Generación de organoides del corazón humano autoensamblables derivados de células madre pluripotentes

Resumen

Aquí, describimos un protocolo para crear organoides cardíacos humanos (hHO) relevantes para el desarrollo de manera eficiente utilizando células madre pluripotentes humanas por autoorganización. El protocolo se basa en la activación secuencial de señales de desarrollo y produce tejidos cardíacos humanos altamente complejos y funcionalmente relevantes.

Resumen

La capacidad de estudiar el desarrollo cardíaco humano en la salud y la enfermedad está muy limitada por la capacidad de modelar la complejidad del corazón humano in vitro. El desarrollo de plataformas similares a órganos más eficientes que puedan modelar fenotipos complejos in vivo , como organoides y órganos en un chip, mejorará la capacidad de estudiar el desarrollo y la enfermedad del corazón humano. Este artículo describe un protocolo para generar organoides cardíacos humanos (hHO) altamente complejos mediante la autoorganización utilizando células madre pluripotentes humanas y la activación gradual de la vía de desarrollo utilizando inhibidores de moléculas pequeñas. Los cuerpos embrionarios (EB) se generan en una placa de 96 pocillos con pocillos de fijación ultra bajos de fondo redondo, lo que facilita el cultivo en suspensión de construcciones individualizadas.

Los EB se diferencian en hHO mediante una estrategia de modulación de señalización Wnt de tres pasos, que implica una activación inicial de la vía Wnt para inducir el destino del mesodermo cardíaco, un segundo paso de inhibición Wnt para crear linajes cardíacos definitivos y un tercer paso de activación Wnt para inducir tejidos de órganos proepicárdicos. Estos pasos, llevados a cabo en un formato de 96 pocillos, son altamente eficientes, reproducibles y producen grandes cantidades de organoides por tirada. El análisis por imágenes de inmunofluorescencia del día 3 al día 11 de la diferenciación revela especificaciones del primer y segundo campo cardíaco y tejidos altamente complejos dentro de hHOs en el día 15, incluido el tejido miocárdico con regiones de cardiomiocitos auriculares y ventriculares, así como cámaras internas revestidas con tejido endocárdico. Los organoides también exhiben una intrincada red vascular en toda la estructura y un revestimiento externo de tejido epicárdico. Desde un punto de vista funcional, los hHO superan con fuerza y presentan una actividad normal del calcio según lo determinado por las imágenes en vivo de Fluo-4. En general, este protocolo constituye una plataforma sólida para estudios in vitro en tejidos cardíacos similares a órganos humanos.

Introducción

Los defectos cardíacos congénitos (CHD) son el tipo más común de defecto congénito en los seres humanos y afectan aproximadamente al 1% de todos los nacidos ^vivos1,2,3. En la mayoría de las circunstancias, las razones de los CHD siguen siendo desconocidas. La capacidad de crear modelos de corazón humano en el laboratorio que se asemejan mucho al corazón humano en desarrollo constituye un importante paso adelante para estudiar directamente las causas subyacentes de las enfermedades coronarias en humanos en lugar de en modelos animales sustitutos.

El epítome de los modelos de tejido cultivados en laboratorio son organoides, construcciones de células 3D que se asemejan a un órgano de interés en la composición celular y la función fisiológica. Los organoides a menudo se derivan de células madre o células progenitoras y se han utilizado con éxito para modelar muchos órganos como el ^cerebro4,5, el ^riñón6,7, el ^intestino8,9, el ^pulmón10,11, el ^hígado12,13 y el ^{páncreas14,15} , solo por nombrar algunos. Han surgido estudios recientes que demuestran la viabilidad de crear organoides cardíacos autoensamblables para estudiar el desarrollo del corazón in vitro. Estos modelos incluyen el uso de células madre embrionarias de ratón (mESCs) para modelar el desarrollo cardíaco ^{temprano16,17} hasta la especificación auriculoventricular18 y células madre pluripotentes humanas (hPSCs) para generar organoides cardíaco-endodermo de capa multigermes19 y cardioides con ^cámara20 con composición celular altamente compleja.

