Modelos animales ex vivo e in vivo para lesiones mecánicas y químicas del epitelio corneal

Resumen

Aquí, se desarrollan modelos animales basados en ratones y conejos para lesiones mecánicas y químicas del epitelio corneal para detectar nuevas terapias y el mecanismo subyacente.

Resumen

La lesión corneal en la superficie ocular, incluyendo quemaduras químicas y traumatismos, puede causar cicatrices graves, simblefarón, deficiencia de células madre limbares corneales y provocar un defecto epitelial corneal grande y persistente. El defecto epitelial con la siguiente opacidad corneal y la neovascularización periférica resultan en una discapacidad visual irreversible y dificultan el manejo futuro, especialmente la queratoplastia. Dado que el modelo animal se puede utilizar como una plataforma efectiva de desarrollo de fármacos, aquí se desarrollan modelos de lesión corneal en el ratón y quemaduras alcalinas en el epitelio corneal del conejo. El conejo blanco de Nueva Zelanda se utiliza en el modelo de quema alcalina. Se pueden aplicar diferentes concentraciones de hidróxido de sodio en el área circular central de la córnea durante 30 s bajo anestesia intramuscular y tópica. Después de una copiosa irrigación salina normal isotónica, se eliminó el epitelio corneal suelto residual con rebaba corneal profundamente hasta la capa de Bowman dentro de esta área circular. La cicatrización de heridas se documentó mediante tinción con fluoresceína bajo luz azul cobalto. Se utilizaron ratones C57BL/6 en el modelo traumático de epitelio corneal murino. La córnea central murina se marcó con un punzón de piel, de 2 mm de diámetro, y luego se desbridó con un removedor de anillo de óxido corneal con una rebaba de 0,5 mm bajo un microscopio estereoscópico. Estos modelos se pueden utilizar prospectivamente para validar el efecto terapéutico de gotas para los ojos o agentes mixtos como las células madre, que potencialmente facilitan la regeneración epitelial corneal. Al observar la opacidad corneal, la neovascularización periférica y la congestión conjuntival con estereomicroscopio y software de imágenes, se pueden monitorear los efectos terapéuticos en estos modelos animales.

Introducción

La córnea humana consta de cinco capas principales y desempeña un papel fundamental en la refracción ocular para mantener la agudeza visual y la integridad estructural para proteger los tejidos intraoculares¹. La parte más externa de la córnea es el epitelio corneal, compuesto por cinco a seis capas de células que se diferencian secuencialmente de las células basales y se mueven hacia arriba para desprenderse de la superficie ocular¹. En comparación con la córnea en humanos y conejos de Nueva Zelanda, la córnea de ratón tiene una estructura corneal similar, pero una periferia más delgada que la parte central debido a un grosor reducido en el epitelio y el estroma². Debido a su posición única en el sistema óptico ocular, muchos insultos externos como lesiones mecánicas, inoculación bacteriana y agentes químicos pueden poner en peligro fácilmente la integridad epitelial y provocar un defecto epitelial que amenaza la visión, queratitis infecciosa, fusión corneal e incluso perforación corneal.

Aunque varios agentes terapéuticos, como lubricantes, antibióticos, agentes antiinflamatorios, productos de autosuero y membrana amniótica ya se han utilizado para mejorar la reepitelización y reducir las cicatrices, otras posibles modalidades de tratamiento que pueden permitir la cicatrización de heridas, reducir la inflamación y suprimir la formación de cicatrices todavía se están desarrollando y probando en diferentes plataformas. Se han propuesto varios modelos animales para la cicatrización de heridas epiteliales corneales, incluida la eliminación del epitelio corneal con un removedor de anillo de óxido corneal en ratón diabético³, rasguños lineales sobre el epitelio corneal del ratón mediante una aguja estéril de 25 G para la inoculación bacteriana⁴, eliminación asistida por trepines del epitelio corneal mediante removedor de anillo de óxido corneal⁵, cauterización epitelial sobre la mitad de la córnea y el limbo⁶ , abrasión corneal de conejo facilitada por trefina por una hoja de bisturí opaca⁷, y lesión de la córnea bovina por congelación repentina en nitrógeno líquido⁸.

