Erzeugung von selbstorganisierenden menschlichen Herzorganoiden aus pluripotenten Stammzellen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur effizienten Herstellung entwicklungsrelevanter menschlicher Herzorganoide (hHOs) unter Verwendung menschlicher pluripotenter Stammzellen durch Selbstorganisation. Das Protokoll beruht auf der sequentiellen Aktivierung von Entwicklungshinweisen und produziert hochkomplexes, funktionell relevantes menschliches Herzgewebe.

Zusammenfassung

Die Fähigkeit, die menschliche Herzentwicklung in Gesundheit und Krankheit zu untersuchen, ist durch die Fähigkeit, die Komplexität des menschlichen Herzens in vitro zu modellieren, stark eingeschränkt. Die Entwicklung effizienterer organähnlicher Plattformen, die komplexe In-vivo-Phänotypen wie Organoide und Organe auf einem Chip modellieren können, wird die Fähigkeit verbessern, die Entwicklung und Erkrankung des menschlichen Herzens zu untersuchen. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung hochkomplexer menschlicher Herzorganoide (hHOs) durch Selbstorganisation unter Verwendung menschlicher pluripotenter Stammzellen und schrittweise Aktivierung des Entwicklungsweges unter Verwendung von niedermolekularen Inhibitoren. Embryoide Körper (EBs) werden in einer 96-Well-Platte mit runden, extrem niedrigen Befestigungstöpfen erzeugt, was die Suspensionskultur individualisierter Konstrukte erleichtert.

Die EBs werden durch eine dreistufige Wnt-Signalmodulationsstrategie in hHOs differenziert, die eine anfängliche Wnt-Signalwegaktivierung zur Induktion des kardialen Mesodermenschicksals, einen zweiten Schritt der Wnt-Hemmung zur Schaffung definitiver Herzlinien und einen dritten Wnt-Aktivierungsschritt zur Induktion von Proepikardorgangewebe beinhaltet. Diese Schritte, die in einem 96-Well-Format durchgeführt werden, sind hocheffizient, reproduzierbar und produzieren große Mengen an Organoiden pro Lauf. Die Analyse mittels Immunfluoreszenzbildgebung von Tag 3 bis Tag 11 der Differenzierung zeigt erste und zweite Herzfeldspezifikationen und hochkomplexe Gewebe in hHOs an Tag 15, einschließlich Myokardgewebe mit Regionen von atrialen und ventrikulären Kardiomyozyten sowie interne Kammern, die mit Endokardgewebe ausgekleidet sind. Die Organoide weisen auch ein kompliziertes vaskuläres Netzwerk in der gesamten Struktur und eine äußere Auskleidung des epikarden Gewebes auf. Aus funktioneller Sicht schlagen hHOs robust und weisen eine normale Kalziumaktivität auf, wie sie durch Fluo-4-Live-Imaging bestimmt wird. Insgesamt stellt dieses Protokoll eine solide Plattform für In-vitro-Studien in menschlichen organähnlichen Herzgeweben dar.

Einleitung

Angeborene Herzfehler (KHK) sind die häufigste Art von angeborenen Defekten beim Menschen und betreffen etwa 1% aller Lebendgeburten1,2,3. Unter den meisten Umständen bleiben die Gründe für KHK unbekannt. Die Fähigkeit, menschliche Herzmodelle im Labor zu erstellen, die dem sich entwickelnden menschlichen Herzen sehr ähnlich sind, stellt einen bedeutenden Schritt nach vorne dar, um die zugrunde liegenden Ursachen von KHK beim Menschen und nicht in Leihtiermodellen direkt zu untersuchen.