Este artículo presenta un novedoso protocolo de modulación WNT de 3 pasos para generar hHO altamente complejos de una manera eficiente y rentable. Los organoides se generan en placas de 96 pocillos, lo que resulta en un sistema escalable y de alto rendimiento que se puede automatizar fácilmente. Este método se basa en la creación de agregados de hPSC y desencadena los pasos de desarrollo de la cardiogénesis, incluida la formación de mesodermo y mesodermo cardíaco, la especificación del primer y segundo campo cardíaco, la formación de órganos proepicárdicos y la especificación auriculoventricular. Después de 15 días de diferenciación, los hHO contienen todos los linajes celulares principales que se encuentran en el corazón, cámaras internas bien definidas, cámaras auriculares y ventriculares, y una red vascular en todo el organoide. Este sistema organoide cardíaco altamente sofisticado y reproducible es susceptible de investigar análisis estructurales, funcionales, moleculares y transcriptómicos en el estudio del desarrollo cardíaco y las enfermedades, y la detección farmacológica.

Protocolo

1. Cultura y mantenimiento de hPSC

NOTA: Las PSC inducidas por humanos (hiPSC) o las células madre embrionarias humanas (hESC) deben cultivarse durante al menos 2 pasajes consecutivos después de la descongelación antes de ser utilizadas para generar EB para la diferenciación o la criopreservación adicional. Las hPSC se cultivan en medio PSC (consulte la Tabla de materiales) en placas de cultivo de 6 pocillos recubiertas de matriz extracelular de membrana basal (BM-ECM). Al realizar cambios de medio en hPSCs en placas de 6 pocillos, agregue el medio directamente al lado interno del pozo en lugar de directamente en la parte superior de las células para evitar el desprendimiento o estrés celular no deseado. Los usuarios deben tener cuidado con los medios PSC precalentados que no deben calentarse a 37 ° C; todos los medios PSC utilizados en este protocolo eran termoestables.

1. Para recubrir las placas de pozo con el BM-ECM, descongele una alícuota del BM-ECM (almacenada a -20 °C según las instrucciones del fabricante) en hielo y mezcle 0,5 mg del BM-ECM con 12 ml de medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)/medio F12 (almacenado a 4 °C). Distribuya 2 ml de la mezcla DMEM/F12-BM-ECM en cada pocillo de una placa de 6 pocillos e incube a 37 °C durante al menos 2 h.
2. Para descongelar las células, primero, descongele el criovial hPSC en una cuenta de 37 ° C o baño de agua durante 1-2 minutos hasta que solo se vea una pequeña cantidad de hielo. Transfiera las células descongeladas a un tubo de centrífuga y agregue lentamente 8-9 ml del medio PSC complementado con 2 μM del inhibidor de ROCK, tiazovivina (Thiaz) y centrífuga a 300 × g durante 5 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en el medio PSC suplementado con 2 μM de Thiaz. Distribuya las células en el medio de cultivo en 1-2 pocillos dependiendo de la concentración de células crioviales y el cultivo a 37 °C, 5% de _CO2 durante 24 h antes de cambiar el medio PSC.
3. Cambie el medio en las celdas a intervalos de 48 h. Realice lavados y cambios de medio utilizando DMEM/F12 (1 mL/pozo) y el medio PSC (2 mL/pozo), respectivamente.
   NOTA: Los lavados ayudan a eliminar los desechos celulares y los desechos, mientras que los cambios en los medios frescos proporcionan a las células una fuente renovada de nutrientes.
4. Pasar las células en la subconfluencia (60-80% confluente) aspirando el medio, luego lavar cada pozo con 1 ml de 1 solución tamponada con fosfato de Dulbecco (sin calcio, sin magnesio; DPBS). Aspire el DPBS y agregue 1 ml del reactivo de disociación para hPSC (consulte la Tabla de materiales), seguido de la aspiración de todos menos una película delgada del reactivo después de 10 s.
5. Incubar durante 2-5 min con la película delgada del reactivo de disociación para hPSCs hasta que se formen huecos entre las células.
   NOTA: El tiempo para detener la disociación depende de la línea celular.
6. Agregue 1 ml del medio PSC suplementado con 2 μM de Thiaz (medio PSC + Thiaz) al pozo y golpee suavemente la placa para inducir el desprendimiento celular. Pipetear las células desprendidas en el medio 1-2 veces para romper cualquier colonia grande, y resuspendir las células en el medio PSC + Thiaz en una proporción de 1: 6 pocillos (células de 1 pozo resuspendido en 12 ml de medio de cultivo). Reponga las células en los pozos recubiertos de BM-ECM.

