Génération d’organoïdes cardiaques humains auto-assemblés dérivés de cellules souches pluripotentes

Résumé

Ici, nous décrivons un protocole pour créer des organoïdes cardiaques humains (hHO) pertinents pour le développement en utilisant efficacement des cellules souches pluripotentes humaines par auto-organisation. Le protocole repose sur l’activation séquentielle des signaux de développement et produit des tissus cardiaques humains très complexes et fonctionnellement pertinents.

Résumé

La capacité d’étudier le développement cardiaque humain dans la santé et la maladie est fortement limitée par la capacité de modéliser la complexité du cœur humain in vitro. Le développement de plateformes plus efficaces semblables à des organes capables de modéliser des phénotypes in vivo complexes, tels que des organoïdes et des organes sur puce, améliorera la capacité d’étudier le développement cardiaque humain et les maladies. Cet article décrit un protocole pour générer des organoïdes cardiaques humains (hHO) très complexes par auto-organisation à l’aide de cellules souches pluripotentes humaines et activation progressive de la voie de développement à l’aide d’inhibiteurs de petites molécules. Les corps embryoïdes (EB) sont générés dans une plaque de 96 puits avec des puits à fond rond et à fixation ultra-basse, facilitant la culture en suspension de constructions individualisées.

Les EB subissent une différenciation en hHO par une stratégie de modulation de signalisation Wnt en trois étapes, qui implique une activation initiale de la voie Wnt pour induire le destin du mésoderme cardiaque, une deuxième étape d’inhibition Wnt pour créer des lignées cardiaques définitives et une troisième étape d’activation Wnt pour induire des tissus d’organes proépicardiques. Ces étapes, réalisées dans un format de 96 puits, sont très efficaces, reproductibles et produisent de grandes quantités d’organoïdes par course. L’analyse par imagerie par immunofluorescence du jour 3 au jour 11 de la différenciation révèle les première et deuxième spécifications du champ cardiaque et les tissus très complexes à l’intérieur des hHO au jour 15, y compris le tissu myocardique avec des régions de cardiomyocytes auriculaires et ventriculaires, ainsi que des chambres internes tapissées de tissu endocardique. Les organoïdes présentent également un réseau vasculaire complexe dans toute la structure et une paroi externe du tissu épicardique. D’un point de vue fonctionnel, les hHO battent de manière robuste et présentent une activité calcique normale déterminée par l’imagerie en direct Fluo-4. Dans l’ensemble, ce protocole constitue une plate-forme solide pour les études in vitro dans les tissus cardiaques humains ressemblant à des organes.

Introduction

Les malformations cardiaques congénitales (CHD) sont le type de malformation congénitale le plus courant chez l’homme et affectent environ 1% de toutes les naissances vivantes1,2,3. Dans la plupart des cas, les raisons des maladies coronariennes demeurent inconnues. La capacité de créer des modèles cardiaques humains en laboratoire qui ressemblent étroitement au cœur humain en développement constitue un pas en avant important pour étudier directement les causes sous-jacentes des maladies coronariennes chez l’homme plutôt que dans des modèles animaux de substitution.

La quintessence des modèles tissulaires cultivés en laboratoire sont les organoïdes, des constructions cellulaires 3D qui ressemblent à un organe d’intérêt pour la composition cellulaire et la fonction physiologique. Les organoïdes sont souvent dérivés de cellules souches ou de cellules progénitrices et ont été utilisés avec succès pour modéliser de nombreux organes tels que le ^cerveau4,5, le ^rein6,7, ^{l’intestin8,9}, le ^poumon10,11, le ^foie12,13 et le ^{pancréas14,15} , pour n’en nommer que quelques-uns. Des études récentes ont émergé démontrant la faisabilité de créer des organoïdes cardiaques auto-assemblés pour étudier le développement cardiaque in vitro. Ces modèles comprennent l’utilisation de cellules souches embryonnaires (CSM) de souris pour modéliser le développement cardiaque ^{précoce16,17} jusqu’à la spécification auriculo-ventriculaire18 et de cellules souches pluripotentes humaines (CSEh) pour générer des organoïdes cardio-endodermiques multi-germinaux19 et des cardioïdes chambrés20 avec une composition cellulaire très complexe.