Der Inbegriff von im Labor gezüchteten Gewebemodellen sind Organoide, 3D-Zellkonstrukte, die einem Organ ähneln, das für die Zellzusammensetzung und physiologische Funktion von Interesse ist. Organoide werden oft aus Stammzellen oder Vorläuferzellen gewonnen und wurden erfolgreich verwendet, um viele Organe wie ^Gehirn4,5, ^Niere6,7, ^Darm8,9, ^Lunge10,11, ^Leber12,13 und Bauchspeicheldrüse ^{zu modellieren14,15} , um nur einige zu nennen. Jüngste Studien haben die Machbarkeit der Herstellung von selbstorganisierenden Herzorganoiden zur Untersuchung der Herzentwicklung in vitro gezeigt. Diese Modelle umfassen die Verwendung von embryonalen Stammzellen der Maus (mESCs) zur Modellierung der frühen ^{Herzentwicklung16,17} bis zur atrioventrikulären ^{Spezifikation18} und humaner pluripotenter Stammzellen (hPS-Zellen) zur Erzeugung von Multikeimschicht-Herz-Endoderm-Organoiden19 und Kammernnieren20 mit hochkomplexer zellulärer Zusammensetzung.

Dieser Beitrag stellt ein neuartiges 3-stufiges WNT-Modulationsprotokoll vor, um hochkomplexe hHOs effizient und kostengünstig zu erzeugen. Organoide werden in 96-Well-Platten erzeugt, was zu einem skalierbaren Hochdurchsatzsystem führt, das leicht automatisiert werden kann. Diese Methode beruht auf der Erstellung von hPSC-Aggregaten und der Auslösung von Entwicklungsschritten der Kardiogenese, einschließlich der Mesoderm- und Herzmesodermbildung, der ersten und zweiten Herzfeldspezifikation, der Proepikardorganbildung und der atrioventrikulären Spezifikation. Nach 15 Tagen der Differenzierung enthalten hHOs alle wichtigen Zelllinien im Herzen, gut definierte innere Kammern, vorhofische und ventrikuläre Kammern und ein vaskuläres Netzwerk im gesamten Organoid. Dieses hochentwickelte und reproduzierbare Herzorganoidsystem ist für die Untersuchung struktureller, funktioneller, molekularer und transkriptomischer Analysen bei der Untersuchung der Herzentwicklung und von Krankheiten sowie des pharmakologischen Screenings geeignet.

Protokoll

1. hPSC-Kultur und -Wartung

HINWEIS: Die humanen induzierten PSCs (hiPS-Zellen) oder humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) müssen nach dem Auftauen für mindestens 2 aufeinanderfolgende Passagen kultiviert werden, bevor sie zur Erzeugung von EBs zur Differenzierung oder weiteren Kryokonservierung verwendet werden. hPS-Zellen werden in PSC-Medium (siehe Materialtabelle) auf Basalmembran-extrazellulären Matrix (BM-ECM)-beschichteten 6-Well-Kulturplatten kultiviert. Wenn Sie Mediumwechsel an hPSCs in 6-Well-Platten durchführen, fügen Sie das Medium direkt auf der Innenseite des Wells hinzu und nicht direkt auf den Zellen, um unerwünschte Zellablösung oder Stress zu verhindern. Benutzer sollten sich vor der Vorwärmung von PSC-Medien hüten, die nicht bei 37 ° C erwärmt werden sollten. Alle in diesem Protokoll verwendeten PSC-Medien waren thermostabil.

