Modelos Animais Ex Vivo e In Vivo para Lesões Mecânicas e Químicas do Epitélio da Córnea

Resumo

Aqui, modelos animais baseados em camundongos e coelhos são desenvolvidos para lesão mecânica e química do epitélio corneano para triagem de novas terapêuticas e do mecanismo subjacente.

Resumo

A lesão da córnea na superfície ocular, incluindo queimadura química e trauma, pode causar cicatrizes graves, simbléfaro, deficiência de células-tronco límbicas da córnea e resultar em um grande defeito epitelial corneano persistente. O defeito epitelial com opacidade corneana e neovascularização periférica resulta em comprometimento visual irreversível e dificulta o manejo futuro, especialmente a ceratoplastia. Uma vez que o modelo animal pode ser usado como uma plataforma eficaz de desenvolvimento de fármacos, modelos de lesão corneana em camundongos e queimadura alcalina em epitélio corneano de coelho são desenvolvidos aqui. O coelho branco da Nova Zelândia é usado no modelo de queimadura alcalina. Diferentes concentrações de hidróxido de sódio podem ser aplicadas na área circular central da córnea por 30 s sob anestesia intramuscular e tópica. Após abundante irrigação salina isotônica normal, o epitélio corneano solto residual foi removido com broca corneana profundamente até a camada de Bowman dentro desta área circular. A cicatrização foi documentada pela coloração com fluoresceína sob luz azul de cobalto. Camundongos C57BL/6 foram utilizados no modelo traumático de epitélio corneano murino. A córnea central murina foi marcada com punch cutâneo de 2 mm de diâmetro e, em seguida, desbridada por removedor de anel de ferrugem corneana com broca de 0,5mm em estereomicroscópio. Esses modelos podem ser usados prospectivamente para validar o efeito terapêutico de colírios ou agentes mistos, como células-tronco, que potencialmente facilitam a regeneração epitelial corneana. Observando-se opacidade corneana, neovascularização periférica e congestão conjuntival com estereomicroscópio e software de imagem, os efeitos terapêuticos nesses modelos animais podem ser monitorados.

Introdução

A córnea humana é constituída por cinco camadas principais e desempenha um papel fundamental na refração ocular para manter a acuidade visual e a integridade estrutural para proteger os tecidos intraoculares¹. A parte mais externa da córnea é o epitélio corneano, composto por cinco a seis camadas de células que se diferenciam sequencialmente das células basais e se movem para cima para se desprender da superfície^ocular1. Comparada à córnea em humanos e coelhos da raça Nova Zelândia, a córnea de camundongos tem uma estrutura corneana semelhante, mas periferia mais fina do que a parte central devido a uma espessura reduzida no epitélio e no estroma². Devido à sua posição única no sistema óptico ocular, muitos insultos externos, como lesão mecânica, inoculação bacteriana e agentes químicos, podem facilmente colocar em risco a integridade epitelial e levar a um defeito epitelial que ameace a visão, ceratite infecciosa, derretimento da córnea e até perfuração da córnea.

Embora vários agentes terapêuticos, como lubrificantes, antibióticos, anti-inflamatórios, produtos auto-sorológicos e membrana amniótica já tenham sido usados para melhorar a reepitelização e reduzir a cicatrização, outras potenciais modalidades de tratamento que podem permitir a cicatrização de feridas, reduzir a inflamação e suprimir a formação de cicatrizes ainda estão sendo desenvolvidas e testadas em diferentes plataformas. Vários modelos animais para cicatrização de feridas epiteliais corneanas têm sido propostos, incluindo remoção do epitélio corneano com removedor de anel de ferrugem corneana em camundongos diabéticos³, arranhões lineares sobre o epitélio corneano de camundongos por agulha estéril 25 G para inoculação bacteriana⁴, remoção assistida por trefina do epitélio corneano por removedor de anel de ferrugem corneana⁵, cautério epitelial sobre metade da córnea e limbo⁶ , abrasão da córnea de coelho facilitada pela trefina por lâmina de bisturi embotada⁷ e lesão da córnea bovina por congelamento instantâneo em nitrogênio líquido⁸.