Cet article présente un nouveau protocole de modulation WNT en 3 étapes pour générer des hHO très complexes de manière efficace et rentable. Les organoïdes sont générés dans des plaques de 96 puits, ce qui donne un système évolutif à haut débit qui peut être facilement automatisé. Cette méthode repose sur la création d’agrégats hPSC et le déclenchement des étapes de développement de la cardiogenèse, y compris la formation du mésoderme et du mésoderme cardiaque, la spécification du premier et du deuxième champ cardiaque, la formation d’organes proépicardiques et la spécification auriculo-ventriculaire. Après 15 jours de différenciation, les hHO contiennent toutes les principales lignées cellulaires présentes dans le cœur, des chambres internes bien définies, des chambres auriculaires et ventriculaires et un réseau vasculaire dans tout l’organoïde. Ce système organoïde cardiaque hautement sophistiqué et reproductible se prête à l’étude d’analyses structurelles, fonctionnelles, moléculaires et transcriptomiques dans l’étude du développement cardiaque, des maladies et du dépistage pharmacologique.

Protocole

1. Culture et maintenance des CSEh

REMARQUE: Les CSP d’origine humaine (hiPSC) ou les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) doivent être cultivées pendant au moins 2 passages consécutifs après décongélation avant d’être utilisées pour générer des EB en vue de leur différenciation ou d’une cryoconservation ultérieure. Les cSEh sont cultivés dans un milieu PSC (voir le Tableau des matériaux) sur des plaques de culture à 6 puits revêtues de matrice extracellulaire de membrane sous-basale (BM-ECM). Lorsque vous effectuez des changements de milieu sur des CSEh dans des plaques à 6 puits, ajoutez le milieu directement à l’intérieur du puits plutôt que directement sur les cellules pour éviter le détachement ou le stress indésirable des cellules. Les utilisateurs doivent se méfier des milieux PSC préchauffés qui ne doivent pas être réchauffés à 37 °C; tous les supports PSC utilisés dans ce protocole étaient thermostables.

1. Pour recouvrir les plaques de puits avec le BM-ECM, décongeler une aliquote du BM-ECM (stockée à -20 °C selon les instructions du fabricant) sur de la glace et mélanger 0,5 mg du BM-ECM avec 12 mL de milieu Eagle’s modifié du Dulbecco froid (DMEM)/F12 (stocké à 4 °C). Répartir 2 mL du mélange DMEM/F12-BM-ECM sur chaque puits d’une plaque de 6 puits et incuber à 37 °C pendant au moins 2 h.
2. Pour décongeler les cellules, tout d’abord, décongelez le criovial hPSC dans une perle ou un bain-marie à 37 °C pendant 1 à 2 minutes jusqu’à ce que seule une petite quantité de glace soit visible. Transférer les cellules décongelées dans un tube de centrifugeuse et ajouter lentement 8 à 9 mL du milieu PSC complété par 2 μM de l’inhibiteur de ROCK, la thiazovivine (Thiaz), et centrifuger à 300 × g pendant 5 min. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans le milieu PSC complété par 2 μM de Thiaz. Répartir les cellules dans le milieu de culture dans 1-2 puits en fonction de la concentration de cellules cryoviales et de la culture à 37 °C, 5% de _CO2 pendant 24 h avant de changer le milieu PSC.
3. Changez le milieu sur les cellules à des intervalles de 48 heures. Effectuez des lavages et des changements de milieu à l’aide de DMEM/F12 (1 mL/puits) et du milieu PSC (2 mL/puits), respectivement.
   REMARQUE: Les lavages aident à éliminer les déchets cellulaires et les débris, tandis que les changements de milieux frais fournissent aux cellules une source renouvelée de nutriments.
4. Passage des cellules sur sous-fluidité (60-80% confluent) en aspirant le milieu, puis en lavant chaque puits avec 1 mL de 1x solution tamponnée au phosphate de Dulbecco (pas de calcium, pas de magnésium; DPBS). Aspirer le DPBS et ajouter 1 mL du réactif de dissociation pour les hPSC (voir le tableau des matériaux), suivi de l’aspiration de tous les films du réactif sauf un film mince après 10 s.
5. Incuber pendant 2 à 5 minutes avec le film mince du réactif de dissociation pour les CSEh jusqu’à ce que des espaces se forment entre les cellules.
   REMARQUE: Le temps d’arrêt de la dissociation dépend de la lignée cellulaire.
6. Ajouter 1 mL du milieu PSC complété par 2 μM de Thiaz (milieu PSC + Thiaz) au puits et tapoter doucement la plaque pour induire le détachement cellulaire. Pipeter les cellules détachées dans le milieu 1-2 fois pour briser les grandes colonies, et remettre en suspension les cellules dans le milieu PSC + Thiaz dans un rapport de puits 1: 6 (cellules de 1 puits remises en suspension dans 12 mL de milieu de culture). Replaquez les cellules sur des puits revêtus de BM-ECM.