1. Um die Well-Platten mit dem BM-ECM zu beschichten, tauen Sie einen Aliquot des BM-ECM (gemäß Herstellerangaben bei -20 °C gelagert) auf Eis auf und mischen Sie 0,5 mg des BM-ECM mit 12 ml kaltem Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium (DMEM)/F12 Medium (gelagert bei 4 °C). Verteilen Sie 2 ml des DMEM/F12-BM-ECM-Gemisches auf jede Vertiefung einer 6-Well-Platte und inkubieren Sie bei 37 °C für mindestens 2 h.
2. Um die Zellen aufzutauen, tauen Sie zunächst das hPSC-Kryovial in einem 37 °C warmen Perlen- oder Wasserbad für 1-2 min auf, bis nur noch eine geringe Menge Eis sichtbar ist. Übertragen Sie die aufgetauten Zellen in ein Zentrifugenröhrchen und geben Sie langsam 8-9 ml des PSC-Mediums hinzu, das mit 2 μM des ROCK-Inhibitors Thiazovivin (Thiaz) ergänzt wird, und zentrifugieren Sie bei 300 × g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet im PSC-Medium, das mit 2 μM Thiaz ergänzt wird. Verteilen Sie die Zellen im Kulturmedium in 1-2 Vertiefungen in Abhängigkeit von der kryovialen Zellkonzentration und Kultur bei 37 °C, 5% _CO2 für 24 h, bevor das PSC-Medium gewechselt wird.
3. Wechseln Sie das Medium auf den Zellen in 48-Stunden-Intervallen. Führen Sie Waschungen und Mediumwechsel mit DMEM/F12 (1 ml/Well) bzw. dem PSC-Medium (2 ml/Well) durch.
   HINWEIS: Waschungen helfen, Zellabfälle und -ablagerungen zu entfernen, während frische Medienwechsel die Zellen mit einer erneuerten Nährstoffquelle versorgen.
4. Passieren Sie die Zellen bei Unterfluenz (60-80% Konfluent) durch Absaugen des Mediums und waschen Sie dann jede Vertiefung mit 1 ml 1x Dulbecco's phosphatgepufferter Lösung (kein Kalzium, kein Magnesium; DPBS). Aspirieren Sie das DPBS und geben Sie 1 ml des Dissoziationsreagenzes für hPS-Zellen hinzu (siehe Tabelle der Materialien), gefolgt von der Aspiration aller bis auf einen dünnen Film des Reagenzes nach 10 s.
5. 2-5 min mit dem dünnen Film des Dissoziationsreagenzes für hPS-Zellen inkubieren, bis sich Lücken zwischen den Zellen bilden.
   HINWEIS: Der Zeitpunkt, um die Dissoziation zu stoppen, ist zelllinienabhängig.
6. 1 ml des PSC-Mediums, ergänzt mit 2 μM Thiaz (PSC-Medium + Thiaz), in die Vertiefung geben und vorsichtig auf die Platte klopfen, um eine Zellablösung zu induzieren. Pipettieren Sie die abgelösten Zellen im Medium 1-2 mal, um große Kolonien aufzubrechen, und resuspenieren Sie die Zellen in PSC-Medium + Thiaz in einem 1: 6-Well-Verhältnis (Zellen aus 1 Well resuspendiert in 12 ml Kulturmedium). Replatieren Sie die Zellen auf BM-ECM-beschichteten Vertiefungen.

