצ'י התיישב בקסילם.
2. דגימת החומרים הצמחיים המעניינים ומאחסנת בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס בחנקן נוזלי לשימוש במחקרים הבאים.
   הערה: חנקן נוזלי, שקיות פלסטיק, עטי טוש, גזירה של ענפים וחומרים אחרים הוכנו לפני הניסויים.
3. לאחר שהחומרים הצמחיים הספציפיים נדגמים לשימוש, ציידו באופן אוטומטי את כל החומרים הצמחיים הנותרים, את תרבית הקפסולה של Phytophthora ואת מדיום התרבית, ואת כל המכשירים וכלי המעבדה המשמשים בעבודת חיסון זו.

תוצאות

איור 1 מראה את הסימפטומים של עלי פלפל שחור בעקבות חיסון P. capsici . איור 2 מראה את הסימפטומים של גבעולי פלפל שחור לאחר חיסון P. capsici . הפתוגן הדביק את הפלפל השחור בגזע הבסיס; תסמינים הכוללים הצהבת עלים, הופעת רטט, השחמה של קסילם והשחרת כלי דם המופיעים בהדר?...

Discussion

במחקר זה, ראש הבסיס ננעץ כדי לגרום נזקים ולספק מערכת חיסונים יעילה בצמח הפלפל השחור. לאחר מכן כיסו כדורי התפטיר את שלושת החורים כדי לשמור על הלחות ולאפשר לפתוגן להדביק את הצמח היטב. לאחר החיסון, העלים הפכו צהובים ונשרו והצמחים המחוסנים מתו. לא התפתחו נגעים בצמחי הבקרה. רוב הגנים התבטאו באופ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar powder	Solarbio	A8190
Clean bench	Haier
Dextrose	Xilong Scientific	15700501
High temperature sterilizing oven	Zaelway
Petri dish plates	Biosharp	BS-90-D