Además de la lesión mecánica al epitelio corneal, los agentes químicos también son insultos comunes a la superficie ocular, especialmente los agentes ácidos y alcalinos. El hidróxido de sodio (NaOH, 0.1-1 N para 30-60 s) es uno de los productos químicos comúnmente utilizados en modelos murinos y de conejo de quemaduras químicas corneales 9,10,11,12,13. El etanol al 100% también se había aplicado a la córnea en el modelo de quemadura química de rata, seguido de un desguace mecánico adicional utilizando una cuchilla quirúrgica¹⁴. Dado que el mantenimiento de una superficie ocular sana depende de unidades funcionales, incluidos los párpados, las glándulas de Meibomio, el sistema lagrimal, la conjuntiva y la córnea, los modelos animales in vivo tienen algunos méritos sobre las células epiteliales de córnea cultivadas ex vivo o los tejidos corneales. En este artículo, se demuestra el modelo de ratón de la herida por abrasión corneal y el modelo de conejo de quemadura alcalina corneal.

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Protocolo

Todos los procedimientos experimentales en estudios con animales fueron aprobados por el Comité de Ética de Investigación del Chang Gung Memorial Hospital y se adhirieron a la declaración ARVO para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión.

1. Modelo de cicatrización de heridas ex vivo del epitelio corneal del ratón

1. Preparación de los ratones
   1. Administrar anestesia general a ratones C57BL/6 mediante administración intraperitoneal de clorhidrato de ketamina (80-100 mg/kg de peso corporal) y xilazina (5-10 mg/kg de peso corporal).
   2. Asegúrese de que la anestesia general esté funcionando confirmando la pérdida de movimiento a un estímulo nocivo y la pérdida del reflejo de enderezamiento en ratones.
   3. Fijar la cabeza de los ratones a mano y aplicar anestesia tópica en ambos ojos con una gota de solución oftálmica de clorhidrato de proparacaína al 0,5% (Figura 1A). Desinfecte la superficie ocular y los párpados tres veces con betadina al 5%.
2. Creación de un modelo murino de herida epitelial corneal
   NOTA: Realice los siguientes procedimientos bajo un microscopio estereoscópico. La herida corneal se creó in vivo, no ex vivo, para manipular el globo ocular mejor y cerca de la situación del mundo real. Este es un procedimiento terminal; por lo tanto, solo se requieren instrumentos limpios (no técnicos estériles).
   1. Marque la córnea central del ratón con un punzón de biopsia de piel (2 mm de diámetro) para confirmar un área bien circunscrita y bien medible de la herida.
   2. Aplique suavemente la punzón sobre la córnea central para dejar una marca circular (Figura 1B). Utilizando un removedor de anillo de óxido corneal de mano con una rebaba de 0,5 mm, desbridar el epitelio corneal hasta la capa de Bowman asegurándose de no dañar este último (Figura 1C). Retire los tejidos sueltos residuales internos al margen de la herida con fórceps corneales.
   3. Confirmar el área de desbridamiento con tinción fluoresceínica (Figura 1D). Para realizar la tinción con fluoresceína, coloque una gota de solución salina normal en un papel de fluoresceína para disolver la fluoresceína, y luego coloque la gota que contiene fluoresceína sobre el defecto epitelial murino para visualizarlo bajo la luz azul cobalto.
3. Cultivo ex vivo del modelo murino de herida por abrasión corneal.
   1. Para cosechar los globos oculares murinos, proceda de la siguiente manera.
   2. Sacrificar los ratones por luxación cervical después de inducir la anestesia con isoflurano al 5% en una cámara de inducción. Asegúrese de que la anestesia esté funcionando confirmando la pérdida de movimiento a un estímulo nocivo y la pérdida del reflejo de enderezamiento en ratones.
   3. Presione suavemente con la punta de los fórceps en los bordes orbitales superior e inferior para empujar el globo ocular hacia afuera. Introduzca la punta de las tijeras corneales cerradas en el espacio retrobulbar a lo largo de la pared orbital inferior, asegurándose de no penetrar en el globo ocular.
   4. Mantenga el globo ocular firme con pinzas corneales de 0,3 mm y luego corte el nervio óptico y el tejido blando periorbitario con tijeras corneales para aislar el globo ocular.
   5. Para el cultivo ex vivo de globos oculares murinos, proceda de la siguiente manera.
   6. Prepare una placa de 48 pocillos con cera derretida dentro del pozo y espere a que se solidifique. Con la punta de las pinzas de la conjuntiva, cree un orificio redondo en la superficie de cera solidificada para acomodar los globos oculares.
   7. Coloque los globos oculares cosechados directamente sobre la placa de 48 pocillos (Figura 1E) con fondos y paredes laterales cubiertos de cera para establecer la estabilización (Figura 1F).
   8. Cultivar los globos oculares con el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) que contiene 1% de suero fetal bovino (FBS) en una atmósfera humidificada de 5% de_CO2 a 37 °C con o sin antibióticos, dependiendo del propósito del estudio.
      NOTA: Si el modelo se utiliza para estudiar la cicatrización de heridas epiteliales corneales, se requerirían antibióticos para prevenir la infección. Sin embargo, si este modelo se utiliza para evaluar la eficacia de los antibióticos o agentes mixtos, los antibióticos profilácticos no serían necesarios.
   9. Sumerja la superficie ocular con el medio de cultivo sin hacer que el globo ocular flote.
   10. Documente el curso de la cicatrización de heridas mediante tinción con fluoresceína (paso 1.2.3) y la recopilación de fotografías con una cámara digital bajo luz azul cobalto.
       NOTA: En experimentos prospectivos con modelos de ratones de lesión corneal mecánica, aquellos que recibieron abrasión corneal y probaron más a fondo la eficacia de los agentes terapéuticos se consideran un grupo experimental, y aquellos que reciben abrasión corneal sin tratamiento adicional se consideran un grupo de control negativo.

