Эффективный метод посева Phytophthora capsici на растениях черного перца

Резюме

Прикалывание прикорневой головки растения черного перца является коротким и экономящим время методом его повреждения. Здесь мы предоставили подробные шаги с видео для заражения растений черного перца.

Аннотация

Piper nigrum L. (черный перец) - типичная древесная лоза, которая является экономически важной культурой специй во всем мире. На производство черного перца значительно влияет болезнь корневой гнили, вызванная Phytophthora capsici, которая серьезно повлияла на развитие отрасли как проблема «удушья». Однако молекулярно-генетический механизм резистентности у черного перца неясен, что приводит к медленному прогрессу в развитии новых сортов черного перца. Эффективная система посева и точного отбора проб Phytophthora capsici на растениях черного перца имеет важное значение для изучения этого взаимодействия растений и патогенов. Основной целью этого исследования является демонстрация подробной методологии, в которой базальная головка черного перца инокулируется Phytophthora capsici, а также обеспечивает ссылку на прививку древесных виноградных растений. Базальная головка растения черного перца была приколота, чтобы повредить его, а гранулы мицелиала покрыла три отверстия, чтобы сохранить влагу, чтобы патоген мог хорошо заразить растение. Этот метод обеспечивает лучший способ решения нестабильности, вызванной традиционными методами посева, включая обливание почвы или погружение корней. Он также предоставляет перспективные средства для изучения способа действия между растениями и другими почвенными патогенами растений в сельскохозяйственной точной селекции.

Введение

Черный перец (Piper nigrum L.) является древесным альпинистом и одной из самых важных культур специй. Он известен как «Король специй»¹ и культивируется в более чем 40 странах и регионах Азии, Африки и Латинской Америки. Корневая гниль Phytophthora является самым разрушительным заболеванием черного перца и вызывается оомицетом Phytophthora capsici. Этот возбудитель также поражает кукурбиты, баклажаны, перец чили и помидоры ^2,3. С черным перцем целый урожай иногда может быть уничтожен этим заболеванием. Расширение посевных площадей перца ограничено в результате отсутствия устойчивых сортов, что значительно затруднило развитие китайской индустрии черного перца. Эффективная прививка и точная система отбора проб Phytophthora capsici на растениях черного перца имеют важное значение для изучения этого взаимодействия растений и патогенов.

Выявление и скрининг резистентности в ресурсах зародышевой плазмы является основным требованием для исследования патогенности патогена, а также для селекции и использования резистентных сортов. Широко используемый подход заключается в использовании различных методов идентификации на основе видов растений и групп патогенов. Современные методы идентификации включают идентификацию популяции, индивидуальную идентификацию, идентификацию органов, идентификацию тканей, идентификацию клеток, биохимическую идентификацию и молекулярную идентификацию, которые были разработаны в последние годы ^4,5. В этих областях были достигнуты успехи, но есть и много проблем. Независимо от того, какой метод выбран, основные требования идентификации устойчивости растений являются последовательными, включая четкие цели, надежные результаты и методы, которые просты, быстры и легко стандартизируются. Этот принцип также должен соблюдаться при выявлении устойчивости черного перца.

В естественных полевых условиях на выявление устойчивости к болезням могут влиять многие факторы окружающей среды. Поэтому было предложено использовать в лаборатории отдельные листья и орошаемые корни для выявления устойчивости к болезням. Молодые листья здоровых растений прививали in vitro в лаборатории, а площадь больных листьев измеряли путем инокуляции возбудителя с целью выявления устойчивости растений к болезням⁶. Однако прививка листьев in vitro может использоваться только для общей идентификации резистентности, а не для исследований молекулярного взаимодействия. Несмотря на это, статус устойчивости к болезням часто присутствует в орошаемой корневой прививке, вызывая неопределенность в последующем исследовании молекулярной селекции для устойчивости к болезням. Поэтому быстрые и простые методы обнаружения внутри помещений имеют важное значение. Это исследование направлено на то, чтобы обеспечить метод идентификации резистентности в лаборатории.