2. Generación de organoides cardíacos humanos autoensamblables en 3D

1. Formación del cuerpo embrioide (EB):
   NOTA: Es imperativo limitar las células diferenciadas observables antes de la formación del cuerpo embrionario. Dos o tres pocillos de una placa de 6 pocillos con una confluencia del 60-80% producirán suficientes células para una sola placa de organoides de 96 pocillos. Todos los medios deben alicitarse y calentarse en un baño de agua o cuenta de 37 ° C antes de cualquier cambio de medio para minimizar el choque de temperatura en los EB u organoides (esto no incluye los reactivos de disociación celular). Véase la Figura 1A,B.
   1. Día -2
      1. Para crear EB, en el día -2, lave las hPSC subconfluentes (60-80% confluentes) con DPBS durante al menos 10 s para lavar cualquier residuo celular y aspirar el DPBS.
      2. Para separar las células y liberarlas en un estado de una sola celda, agregue 1 ml de reactivo de disociación celular a temperatura ambiente (consulte la Tabla de materiales) a cada pozo durante 3-6 min. Golpee suavemente la placa ~ 5 veces cada minuto para inducir el desprendimiento mientras revisa bajo el microscopio. Agregue 1 ml de medio PSC + Thiaz para detener la reacción.
      3. Para recolectar las células y romper los agregados restantes, pipetee los medios hacia arriba y hacia abajo en el pozo 2-3 veces para generar una suspensión de una sola célula. Transfiera la suspensión unicelular a un tubo de centrífuga y gire durante 5 min a 300 × g.
      4. Para obtener la concentración celular deseada, deseche el sobrenadante y resuspenda las células en 1 ml de medio PSC +Thiaz. Cuente las células usando un contador celular o hemocitómetro y diluya las células en medio PSC + Thiaz a una concentración de 100,000 células / ml.
      5. Para distribuir las células para la formación de EB, use una pipeta multicanal para agregar 100 μL (10,000 celdas) a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fijación ultra baja de fondo redondo. Centrifugar la placa a 100 × g durante 3 min e incubar durante 24 h a 37 °C, 5% _CO2.
   2. Día -1
      1. Retire cuidadosamente 50 μL de medio de cada pozo y agregue 200 μL de medio PSC fresco calentado a 37 ° C para lograr un volumen final de 250 μL por pozo. Incubar las células durante 24 h a 37 °C, 5% _CO2.
         NOTA: Retire y agregue el medio con cuidado en el costado del pozo para evitar molestar a los EB en el fondo del pozo. Debido a la naturaleza delicada de los EB y el cultivo de suspensión, es necesario dejar un pequeño volumen de líquido en cada pozo al cambiar el medio para evitar molestar a los EB.
2. Diferenciación de organoides del corazón humano (hHO):