2. Génération d’organoïdes cardiaques humains auto-assemblés en 3D

1. Formation du corps embryoïde (EB) :
   REMARQUE: Il est impératif de limiter les cellules différenciées observables avant la formation du corps embryoïde. Deux à trois puits d’une plaque de 6 puits à une confluence de 60 à 80% produiront suffisamment de cellules pour une seule plaque d’organoïdes de 96 puits. Tous les milieux doivent être alicités et réchauffés dans une perle ou un bain-marie à 37 °C avant tout changement de milieu afin de minimiser le choc thermique sur les EB ou les organoïdes (cela n’inclut pas les réactifs de dissociation cellulaire). Voir figure 1A,B.
   1. Jour -2
      1. Pour créer des EB, le jour -2, lavez les CSEh sous-confluents (60-80% confluents) avec du DPBS pendant au moins 10 s pour laver les débris cellulaires et aspirer le DPBS.
      2. Pour détacher les cellules et les libérer dans un état unicellulaire, ajoutez 1 mL de réactif de dissociation cellulaire à température ambiante (voir le tableau des matériaux) à chaque puits pendant 3 à 6 minutes. Tapotez doucement la plaque ~ 5 fois par minute pour induire un détachement tout en vérifiant au microscope. Ajouter 1 mL de milieu PSC + Thiaz pour arrêter la réaction.
      3. Pour collecter les cellules et briser les agrégats restants, pipettez le média de haut en bas dans le puits 2 à 3 fois pour générer une suspension à cellule unique. Transférer la suspension monocellulaire dans un tube de centrifugeuse et tourner pendant 5 min à 300 × g.
      4. Pour obtenir la concentration cellulaire souhaitée, jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu PSC + Thiaz. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur cellulaire ou d’un hémocytomètre et diluez les cellules dans le milieu PSC + Thiaz à une concentration de 100 000 cellules / mL.
      5. Pour distribuer les cellules pour la formation d’EB, utilisez une pipette multicanal pour ajouter 100 μL (10 000 cellules) à chaque puits d’une plaque à 96 puits à fond rond ultra-faible. Centrifuger la plaque à 100 × g pendant 3 min et incuber pendant 24 h à 37 °C, 5% de _CO2.
   2. Jour -1
      1. Retirer délicatement 50 μL de milieu de chaque puits et ajouter 200 μL de milieu frais de CSP réchauffé à 37 °C pour obtenir un volume final de 250 μL par puits. Incuber les cellules pendant 24 h à 37 °C, 5% de _CO2.
         REMARQUE: Retirer et ajouter soigneusement le milieu sur le côté du puits pour éviter de déranger les EB au fond du puits. En raison de la nature délicate des EB et de la culture en suspension, il est nécessaire de laisser un petit volume de liquide dans chaque puits lors du changement de milieu pour éviter de perturber les EB.
2. Différenciation des organoïdes cardiaques humains (hHO) :