протокол

1. Подготовка растений черного перца к заражению

1. Возьмите пятиузловый черенок, длиной около 40 см и диаметром 0,5 см, из здоровой и энергично растущей ортотропной ветви черного перца с помощью дезинфицированного ножа для обрезки или секаторов. Обрежьте три нижних узла плагиотропных ветвей, при этом два верхних узла остались с примерно 10 нетронутыми листьями.
2. Готовят укореняющий субстрат, содержащий почвенный и животный навоз (коровий навоз или навоз овец) в соотношении 1:1. Автоклав укореняющего субстрата при 121 °C в течение 20 мин.
3. Вставьте черенки в укореняющий субстрат под углом примерно 50°, при этом третий узел просто касается поверхности субстрата и подмышечной почки на этом узле над субстратом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сумка, используемая здесь, имеет следующие размеры: высота 40-60 см, диаметр 25-30 см.
4. Налейте 10-20 л воды на корни растения. Поместите черенки в теплицу с 90% оттенком при температуре 25-30 °C для укоренения и роста.

2. Размножение Phytophthora capsici (P. capsici)

ПРИМЕЧАНИЕ: Запас культуры Phytophthora capsici хранится в лаборатории защиты растений Научно-исследовательского института специй и напитков Китайской академии тропических сельскохозяйственных наук⁷.

1. Смажьте щеткой и очистите клубни картофеля под проточной водопроводной водой, а затем нарежьте 200 г картофеля кубиками по 1^см3. Поместите часть кубиков в стакан, содержащий 800 мл двойной дистиллированной воды (ddH₂O) и кипятите в течение 20 минут.
2. Процедить бульон через двойную марлю с помощью гравитационной фильтрации. Готовят картофельный декстрозный агар (КПК), добавляя в фильтрат 20 г декстрозы и 15 г агара и доливая объемом до 1 л с ddH₂O. Автоклав смеси при 121 °C в течение 20 мин⁸.
3. Вылейте 20 мл стерилизованного КПК в жидкой форме в круглую чашку Петри диаметром 9 см внутри ламинарной вытяжки с воздушным потоком. Оставьте пластины КПК с открытыми крышками внутри ламинарного вытяжки потока воздуха на ночь, чтобы предотвратить конденсацию.
4. Используйте петлю прививки, чтобы забрать мицелий из запаса Phytophthora capsici в пробирке. Поместите инокулятор с мицелиальной стороной в контакт с КПК в чашку Петри.

3. Заражение черным перцем

1. Инкубация
   1. Определите область 5 см над поверхностью субстрата и рядом с корнями на стебле для прививки.
   2. Выделите диск мицелия диаметром 0,5 см на растущем краю культуры Phytophthora capsici на КПК в чашке Петри с помощью пробки.
   3. Повредите стебель с помощью шприцевой иглы и сделайте три отверстия в треугольном рисунке в выбранной области прививки. Закройте каждое отверстие мицелиальным диском. Расположите отверстия близко друг к другу, чтобы область ранения была полностью покрыта мицелиальными дисками.
   4. Накройте мицелиальные диски стерилизованными увлажненными ватными дисками в качестве средства предотвращения высыхания. Привяжите прокладку к стеблю полиэтиленовой полоской, чтобы сохранить положение инокулирующих дисков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Через 8 ч после прививки привитые отверстия становились черными, и поражение расширялось с течением времени. Листья пожелтели и опали, а привитое растение погибло через 7-10 дней после прививки. Никаких поражений не развилось в контрольных растениях. Большинство генов экспрессировались по-разному после прививки Phytophthora capsici по сравнению с контрольной группой. Гистопатологический анализ инфицированных тканей показал, что Phytophthora capsici колонизирована в ксилеме.
2. Возьмите образец растительного материала, представляющего интерес, и храните при -80 °C в жидком азоте для использования в последующих исследованиях.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Жидкий азот, пластиковые пакеты, маркерные ручки, ножницы для ветвей и другие материалы были подготовлены до экспериментов.
3. После того, как конкретные растительные материалы отобраны для использования, автоклавирует все оставшиеся растительные материалы, оставшуюся культуру Phytophthora capsici и культуральную среду, а также все инструменты и лабораторную посуду, используемые в этой работе по вакцинации.

Результаты

На рисунке 1 показаны симптомы листьев черного перца после прививки P. capsici . На рисунке 2 показаны симптомы стеблей черного перца после прививки P. capsici . Возбудитель заразил черный перец на прикорневом стебле; симптомы, включая пожелтение листьев...

Обсуждение

В этом исследовании базальная головка была приколота, чтобы повредить и обеспечить эффективную систему прививки в растении черного перца. Затем гранулы Mycelial покрыли три отверстия, чтобы сохранить влагу и позволить патогену хорошо заразить растение. После прививки листья пожелтели и у...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar powder	Solarbio	A8190
Clean bench	Haier
Dextrose	Xilong Scientific	15700501
High temperature sterilizing oven	Zaelway
Petri dish plates	Biosharp	BS-90-D