   NOTA: Todos los medios deben calentarse en un baño de agua o cuenta de 37 ° C antes de cualquier cambio de medio. Retire y agregue el medio con cuidado en el costado del pozo para evitar perturbar los organoides en desarrollo en el fondo del pozo. No se necesitan lavados entre los cambios de medios para minimizar la agitación y permitir la eliminación gradual de inhibidores y factores de crecimiento. Se utilizó RPMI con suplemento de B-27 al 2% (Tabla de Materiales) durante todo el protocolo de diferenciación. El suplemento de B-27 contiene insulina a menos que se especifique (sin insulina en los días 0-5). Ver Figura 1C.
   1. Día 0
      1. Para iniciar la diferenciación hacia un linaje mesodermo, retire 166 μL de medio de cada pozo (~2/3 ^del volumen total del pozo) y agregue 166 μL de RPMI 1640 que contenga suplemento de B-27 sin insulina, 6 μM CHIR99021, 1.875 ng/mL de proteína morfogenética ósea 4 (BMP4) y 1.5 ng/mL de Activina A para una concentración final de pozo de 4 μM CHIR99021, 1,25 ng/mL BMP4, y 1 ng/mL de Activina A. Incubar durante 24 h a 37 °C, 5% _co2.
   2. Día 1
      1. Retire 166 μL de medio de cada pocillo y agregue 166 μL de RPMI 1640 fresco con suplemento de B-27 sin insulina. Incubar durante 24 h a 37 °C, 5% _CO2.
   3. Día 2
      1. Para inducir la especificación del mesodermo cardíaco, retire 166 μL de medio de cada pocillo y agregue 166 μL de RPMI 1640 que contenga un suplemento de B-27 sin insulina y 3 μM Wnt-C59 para una concentración final de pozo de 2 μM Wnt-C59. Incubar durante 48 h a 37 °C, 5% de _CO2.
   4. Día 4
      1. Retire 166 μL de medio de cada pocillo y agregue 166 μL de RPMI 1640 fresco con suplemento de B-27 sin insulina. Incubar durante 48 h a 37 °C, 5% _CO2.
   5. Día 6
      1. Retire 166 μL de medio de cada pocillo y agregue 166 μL de RPMI 1640 con suplemento de B-27. Incubar durante 24 h a 37 °C, 5% _CO2.
   6. Día 7
      1. Para inducir la diferenciación proepicárdica, retire 166 μL de medio de cada pocillo y agregue 166 μL de RPMI 1640 fresco que contenga suplemento de B-27 y 3 μM de CHIR99021 para una concentración final de pozo de 2 μM de CHIR99021. Incubar durante 1 h a 37 °C, 5% _CO2.
      2. Retire 166 μL de medio de cada pocillo y agregue 166 μL de suplemento fresco de RPMI 1640 que contenga B-27. Incubar durante 48 h a 37 °C, 5% _CO2.
         NOTA: Se recomienda precaución adicional en este segundo cambio medio en el día 7, ya que los organoides son más propensos al movimiento debido a los cambios en los medios.
      3. Desde el día 7 en adelante hasta la recolección o transferencia para análisis o experimentación, realizar cambios de medio cada 48 h retirando 166 μL de medio de cada pozo y agregar 166 μL de RPMI 1640 fresco que contenga suplemento de B-27.
         NOTA: Los organoides están listos para análisis y experimentación en el día 15, a menos que las etapas de desarrollo más tempranas sean de interés. Se pueden cultivar más allá del día 15 para cultivos a largo plazo o experimentos de maduración.