2. Erzeugung von 3D-selbstorganisierenden menschlichen Herzorganoiden

1. Embryoide Körperbildung (EB):
   HINWEIS: Es ist unerlässlich, beobachtbare differenzierte Zellen vor der embryonalen Körperbildung zu begrenzen. Zwei bis drei Vertiefungen einer 6-Well-Platte mit einer Konfluenz von 60-80% ergeben genügend Zellen für eine einzelne 96-Well-Platte mit Organoiden. Alle Medien sollten aliquotediert und in einem 37 °C-Perlen- oder Wasserbad erwärmt werden, bevor sich das Medium ändert, um den Temperaturschock auf die EBs oder Organoide zu minimieren (dies gilt nicht für Zelldissoziationsreagenzienz). Siehe Abbildung 1A,b.
   1. Tag -2
      1. Um EBs zu erzeugen, waschen Sie am Tag -2 subkonfluente hPSCs (60-80% konfluent) mindestens 10 s lang mit DPBS, um Zellabfälle zu waschen und das DPBS abzusaugen.
      2. Um die Zellen zu lösen und in einen Einzelzellzustand zu entlassen, geben Sie 1 ml Zelldissoziationsreagenz bei Raumtemperatur (siehe Materialtabelle) für 3-6 min in jede Vertiefung. Klopfen Sie vorsichtig ~ 5 Mal pro Minute auf die Platte, um eine Ablösung zu induzieren, während Sie unter dem Mikroskop nachsehen. Fügen Sie 1 ml PSC-Medium + Thiaz hinzu, um die Reaktion zu stoppen.
      3. Um die Zellen zu sammeln und alle verbleibenden Aggregate aufzubrechen, pipettieren Sie das Medium 2-3 Mal in der Vertiefung auf und ab, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen. Die Einzelzellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen geben und 5 min bei 300 × g drehen.
      4. Um die gewünschte Zellkonzentration zu erhalten, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml PSC-Medium + Thiaz. Zählen Sie die Zellen mit einem Zellzähler oder Hämozytometer und verdünnen Sie die Zellen in PSC-Medium + Thiaz auf eine Konzentration von 100.000 Zellen / ml.
      5. Um die Zellen für die EB-Bildung zu verteilen, verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 100 μL (10.000 Zellen) zu jeder Vertiefung einer runden, extrem niedrigen Befestigungsplatte mit 96 Well hinzuzufügen. Zentrifugieren Sie die Platte bei 100 × g für 3 min und inkubieren Sie für 24 h bei 37 °C, 5% _CO2.
   2. Tag -1
      1. Entfernen Sie vorsichtig 50 μL Medium aus jeder Vertiefung und fügen Sie 200 μL frisches PSC-Medium hinzu, das auf 37 ° C erwärmt wurde, um ein Endvolumen von 250 μL pro Vertiefung zu erhalten. Inkubieren Sie die Zellen für 24 h bei 37 °C, 5% _CO2.
         HINWEIS: Entfernen Sie das Medium und fügen Sie es vorsichtig an der Seite des Bohrlochs hinzu, um die EBs am Boden des Brunnens nicht zu stören. Aufgrund der empfindlichen Natur der EBs und der Suspensionskultur ist es notwendig, beim Wechsel des Mediums ein kleines Flüssigkeitsvolumen in jeder Vertiefung zu belassen, um eine Störung der EBs zu vermeiden.
2. Human Heart Organoid (hHO) Differenzierung:
   HINWEIS: Alle Medien sollten vor einem Medienwechsel in einem 37 °C warmen Perlen- oder Wasserbad erwärmt werden. Entfernen und fügen Sie Medium vorsichtig auf der Seite des Brunnens hinzu, um die sich entwickelnden Organoide am Boden des Brunnens nicht zu stören. Zwischen den Medienwechseln sind keine Wäschen erforderlich, um die Unruhe zu minimieren und die allmähliche Entfernung von Inhibitoren und Wachstumsfaktoren zu ermöglichen. RPMI mit 2% B-27 Ergänzung (Tabelle der Materialien) wurde während des gesamten Differenzierungsprotokolls verwendet. B-27 Ergänzung enthält Insulin, sofern nicht angegeben (insulinfrei in den Tagen 0-5). Siehe Abbildung 1C.
   1. Tag 0
      1. Um die Differenzierung in Richtung einer Mesodermlinie einzuleiten, entfernen Sie 166 μL Medium aus jedem Bohrloch (~ 2/3 ^des gesamten Bohrlochvolumens) und fügen Sie 166 μL RPMI 1640 hinzu, das insulinfreies B-27-Präparat, 6 μM CHIR99021, 1,875 ng / ml knochenmorphogenetisches Protein 4 (BMP4) und 1,5 ng / ml Activin A für eine endgültige Bohrlochkonzentration von 4 μM CHIR99021 enthält. 1,25 ng/ml BMP4 und 1 ng/ml Activin A. 24 h bei 37 °C, 5 % _CO2, inkubieren.
   2. Tag 1
      1. Entfernen Sie 166 μL Medium aus jeder Vertiefung und fügen Sie 166 μL frische RPMI 1640 mit insulinfreiem B-27-Präparat hinzu. 24 h bei 37 °C inkubieren, 5% _CO2.
   3. Tag 2
      1. Um die Spezifikation des Herzmesosderms zu induzieren, entfernen Sie 166 μL Medium aus jeder Vertiefung und fügen Sie 166 μL RPMI 1640 mit insulinfreiem B-27-Präparat und 3 μM Wnt-C59 für eine endgültige Well-Konzentration von 2 μM Wnt-C59 hinzu. Inkubieren Sie für 48 h bei 37 °C, 5% _CO2.
   4. Tag 4
      1. Entfernen Sie 166 μL Medium aus jeder Vertiefung und fügen Sie 166 μL frische RPMI 1640 mit insulinfreiem B-27-Präparat hinzu. 48 h bei 37 °C inkubieren, 5% _CO2.
   5. Tag 6
      1. Entfernen Sie 166 μL Medium aus jeder Vertiefung und fügen Sie 166 μL RPMI 1640 mit B-27 Ergänzung hinzu. 24 h bei 37 °C inkubieren, 5% _CO2.
   6. Tag 7
      1. Um die proepikardiale Differenzierung zu induzieren, entfernen Sie 166 μL Medium aus jeder Vertiefung und fügen Sie 166 μL frische RPMI 1640 mit B-27 Ergänzung und 3 μM CHIR99021 für eine endgültige Bohrlochkonzentration von 2 μM CHIR99021 hinzu. 1 h bei 37 °C, 5% _{CO2 inkubieren}.
      2. Entfernen Sie 166 μL Medium aus jeder Vertiefung und fügen Sie 166 μL frische RPMI 1640 mit B-27 Ergänzung hinzu. 48 h bei 37 °C inkubieren, 5% _CO2.
         HINWEIS: Bei diesem zweiten Mediumwechsel an Tag 7 ist besondere Vorsicht geboten, da die Organoide aufgrund der Medienwechsel anfälliger für Bewegungen sind.
      3. Führen Sie ab Tag 7 bis zur Entnahme oder Übertragung für Analysen oder Experimente alle 48 h Mittelwechsel durch, indem Sie 166 μL Medium aus jeder Vertiefung entfernen und 166 μL frische RPMI 1640 mit B-27-Ergänzung hinzufügen.
         HINWEIS: Organoide sind am Tag 15 für Analysen und Experimente bereit, es sei denn, frühere Entwicklungsstadien sind von Interesse. Sie können nach Tag 15 für langfristige Kultur- oder Reifungsexperimente kultiviert werden.