Além da lesão mecânica do epitélio corneano, agentes químicos também são insultos comuns à superfície ocular, especialmente agentes ácidos e alcalinos. O hidróxido de sódio (NaOH, 0,1-1 N por 30-60 s) é um dos produtos químicos comumente utilizados em modelos murinos e coelhos de queimadura química de córnea 9,10,11,12,13. Etanol a 100% também foi aplicado na córnea no modelo de queimadura química de ratos, seguido de raspagem mecânica adicional com lâmina cirúrgica¹⁴. Uma vez que a manutenção de uma superfície ocular saudável depende de unidades funcionais, incluindo as pálpebras, as glândulas meibomianas, o sistema lacrimal, a conjuntiva e a córnea, os modelos animais in vivo têm alguns méritos sobre células epiteliais da córnea cultivadas ex vivo ou tecidos corneanos. Neste artigo, o modelo de ferida por abrasão corneana em camundongo e o modelo de coelho de queimadura alcalina corneana são demonstrados.

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Protocolo

Todos os procedimentos experimentais em estudos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Chang Gung Memorial Hospital e aderiram à declaração ARVO para uso de animais em pesquisas oftalmológicas e da visão.

1. Modelo de cicatrização ex vivo do epitélio corneano de camundongos

1. Preparação dos ratos
   1. Administrar anestesia geral a camundongos C57BL/6 por administração intraperitoneal de cloridrato de cetamina (80-100 mg/kg de peso corporal) e xilazina (5-10 mg/kg de peso corporal).
   2. Certifique-se de que a anestesia geral esteja funcionando, confirmando a perda de movimento para um estímulo nocivo e a perda do reflexo de retificação em camundongos.
   3. Fixar a cabeça dos camundongos com a mão e aplicar anestesia tópica em ambos os olhos com uma gota de solução oftálmica de cloridrato de proparacaína a 0,5% (Figura 1A). Desinfetar a superfície ocular e as pálpebras três vezes com betadina a 5%.
2. Criação de modelo de ferida epitelial corneana murina
   NOTA: Execute os procedimentos abaixo sob um estereomicroscópio. A ferida corneana foi criada in vivo, não ex vivo, para manipular melhor o globo ocular e se aproximar da situação do mundo real. Este é um procedimento terminal; portanto, apenas instrumentos limpos (não técnica estéril) são necessários.
   1. Marque a córnea central do camundongo usando um punch de biópsia de pele (2 mm de diâmetro) para confirmar uma área bem circunscrita e bem mensurável da ferida.
   2. Recue suavemente o punção sobre a córnea central para deixar uma marca circular (Figura 1B). Utilizando um removedor manual de anel de ferrugem corneana com uma broca de 0,5 mm, desbridar o epitélio corneano até a camada de Bowman, garantindo que não danifique esta última (Figura 1C). Remova os tecidos residuais e soltos internos à margem da ferida com pinças corneanas.
   3. Confirmar a área de desbridamento com coloração de fluoresceína (Figura 1D). Para realizar a coloração de fluoresceína, coloque uma gota de soro fisiológico em um papel fluoresceína para dissolver a fluoresceína e, em seguida, coloque a gota contendo fluoresceína no defeito epitelial murino para visualizá-la sob luz azul de Cobalto.
3. Cultura ex vivo do modelo de ferida por abrasão corneana murina.
   1. Para colher os globos oculares murinos, proceda da seguinte forma.
   2. Sacrificar os camundongos por deslocamento cervical após indução anestésica com isoflurano a 5% em câmara de indução. Certifique-se de que a anestesia está funcionando, confirmando a perda de movimento para um estímulo nocivo e perda do reflexo de retificação em camundongos.
   3. Pressione suavemente com a ponta da pinça nas bordas orbitais superior e inferior para empurrar o globo ocular para fora. Introduzir a ponta da tesoura corneana fechada no espaço retrobulbar ao longo da parede orbitária inferior, garantindo que não penetre no globo ocular.
   4. Mantenha o globo ocular firme com pinça corneana de 0,3 mm e, em seguida, corte o nervo óptico e o tecido mole periorbital com tesoura corneana para isolar o globo ocular.
   5. Para a cultura ex vivo de globos oculares murinos, proceda da seguinte forma.
   6. Prepare uma placa de 48 poços com cera derretida dentro do poço e aguarde a solidificação. Com a ponta da pinça da conjuntiva, crie um orifício redondo na superfície de cera solidificada para acomodar os globos oculares.
   7. Coloque os globos oculares colhidos diretamente sobre a placa de 48 poços (Figura 1E) com fundo coberto de cera e paredes laterais para estabelecer a estabilização (Figura 1F).
   8. Cultura dos globos oculares com meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) contendo 1% de soro fetal bovino (SFB) em atmosfera umidificada de 5% CO₂ a 37 °C com ou sem antibióticos, dependendo do objetivo do estudo.
      NOTA: Se o modelo for usado para estudar a cicatrização de feridas epiteliais da córnea, antibióticos seriam necessários para prevenir a infecção. No entanto, se esse modelo for usado para avaliar a eficácia de antibióticos ou agentes mistos, antibióticos profiláticos não seriam necessários.
   9. Imergir a superfície ocular com o meio de cultura sem causar flutuação do globo ocular.
   10. Documentar o curso da cicatrização de feridas pela coloração com fluoresceína (passo 1.2.3) e coletar fotografias com uma câmera digital sob luz azul de cobalto.
       NOTA: Em experimentos prospectivos com modelos de camundongos de lesão mecânica da córnea, aqueles que recebem abrasão da córnea e testados posteriormente quanto à eficácia dos agentes terapêuticos são vistos como um grupo experimental, e aqueles que recebem abrasão da córnea sem tratamento adicional são considerados como um grupo controle negativo.