3. Análisis organoide

1. Transferencia de organoides enteros (vivos o fijos)
   NOTA: Para la transferencia de organoides vivos, asegúrese de que las puntas de pipeta utilizadas sean estériles.
   1. Corte la punta de una punta de pipeta P200 de 5-10 mm de la abertura de la punta, lo que resulta en una abertura ancha de ~ 2-3 mm de diámetro.
   2. Inserte la punta directamente en el pozo de fondo redondo que contiene el organoide para que la pipeta sea completamente vertical (perpendicular a la placa). Asegúrese de que el émbolo de pipeta ya esté presionado todo el camino antes de insertar la punta en el medio.
   3. Suelte lentamente el émbolo de pipeta, ocupando suficiente medio (100-200 μL) para recoger el organoide.
   4. Transfiera el organoide en el medio al destino objetivo (por ejemplo, para fijación, imágenes en vivo, registro de electrofisiología, nuevo cultivo de placas).
2. Fijación de organoides
   NOTA: La fijación y tinción de organoides se puede hacer en la placa de cultivo de 96 pocillos o en los tubos de la microcentrífuga. El paraformaldehído (PFA) debe manipularse solo en una campana extractora de humos.
   1. Para la fijación en tubos de microcentrífuga, transfiera organoides vivos a tubos separados con 1-8 organoides por tubo.
      NOTA: No exceda de 8 organoides por tubo.
   2. Retire con cuidado y deseche la mayor cantidad posible de medio del tubo sin tocar los organoides.
   3. Agregue 4% de PFA a cada tubo o pozo (300-400 μL por tubo de microcentrífuga y 100-200 μL por pocillo de una placa de 96 pocillos). Incubar a temperatura ambiente durante 30-45 min.
      NOTA: Los tiempos de incubación superiores a 1 h pueden requerir pasos de recuperación de antígenos y no se recomiendan.
   4. Deseche de forma segura el PFA sin perturbar los organoides. Realizar 3 lavados con DPBS suplementados con 1,5 g/L de glicina (DPBS/Gly), utilizando el mismo volumen utilizado para el 4% de PFA, esperando 5 min entre lavados. Retire DPBS/Gly y proceda a la inmunotinción u otros análisis o agregue DPBS y guárdelo a 4 °C para su uso futuro durante un máximo de 2 semanas.
      NOTA: Almacenar organoides fijos por más de 2 semanas puede resultar en degradación y contaminación de los tejidos y no se recomienda.
3. Tinción inmunofluorescente de montaje completo
   1. Añadir 100 μL de solución de bloqueo/permeabilización (10% de suero normal de burro + 0,5% de albúmina sérica bovina (BSA) + 0,5% de Tritón X-100 en 1x DPBS) a cada pocillo o tubo que contenga los organoides fijos. Incubar a temperatura ambiente durante la noche en una coctelera.
      NOTA: No exceda de 8 organoides por tubo.
   2. Retire con cuidado y deseche la mayor cantidad posible de la solución de bloqueo sin tocar los organoides. Realice 3 lavados con DPBS, esperando 5 minutos entre lavados.
   3. Preparar la solución primaria de anticuerpos (1% de suero normal de burro + 0,5% de BSA + 0,5% de Tritón X-100 en 1x DPBS) con los anticuerpos primarios deseados a las concentraciones recomendadas. Incubar a 4 °C durante 24 h en una coctelera.
   4. Retire con cuidado y deseche la mayor cantidad posible de la solución de anticuerpos sin tocar los organoides. Realice 3 lavados con DPBS, esperando 5 minutos entre lavados.
   5. Preparar una solución secundaria de anticuerpos (1% de suero normal de burro + 0,5% de BSA + 0,5% de Tritón X-100 en 1x DPBS) con los anticuerpos secundarios deseados a las concentraciones recomendadas. Si los anticuerpos están marcados fluorescentemente, incube a 4 °C en la oscuridad (por ejemplo, cubierto de papel de aluminio) durante 24 horas en un agitador.
   6. Retire con cuidado y deseche la mayor cantidad posible de la solución de anticuerpos sin tocar los organoides. Realice 3 lavados con DPBS, esperando 5 minutos entre lavados.