   REMARQUE: Tous les supports doivent être réchauffés dans un bain-marie ou un bain-marie à 37 °C avant tout changement de support. Retirer et ajouter soigneusement le milieu sur le côté du puits pour éviter de perturber les organoïdes en développement au fond du puits. Les lavages ne sont pas nécessaires entre les changements de milieu pour minimiser l’agitation et permettre l’élimination progressive des inhibiteurs et des facteurs de croissance. RPMI avec supplément de B-27 à 2% (Table des matériaux) a été utilisé tout au long du protocole de différenciation. Le supplément de B-27 contient de l’insuline sauf indication contraire (sans insuline dans les jours 0-5). Voir la figure 1C.
   1. Jour 0
      1. Pour amorcer la différenciation vers une lignée mésodermique, retirer 166 μL de milieu de chaque puits (~2/^3e du volume total du puits) et ajouter 166 μL de RPMI 1640 contenant un supplément de B-27 sans insuline, 6 μM CHIR99021, 1,875 ng/mL de protéine morphogénétique osseuse 4 (BMP4) et 1,5 ng/mL d’activine A pour une concentration finale de puits de 4 μM CHIR99021, 1,25 ng/mL BMP4 et 1 ng/mL d’Activine A. Incuber pendant 24 h à 37 °C, 5 % de _CO2.
   2. Jour 1
      1. Retirer 166 μL de milieu de chaque puits et ajouter 166 μL de RPMI 1640 frais avec un supplément de B-27 sans insuline. Incuber pendant 24 h à 37 °C, 5% de _CO2.
   3. Jour 2
      1. Pour induire la spécification du mésoderme cardiaque, retirer 166 μL de milieu de chaque puits et ajouter 166 μL de RPMI 1640 contenant un supplément de B-27 sans insuline et 3 μM Wnt-C59 pour une concentration finale du puits de 2 μM Wnt-C59. Incuber pendant 48 h à 37 °C, 5% de _CO2.
   4. Jour 4
      1. Retirer 166 μL de milieu de chaque puits et ajouter 166 μL de RPMI 1640 frais avec un supplément de B-27 sans insuline. Incuber pendant 48 h à 37 °C, 5% de _CO2.
   5. Jour 6
      1. Retirer 166 μL de milieu de chaque puits et ajouter 166 μL de RPMI 1640 avec le supplément de B-27. Incuber pendant 24 h à 37 °C, 5% de _CO2.
   6. Jour 7
      1. Pour induire une différenciation proépicardique, retirer 166 μL de milieu de chaque puits et ajouter 166 μL de RPMI 1640 frais contenant du supplément de B-27 et 3 μM de CHIR99021 pour une concentration finale de puits de 2 μM CHIR99021. Incuber pendant 1 h à 37 °C, 5% de _CO2.
      2. Retirer 166 μL de milieu de chaque puits et ajouter 166 μL de RPMI 1640 frais contenant du supplément de B-27. Incuber pendant 48 h à 37 °C, 5% de _CO2.
         REMARQUE: Une prudence supplémentaire est recommandée à ce deuxième changement de milieu le jour 7 car les organoïdes sont plus enclins au mouvement en raison des changements de média.
      3. À partir du jour 7 jusqu’à la collecte ou le transfert pour analyse ou expérimentation, effectuer des changements de milieu toutes les 48 h en retirant 166 μL de milieu de chaque puits et ajouter 166 μL de RPMI 1640 frais contenant du supplément de B-27.
         REMARQUE: Les organoïdes sont prêts pour les analyses et l’expérimentation au jour 15, sauf si des stades de développement plus précoces sont intéressants. Ils peuvent être cultivés au-delà du jour 15 pour des expériences de culture ou de maturation à long terme.