2. Modelo in vivo de lesão alcalina corneana em coelhos

OBS: Neste modelo, uma lesão por queimadura alcalina é induzida seguida de desbridamento mecânico do epitélio corneano para gerar uma área bem definida e uniforme da ferida para posterior quantificação. Esterilizar todos os instrumentos antes do uso.

1. Preparo do coelho com analgesia pré-operatória, incluindo injeção intramuscular de analgésicos sistêmicos e colírios tópicos.
   1. Administrar anestesia geral a coelhos brancos da Nova Zelândia por injeção intramuscular de cloridrato de cetamina (35-44 mg/kg de peso corporal), misturado com xilazina (5-10 mg/kg de peso corporal) na pata traseira.
   2. Após posicionar o coelho e cobri-lo com uma toalha, aplicar anestesia tópica sobre o olho direito com uma gota de solução oftálmica de cloridrato de proparacaína a 0,5% (Figura 2A) sob um estereomicroscópio. Desinfetar a superfície ocular e as pálpebras três vezes com betadina a 5%.
2. Induzindo lesão por queimadura alcalina sobre a córnea
   1. Coloque papéis de filtro circulares com um diâmetro de 8 mm (cortados com um punch de 8 mm) em uma placa de Petri. Usando um conta-gotas, adicione 0,5 N de hidróxido de sódio (NaOH) na placa de Petri para molhar os papéis de filtro. Escorra o excesso de solução de NaOH dos papéis de filtro antes de colocá-los na córnea do coelho.
      CUIDADO: 0,5 N NaOH pode causar lesão erosiva grave em tecidos humanos. Use luvas ao manusear. Se a pele ou os olhos entrarem em contato com gotículas de NaOH, irrigação com quantidades abundantes de soro fisiológico normal e ajuda médica são necessárias para reduzir mais danos.
   2. Após a abertura das pálpebras com um espéculo palpebral e a confirmação de que a membrana nictitante do coelho não está interferindo na inserção do papel de filtro (Figura 2B), colocar o papel de filtro circular embebido em NaOH 0,5 N na córnea central por 30 s e, em seguida, retirá-lo com pinça (Figura 2C).
   3. Após a remoção do papel de filtro, enxaguar a superfície ocular com 10 mL de soro fisiológico para lavar o material alcalino.
3. Defeito epitelial corneano completo
   1. Desbridar o epitélio corneano dentro da área opacificada até a membrana de Bowman usando um removedor de anel de ferrugem corneana com uma broca de 0,5 mm (Figura 2D).
   2. Confirmar a área de desbridamento com coloração de fluoresceína sob a luz azul de Cobalto e remover o epitélio corneano residual com pinça corneana (Figura 2E).
4. Condição segura da ferida com tarsorrafia
   1. Confirme se a membrana nictitante cobre suavemente a superfície ocular e o defeito epitelial corneano no lado nasal. Certifique-se de que a membrana nictitante não esteja dobrada ou distorcida demais para interferir no processo de cicatrização de feridas e no experimento.
   2. Realizar tarsorrafia temporária, com ou sem agentes tópicos, com sutura 6-0 para proteger a superfície ocular e evitar que o coelho a coce (Figura 2F). Certifique-se de que a sutura para tarsorrafia esteja a 3-4 mm das margens superior e inferior da pálpebra, com 4-5 laços e nós mais longos para evitar que o coelho quebre as suturas.
      NOTA: Se o experimento não estiver envolvido em um estudo de antibióticos, agentes tópicos com antibióticos podem ser considerados.
   3. Neste modelo de coelho, aqueles que receberam queimadura alcalina e remoção do epitélio corneano foram considerados como grupo controle.
      NOTA: Em experimentos prospectivos, os coelhos que recebem lesão de córnea por queimadura alcalina e posteriormente tratados com agentes terapêuticos são vistos como um grupo experimental. Os coelhos que recebem apenas tratamento para queimaduras alcalinas, sem tratamento adicional, são considerados como um grupo de controle negativo.
5. Analgesia pós-operatória e controle da dor
   1. Avaliar a condição fisiológica e os níveis de dor do USDA por 7 dias após o procedimento, monitorando a dor e o sofrimento nos animais. Considerar o uso de pomada de tobramicina e uma gota de solução oftálmica de cloridrato de proparacaína a 0,5% de acordo com o resultado da avaliação. Administrar Buprenorfina HCl (0,03 mg/kg) a cada 6-8 horas por 3 dias.
      NOTA: Para medição diária da área do defeito e observação após a cirurgia, o procedimento pertence à categoria D do USDA.