   7. Prepare diapositivas con perlas (90-300 μm de diámetro) montadas en un medio de montaje (consulte la Tabla de materiales) cerca de los bordes de la diapositiva donde se colocará el deslizamiento con los organoides.
      NOTA: Se recomienda permitir que el medio de montaje alrededor de las perlas se seque antes de continuar; esto evitará que las cuentas se muevan. Ver Figura 2.
   8. Transfiera los organoides teñidos usando una punta de pipeta cortada a la diapositiva, entre las cuentas, asegurando el espaciado para evitar el contacto entre los organoides una vez en la diapositiva. Use la esquina de una toallita de laboratorio enrollada para eliminar cuidadosamente el exceso de líquido alrededor del organoide.
   9. Cubra los organoides con medio de montaje-limpieza (la solución de limpieza de fructosa-glicerol es de 60% (vol/vol) de glicerol y 2,5 M de fructosa)³⁷ utilizando 120-150 μL del medio de montaje-limpieza por portaobjetos.
      NOTA: Se recomienda utilizar una punta de pipeta cortada cuando se trabaje con el medio de montaje-limpieza, ya que es muy viscoso.
   10. Coloque el cubrehojas sobre la diapositiva con los organoides cubiertos con una solución de montaje-despeje y presione lentamente el deslizamiento sobre la diapositiva, asegurándose de que los organoides estén entre las cuentas montadas.
   11. Selle el perímetro de la cubierta en la corredera con barniz de uñas de capa superior. Deje que el tobogán se seque en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1 h. Conservar a 4 °C en la oscuridad para su almacenamiento a largo plazo.
4. Imágenes transitorias de calcio en organoides del corazón vivo
   NOTA: De acuerdo con las instrucciones del fabricante, Fluo4-AM se reconstituyó en dimetilsulfóxido (DMSO) a una concentración final de solución madre de 0,5 mM. Fluo4-AM se agregó directamente al pozo organoide en la placa de 96 pocillos.
   1. Realice 2 lavados en los organoides utilizando el medio RPMI 1640.
      1. Retire 166 μL del medio gastado del pozo.
      2. Agregue 166 μL de medio RPMI 1640 calentado, retire 166 μL de medio y agregue 166 μL de medio RPMI 1640 fresco.
         NOTA: Los lavados se realizan para eliminar el material de desecho y los desechos celulares. Dos tercios del medio se retiran de los pocillos durante los lavados para evitar perturbar los organoides en el fondo del pozo antes del ensayo funcional.
   2. Agregue el medio Fluo4-AM a los organoides.
      1. Agregue Fluo4-AM reconstituido en DMSO a RPMI 1640 que contiene suplemento de B-27 para preparar una solución de 1,5 μM.
      2. Retire 166 μL de medio del pozo.
      3. Añadir 166 μL de 1,5 μM De Fluo4-AM en el suplemento DE RPMI 1640 que contiene B-27 para una concentración final de pozo de 1 μM. Incubar a 37 °C, 5% de _CO2 durante 30 min.
   3. Realice 2 lavados como en el paso 3.4.1.
   4. Agregue 166 μL de RPMI 1640 que contiene suplemento de B-27 al pozo.
   5. Usando una punta cortada de una punta de pipeta P200, transfiera el organoide a una placa de Petri con fondo de vidrio (por ejemplo, vidrio de cubierta con cámara de 8 pocillos con vidrio de cubierta de alto rendimiento # 1.5) con 100-200 μL de medio.
      NOTA: Ver sección 3.1 sobre la transferencia de organoides enteros.
   6. Imagen de los organoides que viven bajo un microscopio con una cámara controlada por temperatura y _CO2 a 37 ° C, 5% de _CO2.
   7. Grabe varios videos de 10-20 s en varios lugares del organoide, mostrando el aumento y la disminución de los niveles de intensidad de fluorescencia a medida que el calcio entra y sale de las células.
      NOTA: Para grabaciones de alta resolución, se recomienda grabar a una velocidad de 10 fps o más rápida; Se recomiendan 50 fps.
   8. Analice los videos utilizando un software de análisis de imágenes (por ejemplo, ImageJ) seleccionando regiones de interés y midiendo los niveles de intensidad a lo largo del tiempo.
   9. Normalice las grabaciones de intensidad usando ΔF/_F0 vs. tiempo en milisegundos y gráfico.