3. Analyse organoïde

1. Transfert d’organoïdes entiers (vivants ou fixes)
   REMARQUE: Pour le transfert d’organoïdes vivants, assurez-vous que les embouts de pipette utilisés sont stériles.
   1. Coupez la pointe d’une pointe de pipette P200 à 5-10 mm de l’ouverture de la pointe, ce qui donne une large ouverture d’environ 2-3 mm de diamètre.
   2. Insérez la pointe directement dans le puits à fond rond contenant l’organoïde afin que la pipette soit complètement verticale (perpendiculaire à la plaque). Assurez-vous que le piston de la pipette est déjà enfoncé avant d’insérer la pointe dans le milieu.
   3. Relâchez lentement le piston de la pipette, en prenant suffisamment de milieu (100-200 μL) pour recueillir l’organoïde.
   4. Transférer l’organoïde dans le milieu vers la destination cible (p. ex., pour la fixation, l’imagerie en direct, l’enregistrement électrophysiologique, la nouvelle culture sur plaque).
2. Fixation des organoïdes
   REMARQUE: La fixation et la coloration des organoïdes peuvent être effectuées soit dans la plaque de culture à 96 puits, soit dans des tubes de microcentrifugation. Le paraformaldéhyde (PFA) ne doit être manipulé que dans une hotte.
   1. Pour la fixation dans des tubes de microcentrifugation, transférez les organoïdes vivants dans des tubes séparés avec 1 à 8 organoïdes par tube.
      REMARQUE: Ne pas dépasser 8 organoïdes par tube.
   2. Retirez et jetez soigneusement autant de milieu que possible du tube sans toucher les organoïdes.
   3. Ajouter 4 % de PFA à chaque tube ou puits (300-400 μL par tube de microcentrifugation et 100-200 μL par puits d’une plaque de 96 puits). Incuber à température ambiante pendant 30-45 min.
      REMARQUE: Les temps d’incubation supérieurs à 1 h peuvent nécessiter des étapes de récupération de l’antigène et ne sont pas recommandés.
   4. Jetez le PFA en toute sécurité sans déranger les organoïdes. Effectuer 3 lavages avec du DPBS complété par 1,5 g/L de glycine (DPBS/Gly), en utilisant le même volume que celui utilisé pour le PFA à 4%, en attendant 5 min entre les lavages. Retirer le DPBS/Gly et procéder à des analyses immunocolorantes ou autres ou ajouter du DPBS et conserver à 4 °C pour une utilisation future jusqu’à 2 semaines.
      REMARQUE: Le stockage d’organoïdes fixes pendant plus de 2 semaines peut entraîner une dégradation et une contamination des tissus et n’est pas recommandé.
3. Coloration immunofluorescente de montage entier
   1. Ajouter 100 μL de solution bloquante/perméabilisante (10 % de sérum d’âne normal + 0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA) + 0,5 % de Triton X-100 dans 1x DPBS) à chaque puits ou tube contenant les organoïdes fixes. Incuber à température ambiante pendant la nuit sur un shaker.
      REMARQUE: Ne pas dépasser 8 organoïdes par tube.
   2. Retirez et jetez soigneusement autant de solution bloquante que possible sans toucher les organoïdes. Effectuez 3 lavages avec DPBS, en attendant 5 minutes entre les lavages.
   3. Préparer la solution d’anticorps primaires (1 % de sérum d’âne normal + 0,5 % de BSA + 0,5 % de Triton X-100 dans 1x DPBS) avec les anticorps primaires souhaités aux concentrations recommandées. Incuber à 4 °C pendant 24 h sur un agitateur.
   4. Retirez et jetez soigneusement autant de solution d’anticorps que possible sans toucher les organoïdes. Effectuez 3 lavages avec DPBS, en attendant 5 minutes entre les lavages.
   5. Préparer une solution d’anticorps secondaires (1 % de sérum d’âne normal + 0,5 % de BSA + 0,5 % de Triton X-100 dans 1x DPBS) avec les anticorps secondaires souhaités aux concentrations recommandées. Si les anticorps sont marqués par fluorescence, incuber à 4 °C dans l’obscurité (p. ex., recouvert de papier d’aluminium) pendant 24 h sur un agitateur.
   6. Retirez et jetez soigneusement autant de solution d’anticorps que possible sans toucher les organoïdes. Effectuez 3 lavages avec DPBS, en attendant 5 minutes entre les lavages.