3. Organoidanalyse

1. Übertragung ganzer Organoide (lebend oder fixiert)
   HINWEIS: Stellen Sie bei der Übertragung von Live-Organoiden sicher, dass die verwendeten Pipettenspitzen steril sind.
   1. Schneiden Sie die Spitze von einer P200-Pipettenspitze 5-10 mm von der Spitzenöffnung ab, was zu einer breiten Öffnung von ~ 2-3 mm Durchmesser führt.
   2. Führen Sie die Spitze gerade in den runden Bodenschacht ein, der das Organoid enthält, so dass die Pipette vollständig vertikal (senkrecht zur Platte) ist. Stellen Sie sicher, dass der Pipettenkolben bereits vollständig gedrückt ist, bevor Sie die Spitze in das Medium einführen.
   3. Lassen Sie den Pipettenkolben langsam los und nehmen Sie genügend Medium (100-200 μL) auf, um das Organoid zu sammeln.
   4. Übertragen Sie das Organoid im Medium zum Zielort (z. B. zur Fixierung, Live-Bildgebung, elektrophysiologischen Aufzeichnung, neuen Plattenkultur).
2. Fixierung von Organoiden
   HINWEIS: Das Fixieren und Färben von Organoiden kann entweder in der 96-Well-Kulturplatte oder in den Mikrozentrifugenröhrchen erfolgen. Paraformaldehyd (PFA) sollte nur in einem Abzug gehandhabt werden.
   1. Zur Fixierung in Mikrozentrifugenröhrchen werden lebende Organoide in separate Röhrchen mit 1-8 Organoiden pro Röhrchen übertragen.
      HINWEIS: Überschreiten Sie nicht 8 Organoide pro Röhrchen.
   2. Entfernen und entsorgen Sie vorsichtig so viel Medium wie möglich aus der Röhre, ohne die Organoide zu berühren.
   3. Fügen Sie 4% PFA zu jedem Röhrchen oder Bohrloch hinzu (300-400 μL pro Mikrozentrifugenröhrchen und 100-200 μL pro Vertiefung einer 96-Well-Platte). Bei Raumtemperatur 30-45 min inkubieren.
      HINWEIS: Inkubationszeiten über 1 h können Antigenentnahmeschritte erfordern und werden nicht empfohlen.
   4. Entsorgen Sie die PFA sicher, ohne die Organoide zu stören. Führen Sie 3 Wäschen mit DPBS durch, ergänzt mit 1,5 g / L Glycin (DPBS / Gly), wobei Sie das gleiche Volumen verwenden, das für die 4% PFA verwendet wird, und warten Sie 5 Minuten zwischen den Wäschen. Entfernen Sie DPBS/Gly und fahren Sie mit Immunostaining oder anderen Analysen fort oder fügen Sie DPBS hinzu und lagern Sie es bei 4 °C für die zukünftige Verwendung für bis zu 2 Wochen.
      HINWEIS: Die Lagerung fester Organoide länger als 2 Wochen kann zu Gewebeabbau und Kontamination führen und wird nicht empfohlen.
3. Immunfluoreszenzfärbung am gesamten Anbau
   1. 100 μL Blockierungs-/Permeabilisierungslösung (10% normales Eselserum + 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) + 0,5% Triton X-100 in 1x DPBS) in jedes Bohrloch oder Röhrchen, das die fixierten Organoide enthält, gegeben. Bei Raumtemperatur über Nacht auf einem Shaker inkubieren.
      HINWEIS: Überschreiten Sie nicht 8 Organoide pro Röhrchen.
   2. Entfernen und verwerfen Sie vorsichtig so viel wie möglich von der blockierenden Lösung, ohne die Organoide zu berühren. Führen Sie 3 Wäschen mit DPBS durch und warten Sie 5 Minuten zwischen den Wäschen.
   3. Die primäre Antikörperlösung (1% normales Eselserum + 0,5% BSA + 0,5% Triton X-100 in 1x DPBS) mit den gewünschten primären Antikörpern in den empfohlenen Konzentrationen herstellen. Bei 4 °C für 24 h auf einem Shaker inkubieren.
   4. Entfernen und verwerfen Sie vorsichtig so viel wie möglich von der Antikörperlösung, ohne die Organoide zu berühren. Führen Sie 3 Wäschen mit DPBS durch und warten Sie 5 Minuten zwischen den Wäschen.
   5. Sekundäre Antikörperlösung (1% normales Eselserum + 0,5% BSA + 0,5% Triton X-100 in 1x DPBS) mit den gewünschten sekundären Antikörpern in den empfohlenen Konzentrationen herstellen. Wenn die Antikörper fluoreszierend markiert sind, inkubieren Sie bei 4 °C im Dunkeln (z. B. mit Aluminiumfolie bedeckt) für 24 h auf einem Shaker.
   6. Entfernen und verwerfen Sie vorsichtig so viel wie möglich von der Antikörperlösung, ohne die Organoide zu berühren. Führen Sie 3 Wäschen mit DPBS durch und warten Sie 5 Minuten zwischen den Wäschen.