2. Modelo de conejo in vivo de lesión alcalina corneal

NOTA: En este modelo, se induce una lesión por quemadura alcalina seguida de un desbridamiento mecánico del epitelio corneal para generar un área bien definida y uniforme de la herida para su posterior cuantificación. Esterilice todos los instrumentos antes de usarlos.

1. Preparación del conejo con analgesia preoperatoria, incluida la inyección intramuscular de analgésicos sistémicos y gotas tópicas para los ojos.
   1. Administrar anestesia general a conejos blancos de Nueva Zelanda mediante inyección intramuscular de clorhidrato de ketamina (35-44 mg/kg de peso corporal), mezclado con xilazina (5-10 mg/kg de peso corporal) en la pata trasera.
   2. Después de colocar el conejo y cubrirlo con una toalla, aplique anestesia tópica sobre el ojo derecho con una gota de solución oftálmica de clorhidrato de proparacaína al 0,5% (Figura 2A) bajo un microscopio estereoscópico. Desinfecte la superficie ocular y los párpados tres veces con betadina al 5%.
2. Inducir lesiones por quemaduras alcalinas sobre la córnea
   1. Coloque papeles de filtro circulares con un diámetro de 8 mm (cortados con un punzón de 8 mm) en una placa de Petri. Con un gotero, agregue hidróxido de sodio (NaOH) de 0,5 N en la placa de Petri para remojar los papeles de filtro. Drene el exceso de solución de NaOH de los papeles de filtro antes de colocarlos en la córnea del conejo.
      PRECAUCIÓN: 0.5 N NaOH puede causar lesiones erosivas graves a los tejidos humanos. Use guantes cuando manipule. Si la piel o los ojos entran en contacto con gotitas de NaOH, se requiere irrigación con grandes cantidades de solución salina normal y ayuda médica para reducir el daño adicional.
   2. Después de abrir los párpados con un espéculo del párpado y confirmar que la membrana nictitante del conejo no está interfiriendo con la inserción del papel de filtro (Figura 2B), coloque el papel de filtro circular empapado en NaOH 0.5 N en la córnea central durante 30 s, y luego retírelo con fórceps (Figura 2C).
   3. Después de retirar el papel de filtro, enjuague la superficie ocular con 10 ml de solución salina normal para eliminar el material alcalino.
3. Defecto epitelial corneal completo
   1. Desacredite el epitelio corneal dentro del área opacificada hasta la membrana de Bowman usando un removedor de anillo de óxido corneal con una rebaba de 0,5 mm (Figura 2D).
   2. Confirme el área de desbridamiento con tinción fluoresceínica bajo la luz azul cobalto y retire el epitelio corneal residual utilizando fórceps corneales (Figura 2E).
4. Condición segura de la herida con tarsorrafia
   1. Confirme que la membrana nictitante cubre suavemente la superficie ocular y el defecto epitelial corneal en el lado nasal. Asegúrese de que la membrana nictitante no esté doblada o distorsionada demasiado para interferir con el proceso de curación de heridas y el experimento.
   2. Realizar una tarsorrafia temporal con o sin agentes tópicos utilizando una sutura 6-0 para proteger la superficie ocular y evitar que el conejo se rasque (Figura 2F). Asegúrese de que la sutura para la tarsorrafia esté a 3-4 mm de los márgenes superior e inferior del párpado con 4-5 lazos y nudos más largos para evitar que el conejo rompa las suturas.
      NOTA: Si el experimento no está involucrado en un estudio de antibióticos, se podrían considerar agentes tópicos con antibióticos.
   3. En este modelo de conejo, aquellos que recibieron quemaduras alcalinas y extirpación del epitelio corneal fueron considerados como el grupo de control.
      NOTA: En experimentos prospectivos, los conejos que reciben lesiones corneales por quemaduras alcalinas y se tratan posteriormente con agentes terapéuticos se consideran un grupo experimental. Los conejos que reciben tratamiento de quemaduras alcalinas solamente, sin tratamiento adicional, se consideran un grupo de control negativo.
5. Analgesia postoperatoria y control del dolor
   1. Evaluar la condición fisiológica y los niveles de dolor del USDA durante 7 días después del procedimiento, mediante el monitoreo del dolor y la angustia en los animales. Considere el uso de ungüento de tobramicina y una gota de solución oftálmica de clorhidrato de proparacaína al 0,5% de acuerdo con el resultado de la evaluación. Administrar buprenorfina HCl (0,03 mg/kg) cada 6-8 horas durante 3 días.
      NOTA: Para la medición diaria del área defectuosa y la observación después de la cirugía, el procedimiento pertenece a la categoría D del USDA.