   7. Préparez les lames avec des perles (90-300 μm de diamètre) montées dans un support de montage (voir la Table des matériaux) près des bords de la diapositive où le couvercle avec les organoïdes sera placé.
      REMARQUE: Il est recommandé de laisser sécher le support de montage autour des perles avant de continuer; cela empêchera les perles de se déplacer. Voir la figure 2.
   8. Transférez les organoïdes colorés à l’aide d’une pointe de pipette coupée sur la glissière, entre les perles, en assurant l’espacement pour éviter tout contact entre les organoïdes une fois sur la lame. Utilisez le coin d’une lingette de laboratoire enroulée pour éliminer soigneusement l’excès de liquide autour de l’organoïde.
   9. Couvrir les organoïdes avec un milieu de montage-dégagement (la solution de nettoyage du fructose-glycérol est de 60% (vol/vol) de glycérol et de 2,5 M de fructose)³⁷ en utilisant 120-150 μL du milieu de montage-dégagement par lame.
      REMARQUE: Il est recommandé d’utiliser une pointe de pipette coupée lorsque vous travaillez avec le support de montage-dégagement car il est très visqueux.
   10. Passez le curseur de couverture sur la glissière avec les organoïdes recouverts d’une solution de montage-dégagement et appuyez lentement sur le couvercle sur la glissière, en vous assurant que les organoïdes sont entre les perles montées.
   11. Scellez le périmètre du couvercle sur la glissière à l’aide d’un vernis à ongles de couche supérieure. Laisser sécher la lame dans l’obscurité à température ambiante pendant 1 h. Conserver à 4 °C dans l’obscurité pour un stockage à long terme.
4. Imagerie transitoire du calcium dans les organoïdes cardiaques vivants
   NOTE: Selon les instructions du fabricant, Fluo4-AM a été reconstitué en sulfoxyde de diméthyle (DMSO) à une concentration finale en solution mère de 0,5 mM. Fluo4-AM a été ajouté directement au puits organoïde dans la plaque de 96 puits.
   1. Effectuez 2 lavages sur les organoïdes à l’aide du milieu RPMI 1640.
      1. Retirer 166 μL du milieu usé du puits.
      2. Ajouter 166 μL de milieu RPMI 1640 réchauffé, retirer 166 μL de milieu et ajouter 166 μL de milieu RPMI 1640 frais.
         REMARQUE: Les lavages sont effectués pour éliminer les déchets et les débris cellulaires. Les deux tiers du milieu sont retirés des puits pendant les lavages pour éviter de perturber les organoïdes au fond du puits avant le test fonctionnel.
   2. Ajouter le milieu Fluo4-AM aux organoïdes.
      1. Ajouter Fluo4-AM reconstitué dans du DMSO au RPMI 1640 contenant du supplément de B-27 pour préparer une solution de 1,5 μM.
      2. Retirer 166 μL de milieu du puits.
      3. Ajouter 166 μL de Fluo4-AM de 1,5 μM dans rpmI 1640 contenant du supplément de B-27 pour une concentration finale du puits de 1 μM. Incuber à 37 °C, 5 % de _CO2 pendant 30 min.
   3. Effectuez 2 lavages comme à l’étape 3.4.1.
   4. Ajouter 166 μL de RPMI 1640 contenant du supplément de B-27 au puits.
   5. À l’aide d’une pointe coupée d’une pointe de pipette P200, transférez l’organoïde dans une boîte de Petri à fond de verre (par exemple, verre de couverture chambré à 8 puits avec verre de couverture haute performance n ° 1,5) avec 100 à 200 μL de milieu.
      REMARQUE: Voir la section 3.1 sur le transfert d’organoïdes entiers.
   6. Imagez les organoïdes vivant sous un microscope avec une chambre à température et _CO2 contrôlée à 37 °C, 5% _co2.
   7. Enregistrez plusieurs vidéos de 10 à 20 s à divers endroits de l’organoïde, montrant l’augmentation et la diminution des niveaux d’intensité de fluorescence à mesure que le calcium entre et sort des cellules.
      REMARQUE: Pour les enregistrements haute résolution, il est recommandé d’enregistrer à une vitesse de 10 ips ou plus; 50 fps est recommandé.
   8. Analysez les vidéos à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images (par exemple, ImageJ) en sélectionnant les régions d’intérêt et en mesurant les niveaux d’intensité au fil du temps.
   9. Normalisez les enregistrements d’intensité en utilisant ΔF/_F0 par rapport au temps en millisecondes et tracez.