   7. Bereiten Sie Dias mit Perlen (90-300 μm Durchmesser) vor, die in einem Montagemedium (siehe Materialtabelle) in der Nähe der Kanten des Objektträgers montiert sind, wo der Deckglas mit den Organoiden platziert wird.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, das Montagemedium um die Perlen trocknen zu lassen, bevor Sie fortfahren. Dadurch wird verhindert, dass sich die Perlen bewegen. Siehe Abbildung 2.
   8. Übertragen Sie die gefärbten Organoide mit einer geschnittenen Pipettenspitze zwischen den Perlen auf den Objektträger, um den Abstand zu gewährleisten, um den Kontakt zwischen den Organoiden auf dem Objektträger zu vermeiden. Verwenden Sie die Ecke eines aufgerollten Labortuchs, um überschüssige Flüssigkeit um das Organoid vorsichtig zu entfernen.
   9. Bedecken Sie die Organoide mit einem Montage-Clearing-Medium (Fructose-Glycerin-Clearing-Lösung ist 60% (vol/vol) Glycerin und 2,5 M Fructose)³⁷ unter Verwendung von 120-150 μL des Mounting-Clearing-Mediums pro Objektträger.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, eine geschnittene Pipettenspitze zu verwenden, wenn Sie mit dem Montage-Clearing-Medium arbeiten, da es sehr viskos ist.
   10. Bewegen Sie den Deckglas über den Objektträger, wobei die Organoide mit einer Montage-Clearing-Lösung bedeckt sind, und drücken Sie den Deckglas langsam über den Objektträger, um sicherzustellen, dass sich die Organoide zwischen den montierten Perlen befinden.
   11. Versiegeln Sie den Umfang des Deckglases auf dem Objektträger mit Top-Coat-Nagellack. Lassen Sie den Objektträger 1 h im Dunkeln bei Raumtemperatur trocknen. Zur Langzeitlagerung bei 4 °C im Dunkeln lagern.
4. Transiente Kalziumbildgebung in lebenden Herzorganoiden
   HINWEIS: Gemäß den Anweisungen des Herstellers wurde Fluo4-AM in Dimethylsulfoxid (DMSO) zu einer endgültigen Stammlösungskonzentration von 0,5 mM rekonstituiert. Fluo4-AM wurde direkt in die Organoidbohrung in der 96-Well-Platte gegeben.
   1. Führen Sie 2 Wäschen an den Organoiden mit RPMI 1640 Medium durch.
      1. Entfernen Sie 166 μL des verbrauchten Mediums aus dem Brunnen.
      2. Fügen Sie 166 μL erwärmtes RPMI 1640-Medium hinzu, entfernen Sie 166 μL Medium und fügen Sie 166 μL frisches RPMI 1640-Medium hinzu.
         HINWEIS: Die Wäschen werden durchgeführt, um Abfallmaterial und Zellabfälle zu entfernen. Zwei Drittel des Mediums werden während der Wäsche aus den Vertiefungen entfernt, um eine Störung der Organoide am Boden des Bohrlochs vor dem funktionellen Assay zu vermeiden.
   2. Fügen Sie Fluo4-AM Medium zu den Organoiden hinzu.
      1. Fügen Sie Fluo4-AM, rekonstituiert in DMSO, zu RPMI 1640 hinzu, das B-27-Präparat enthält, um eine 1,5 μM-Lösung herzustellen.
      2. Entfernen Sie 166 μL Medium aus dem Brunnen.
      3. 166 μL 1,5 μM Fluo4-AM in RPMI 1640 enthaltend B-27 Supplement für eine Endbohrlochkonzentration von 1 μM hinzufügen. Inkubieren bei 37 °C, 5% _CO2 für 30 min.
   3. Führen Sie 2 Wäschen wie in Schritt 3.4.1 durch.
   4. Fügen Sie 166 μL RPMI 1640 enthaltende B-27-Ergänzung in die Vertiefung hinzu.
   5. Übertragen Sie das Organoid mit einer geschnittenen Spitze einer P200-Pipettenspitze in eine Glasboden-Petrischale (z. B. 8-Well-Kammer-Deckglas mit # 1.5 Hochleistungs-Deckglas) mit 100-200 μL Medium.
      ANMERKUNG: Siehe Abschnitt 3.1 zur Übertragung ganzer Organoide.
   6. Bild die Organoide leben unter einem Mikroskop mit einer temperatur- und _{CO2-gesteuerten} Kammer bei 37 °C, 5% _CO2.
   7. Nehmen Sie mehrere 10-20 s-Videos an verschiedenen Stellen im Organoid auf, die die Zunahme und Abnahme der Fluoreszenzintensität zeigen, wenn das Kalzium in die Zellen ein- und austritt.
      HINWEIS: Für hochauflösende Aufnahmen wird empfohlen, mit einer Geschwindigkeit von 10 fps oder schneller aufzunehmen. 50 fps werden empfohlen.
   8. Analysieren Sie die Videos mit einer Bildanalysesoftware (z. B. ImageJ), indem Sie Interessengebiete auswählen und die Intensität im Laufe der Zeit messen.
   9. Normalisieren Sie die Intensitätsaufzeichnungen mit ΔF/_F0 im Vergleich zur Zeit in Millisekunden und plotten Sie.