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Resultados

Modelo de cicatrização ex vivo do epitélio corneano de camundongos:
Após desbridamento in vivo do epitélio corneano de camundongos com removedor manual de anel de ferrugem corneana, uma área corneana central levemente deprimida com coloração fluoresceína positiva pode ser encontrada na área central de 2 mm (Figura 3A-B). Após a colheita do globo ocular do camundongo, ele foi facilmente fixado ...

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Discussão

Modelos de lesão corneana em camundongos e coelhos fornecem uma plataforma útil ex vivo e in vivo para monitorar a cicatrização de feridas, testar novas terapêuticas e estudar mecanismos subjacentes de cicatrização de feridas e vias de tratamento. Diferentes modelos animais podem ser usados para um experimento de curto ou longo prazo, dependendo do objetivo da pesquisa. Por exemplo, depois de criar um defeito epitelial na córnea de camundongos in vivo, um defeito epitelial confinado pod...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
6/0 Ethicon vicryl suture	Ethicon	6/0VICRYL	tarsorrhaphy
Barraquer lid speculum	katena	K1-5355	15 mm
Barraquer needle holder	Katena	K6-3310	without lock
Barron Vacuum Punch 8.0 mm	katena	K20-2108	for cutting filter paper
C57BL/6 mice	National Laboratory Animal Center	RMRC11005	mouse strain
Castroviejo forceps 0.12 mm	katena	K5-2500
Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr	Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX	CHI-675	for debridement of the corneal epithelium
Filter paper	Toyo Roshi Kaisha,Ltd.	1.11
Fluorescein sodum ophthalmic strips U.S.P	OPTITECH	OPTFL100	staining for corneal epithelial defect
Ketamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	61763-23-3	intraperitoneal or intramuscular anesthetics
New Zealand White Rabbits	Livestock Research Institute, Council of Agriculture,Executive Yuan		Rabbit models
Normal saline	TAIWAN BIOTECH CO., LTD.	100-120-1101
Proparacaine	Alcon	ALC2UD09	topical anesthetics
Skin biopsy punch 2mm	STIEFEL	22650
Sodium chloride (NaOH)	Sigma-Aldrich	1310-73-2	a chemical agent for alkali burn
Stereomicroscope	Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA	SV11	microscope for surgery
Westcott Tenotomy Scissors Medium	katena	K4-3004
Xylazine hydrochloride 23.32 mg/10 mL	Elanco animal health Korea Co., LTD.	047-956	intraperitoneal or intramuscular anesthetics