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Resultados

Modelo de cicatrización de heridas ex vivo del epitelio corneal del ratón:
Después del desbridamiento in vivo del epitelio corneal del ratón con removedor de anillo de óxido corneal de mano, se puede encontrar un área corneal central ligeramente deprimida con tinción positiva de fluoresceína en el área central de 2 mm (Figura 3A-B). Después de cosechar el globo ocular del ratón, se fijó fáci...

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Discusión

Los modelos de ratón y conejo de lesión corneal proporcionan una plataforma útil ex vivo e in vivo para monitorear la cicatrización de heridas, probar nuevas terapias y estudiar los mecanismos subyacentes de las vías de curación y tratamiento de heridas. Se pueden utilizar diferentes modelos animales para un experimento a corto o largo plazo, dependiendo del propósito de la investigación. Por ejemplo, después de crear un defecto epitelial en la córnea de ratón in vivo, se podría usa...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
6/0 Ethicon vicryl suture	Ethicon	6/0VICRYL	tarsorrhaphy
Barraquer lid speculum	katena	K1-5355	15 mm
Barraquer needle holder	Katena	K6-3310	without lock
Barron Vacuum Punch 8.0 mm	katena	K20-2108	for cutting filter paper
C57BL/6 mice	National Laboratory Animal Center	RMRC11005	mouse strain
Castroviejo forceps 0.12 mm	katena	K5-2500
Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr	Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX	CHI-675	for debridement of the corneal epithelium
Filter paper	Toyo Roshi Kaisha,Ltd.	1.11
Fluorescein sodum ophthalmic strips U.S.P	OPTITECH	OPTFL100	staining for corneal epithelial defect
Ketamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	61763-23-3	intraperitoneal or intramuscular anesthetics
New Zealand White Rabbits	Livestock Research Institute, Council of Agriculture,Executive Yuan		Rabbit models
Normal saline	TAIWAN BIOTECH CO., LTD.	100-120-1101
Proparacaine	Alcon	ALC2UD09	topical anesthetics
Skin biopsy punch 2mm	STIEFEL	22650
Sodium chloride (NaOH)	Sigma-Aldrich	1310-73-2	a chemical agent for alkali burn
Stereomicroscope	Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA	SV11	microscope for surgery
Westcott Tenotomy Scissors Medium	katena	K4-3004
Xylazine hydrochloride 23.32 mg/10 mL	Elanco animal health Korea Co., LTD.	047-956	intraperitoneal or intramuscular anesthetics