Résultats

Pour obtenir un hHO auto-organisé in vitro, nous avons modifié et combiné les protocoles de différenciation précédemment décrits pour la différenciation monocouche 2D des cardiomyocytes21 et des cellules épicardiques22 à l’aide de modulateurs de la voie Wnt et pour les organoïdes précardiaques ^3D16 en utilisant les facteurs de croissance BMP4 et Activin A. En utilisant le protocole de différenciation EB et hHO à 96 puits déc...

Discussion

Les progrès récents dans les cardiomyocytes dérivés de cellules souches humaines et d’autres cellules d’origine cardiaque ont été utilisés pour modéliser le développement cardiaque ^{humain22,24,25} et la ^{maladie26,27,28} et comme outils pour dépister les agents ^{thérapeutiques29,30}

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Alexa Fluor 488 Donkey anti- mouse	Invitrogen	A-21202	1:200
Alexa Fluor 488 Donkey anti- rabbit	Invitrogen	A-21206	1:200
Alexa Fluor 594 Donkey anti- mouse	Invitrogen	A-21203	1:200
Alexa Fluor 594 Donkey anti- rabbit	Invitrogen	A-21207	1:200
Alexa Fluor 647 Donkey anti- goat	Invitrogen	A32849	1:200
HAND1	Abcam	ab196622	Rabbit; 1:200
HAND2	Abcam	ab200040	Rabbit; 1:200
NFAT2	Abcam	ab25916	Rabbit; 1:100
PECAM1	DSHB	P2B1	Rabbit; 1:50
TNNT2	Abcam	ab8295	Mouse; 1:200
THY1	Abcam	ab133350	Rabbit; 1:200
TJP1	Invitrogen	PA5-19090	Goat; 1:250
VIM	Abcam	ab11256	Goat; 1:250
WT1	Abcam	ab89901	Rabbit; 1:200
Media and Reagents
Accutase	Innovative Cell Technologies	NC9464543	cell dissociation reagent
Activin A	R&D Systems	338AC010
B-27 Supplement (Minus Insulin)	Gibco	A1895601	insulin-free cell culture supplement
B-27 Supplement	Gibco	17504-044	cell culture supplement
BMP-4	Gibco	PHC9534
Bovine Serum Albumin	Bioworld	50253966
CHIR-99021	Selleck	442310
D-(-)-Fructose	Millipore Sigma	F0127
DAPI	Thermo Scientific	62248	1:1000
Dimethyl Sulfoxide	Millipore Sigma	D2650
DMEM/F12	Gibco	10566016
Essential 8 Flex Medium Kit	Gibco	A2858501	pluripotent stem cell (PSC) medium containing 1% penicillin-streptomycin
Fluo4-AM	Invitrogen	F14201
Glycerol	Millipore Sigma	G5516
Glycine	Millipore Sigma	410225
Matrigel GFR	Corning	CB40230	Basement membrane extracellular matrix (BM-ECM)
Normal Donkey Serum	Millipore Sigma	S30-100mL
Paraformaldehyde	MP Biomedicals	IC15014601	Powder dissolved in PBS Buffer – use at 4%
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate Buffer Solution	Gibco	10010049
Phosphate Buffer Solution (10x)	Gibco	70011044
Polybead Microspheres	Polysciences, Inc.	73155	90 µm
ReLeSR	Stem Cell Technologies	NC0729236	dissociation reagent for hPSCs
RPMI 1640	Gibco	11875093
Thiazovivin	Millipore Sigma	SML1045
Triton X-100	Millipore Sigma	T8787
Trypan Blue Solution	Gibco	1525006
VECTASHIELD Vibrance Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H170010
WNT-C59	Selleck	NC0710557
Other
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	02682002
15 mL Falcon Tubes	Fisher Scientific	1495970C
2 mL Cryogenic Vials	Corning	13-700-500
50 mL Reagent Reservoirs	Fisherbrand	13681502
6-Well Flat Bottom Cell Culture Plates	Corning	0720083
8 Well chambered cover Glass with #1.5 high performance cover glass	Cellvis	C8-1.5H-N
96-well Clear Ultra Low Attachment Microplates	Costar	07201680
ImageJ	NIH		Image processing software
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	06-666	laboratory wipes
Micro Cover Glass	VWR	48393-241	24 x 50 mm No. 1.5
Microscope Slides	Fisherbrand	1255015
Moxi Cell Counter	Orflo Technologies	MXZ001
Moxi Z Cell Count Cassette – Type M	Orflo Technologies	MXC001
Multichannel Pipettes	Fisherbrand	FBE1200300	30-300 µL
Olympus cellVivo	Olympus		For Caclium Imaging, analysis with Imagej
Sorvall Legend X1 Centrifuge	ThermoFisher Scientific	75004261
Thermal Mixer	ThermoFisher Scientific	13-687-717
Top Coat Nail Varish	Seche Vite		Can purchase from any supermarket