Resultados

Para lograr la hHO autoorganizada in vitro, modificamos y combinamos los protocolos de diferenciación previamente descritos para la diferenciación monocapa 2D de ^{cardiomiocitos21} y células epicárdicas22 utilizando moduladores de la vía Wnt y para organoides precardíacos ^3D16 utilizando los factores de crecimiento BMP4 y Activina A. Utilizando el protocolo de diferenciación EB y hHO de placa de 96 pocillos descrito aquí y mostrado en ...

Discusión

Los recientes avances en cardiomiocitos derivados de células madre humanas y otras células de origen cardíaco se han utilizado para modelar el desarrollo del corazón ^{humano22,24,25} y la ^{enfermedad26,27,28} y como herramientas para detectar ^{terapias29,30} y agentes

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Alexa Fluor 488 Donkey anti- mouse	Invitrogen	A-21202	1:200
Alexa Fluor 488 Donkey anti- rabbit	Invitrogen	A-21206	1:200
Alexa Fluor 594 Donkey anti- mouse	Invitrogen	A-21203	1:200
Alexa Fluor 594 Donkey anti- rabbit	Invitrogen	A-21207	1:200
Alexa Fluor 647 Donkey anti- goat	Invitrogen	A32849	1:200
HAND1	Abcam	ab196622	Rabbit; 1:200
HAND2	Abcam	ab200040	Rabbit; 1:200
NFAT2	Abcam	ab25916	Rabbit; 1:100
PECAM1	DSHB	P2B1	Rabbit; 1:50
TNNT2	Abcam	ab8295	Mouse; 1:200
THY1	Abcam	ab133350	Rabbit; 1:200
TJP1	Invitrogen	PA5-19090	Goat; 1:250
VIM	Abcam	ab11256	Goat; 1:250
WT1	Abcam	ab89901	Rabbit; 1:200
Media and Reagents
Accutase	Innovative Cell Technologies	NC9464543	cell dissociation reagent
Activin A	R&D Systems	338AC010
B-27 Supplement (Minus Insulin)	Gibco	A1895601	insulin-free cell culture supplement
B-27 Supplement	Gibco	17504-044	cell culture supplement
BMP-4	Gibco	PHC9534
Bovine Serum Albumin	Bioworld	50253966
CHIR-99021	Selleck	442310
D-(-)-Fructose	Millipore Sigma	F0127
DAPI	Thermo Scientific	62248	1:1000
Dimethyl Sulfoxide	Millipore Sigma	D2650
DMEM/F12	Gibco	10566016
Essential 8 Flex Medium Kit	Gibco	A2858501	pluripotent stem cell (PSC) medium containing 1% penicillin-streptomycin
Fluo4-AM	Invitrogen	F14201
Glycerol	Millipore Sigma	G5516
Glycine	Millipore Sigma	410225
Matrigel GFR	Corning	CB40230	Basement membrane extracellular matrix (BM-ECM)
Normal Donkey Serum	Millipore Sigma	S30-100mL
Paraformaldehyde	MP Biomedicals	IC15014601	Powder dissolved in PBS Buffer – use at 4%
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate Buffer Solution	Gibco	10010049
Phosphate Buffer Solution (10x)	Gibco	70011044
Polybead Microspheres	Polysciences, Inc.	73155	90 µm
ReLeSR	Stem Cell Technologies	NC0729236	dissociation reagent for hPSCs
RPMI 1640	Gibco	11875093
Thiazovivin	Millipore Sigma	SML1045
Triton X-100	Millipore Sigma	T8787
Trypan Blue Solution	Gibco	1525006
VECTASHIELD Vibrance Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H170010
WNT-C59	Selleck	NC0710557
Other
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	02682002
15 mL Falcon Tubes	Fisher Scientific	1495970C
2 mL Cryogenic Vials	Corning	13-700-500
50 mL Reagent Reservoirs	Fisherbrand	13681502
6-Well Flat Bottom Cell Culture Plates	Corning	0720083
8 Well chambered cover Glass with #1.5 high performance cover glass	Cellvis	C8-1.5H-N
96-well Clear Ultra Low Attachment Microplates	Costar	07201680
ImageJ	NIH		Image processing software
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	06-666	laboratory wipes
Micro Cover Glass	VWR	48393-241	24 x 50 mm No. 1.5
Microscope Slides	Fisherbrand	1255015
Moxi Cell Counter	Orflo Technologies	MXZ001
Moxi Z Cell Count Cassette – Type M	Orflo Technologies	MXC001
Multichannel Pipettes	Fisherbrand	FBE1200300	30-300 µL
Olympus cellVivo	Olympus		For Caclium Imaging, analysis with Imagej
Sorvall Legend X1 Centrifuge	ThermoFisher Scientific	75004261
Thermal Mixer	ThermoFisher Scientific	13-687-717
Top Coat Nail Varish	Seche Vite		Can purchase from any supermarket