Ergebnisse

Um eine selbstorganisierende hHO in vitro zu erreichen, haben wir die zuvor beschriebenen Differenzierungsprotokolle für die 2D-Monolayer-Differenzierung von Kardiomyozyten21 und epikardialen ^Zellen22 unter Verwendung von Wnt-Signalwegmodulatoren und für präkardiale 3D-Organoide16 unter Verwendung der Wachstumsfaktoren BMP4 und Activin A modifiziert und kombiniert. wurden die Konzentrationen und Expositionsd...

Diskussion

Jüngste Fortschritte bei aus menschlichen Stammzellen gewonnenen Kardiomyozyten und anderen Zellen kardialen Ursprungs wurden verwendet, um die menschliche Herzentwicklung zu ^{modellieren22,24,25} und Krankheit26,27,28 und als Werkzeuge zum Screening von ^{Therapeutika29,30} und tox...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Alexa Fluor 488 Donkey anti- mouse	Invitrogen	A-21202	1:200
Alexa Fluor 488 Donkey anti- rabbit	Invitrogen	A-21206	1:200
Alexa Fluor 594 Donkey anti- mouse	Invitrogen	A-21203	1:200
Alexa Fluor 594 Donkey anti- rabbit	Invitrogen	A-21207	1:200
Alexa Fluor 647 Donkey anti- goat	Invitrogen	A32849	1:200
HAND1	Abcam	ab196622	Rabbit; 1:200
HAND2	Abcam	ab200040	Rabbit; 1:200
NFAT2	Abcam	ab25916	Rabbit; 1:100
PECAM1	DSHB	P2B1	Rabbit; 1:50
TNNT2	Abcam	ab8295	Mouse; 1:200
THY1	Abcam	ab133350	Rabbit; 1:200
TJP1	Invitrogen	PA5-19090	Goat; 1:250
VIM	Abcam	ab11256	Goat; 1:250
WT1	Abcam	ab89901	Rabbit; 1:200
Media and Reagents
Accutase	Innovative Cell Technologies	NC9464543	cell dissociation reagent
Activin A	R&D Systems	338AC010
B-27 Supplement (Minus Insulin)	Gibco	A1895601	insulin-free cell culture supplement
B-27 Supplement	Gibco	17504-044	cell culture supplement
BMP-4	Gibco	PHC9534
Bovine Serum Albumin	Bioworld	50253966
CHIR-99021	Selleck	442310
D-(-)-Fructose	Millipore Sigma	F0127
DAPI	Thermo Scientific	62248	1:1000
Dimethyl Sulfoxide	Millipore Sigma	D2650
DMEM/F12	Gibco	10566016
Essential 8 Flex Medium Kit	Gibco	A2858501	pluripotent stem cell (PSC) medium containing 1% penicillin-streptomycin
Fluo4-AM	Invitrogen	F14201
Glycerol	Millipore Sigma	G5516
Glycine	Millipore Sigma	410225
Matrigel GFR	Corning	CB40230	Basement membrane extracellular matrix (BM-ECM)
Normal Donkey Serum	Millipore Sigma	S30-100mL
Paraformaldehyde	MP Biomedicals	IC15014601	Powder dissolved in PBS Buffer – use at 4%
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate Buffer Solution	Gibco	10010049
Phosphate Buffer Solution (10x)	Gibco	70011044
Polybead Microspheres	Polysciences, Inc.	73155	90 µm
ReLeSR	Stem Cell Technologies	NC0729236	dissociation reagent for hPSCs
RPMI 1640	Gibco	11875093
Thiazovivin	Millipore Sigma	SML1045
Triton X-100	Millipore Sigma	T8787
Trypan Blue Solution	Gibco	1525006
VECTASHIELD Vibrance Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H170010
WNT-C59	Selleck	NC0710557
Other
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	02682002
15 mL Falcon Tubes	Fisher Scientific	1495970C
2 mL Cryogenic Vials	Corning	13-700-500
50 mL Reagent Reservoirs	Fisherbrand	13681502
6-Well Flat Bottom Cell Culture Plates	Corning	0720083
8 Well chambered cover Glass with #1.5 high performance cover glass	Cellvis	C8-1.5H-N
96-well Clear Ultra Low Attachment Microplates	Costar	07201680
ImageJ	NIH		Image processing software
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	06-666	laboratory wipes
Micro Cover Glass	VWR	48393-241	24 x 50 mm No. 1.5
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Multichannel Pipettes	Fisherbrand	FBE1200300	30-300 µL
Olympus cellVivo	Olympus		For Caclium Imaging, analysis with Imagej
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