Модели на животных ex vivo и in vivo для механических и химических повреждений эпителия роговицы

Резюме

Здесь модели животных, основанные на мышах и кроликах, разрабатываются для механического и химического повреждения эпителия роговицы для скрининга новых терапевтических средств и лежащего в их основе механизма.

Аннотация

Повреждение роговицы глазной поверхности, включая химический ожог и травму, может вызвать серьезные рубцы, симблефарон, дефицит лимбальных стволовых клеток роговицы и привести к большому, стойкому дефекту эпителия роговицы. Дефект эпителия с последующим помутнением роговицы и периферической неоваскуляризацией приводят к необратимым нарушениям зрения и препятствуют будущему лечению, особенно кератопластике. Поскольку животная модель может быть использована в качестве эффективной платформы для разработки лекарств, здесь разрабатываются модели повреждения роговицы у мышей и щелочного ожога эпителия роговицы кролика. Новозеландский белый кролик используется в модели щелочного ожога. Различные концентрации гидроксида натрия можно наносить на центральную круговую область роговицы в течение 30 с под внутримышечной и местной анестезией. После обильного изотонического нормального орошения физиологическим раствором остаточный рыхлый эпителий роговицы удаляли с помощью заусенцев роговицы глубоко до слоя Боумена в пределах этой круглой области. Заживление ран было задокументировано окрашиванием флуоресцеина под кобальтовым синим светом. Мышей C57BL/6 использовали в травматической модели мышиного эпителия роговицы. Центральная роговица мыши была отмечена с помощью кожного пуансона диаметром 2 мм, а затем обработана средством для удаления ржавчины роговицы с заусенцем 0,5 мм под стереомикроскопом. Эти модели могут быть проспективно использованы для проверки терапевтического эффекта глазных капель или смешанных агентов, таких как стволовые клетки, которые потенциально способствуют регенерации эпителия роговицы. Наблюдая за помутнением роговицы, периферической неоваскуляризацией и застойными явлениями конъюнктивы с помощью стереомикроскопа и программного обеспечения для визуализации, можно контролировать терапевтические эффекты на этих животных моделях.

Введение

Роговица человека состоит из пяти основных слоев и играет ключевую роль в рефракции глаза для поддержания остроты зрения и структурной целостности для защиты внутриглазных тканей¹. Самой внешней частью роговицы является эпителий роговицы, состоящий из пяти-шести слоев клеток, которые последовательно дифференцируются от базальных клеток и движутся вверх, чтобы отойти от поверхности глаза¹. По сравнению с роговицей у людей и новозеландских кроликов, роговица мыши имеет аналогичную структуру роговицы, но более тонкую периферию, чем центральная часть, из-за уменьшенной толщины эпителия и стромы². Из-за его уникального положения в глазной оптической системе многие внешние повреждения, такие как механическая травма, бактериальная инокуляция и химические агенты, могут легко поставить под угрозу целостность эпителия и в дальнейшем привести к опасному для зрения дефекту эпителия, инфекционному кератиту, расплавлению роговицы и даже перфорации роговицы.

Хотя различные терапевтические агенты, такие как смазки, антибиотики, противовоспалительные средства, аутосыворотки и амниотическая мембрана, уже использовались для улучшения реэпителизации и уменьшения рубцевания, другие потенциальные методы лечения, которые могут обеспечить заживление ран, уменьшить воспаление и подавить образование рубцов, все еще разрабатываются и тестируются на разных платформах. Были предложены различные животные модели для заживления эпителиальных ран роговицы, включая удаление эпителия роговицы с помощью кольца для удаления ржавчины роговицы у мышей с диабетом 3, линейные царапины над эпителием роговицы мыши стерильной иглой 25 G для бактериальной инокуляции⁴, удаление эпителия роговицы с помощью трепанов^с помощью средства для удаления ржавчины роговицы 5, прижигание эпителия над половиной^{роговицы} и лимба⁶ , истирание роговицы кролика с помощью трепана, вызванное притупленным лезвием^{скальпеля 7}, и повреждение роговицы крупного рогатого скота путем мгновенного замораживания в жидком азоте⁸.

Помимо механического повреждения эпителия роговицы, химические агенты также являются распространенными повреждениями поверхности глаза, особенно кислотные и щелочные агенты. Гидроксид натрия (NaOH, 0,1-1 Н в течение 30-60 с) является одним из наиболее часто используемых химических веществ в моделях химического ожога роговицы^у мышей и кроликов 9,10,11,12,13. 100% этанол также был нанесен на роговицу в модели химического ожога крысы с последующим дополнительным механическим сломом с использованием хирургического лезвия¹⁴. Поскольку поддержание здоровой поверхности глаза зависит от функциональных единиц, включая веки, мейбомиевые железы, слезную систему, конъюнктиву и роговицу, животные модели in vivo имеют некоторые преимущества перед культивируемыми эпителиальными клетками роговицы ex vivo или тканями роговицы. В этой статье демонстрируется мышиная модель ссадины роговицы и модель кролика щелочного ожога роговицы.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все экспериментальные процедуры в исследованиях на животных были одобрены Комитетом по этике исследований в Мемориальной больнице Чанг Гун и соответствовали заявлению ARVO для использования животных в офтальмологических и офтальмологических исследованиях.

1. Модель заживления ран эпителия роговицы мыши ex vivo

1. Подготовка мышей
   1. Вводят общую анестезию мышам C57BL / 6 путем внутрибрюшинной доставки гидрохлорида кетамина (80-100 мг / кг массы тела) и ксилазина (5-10 мг / кг массы тела).
   2. Убедитесь, что общая анестезия работает, подтвердив потерю движения перед вредным стимулом и потерю рефлекса выпрямления у мышей.
   3. Зафиксируйте голову мыши рукой и примените местную анестезию к обоим глазам одной каплей 0,5% офтальмологического раствора пропаракаина гидрохлорида (рис. 1А). Трижды продезинфицируйте глазную поверхность и веки 5% бетадином.
2. Создание модели эпителиальной раны роговицы мыши
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие процедуры под стереомикроскопом. Рана роговицы была создана in vivo, а не ex vivo, чтобы лучше манипулировать глазным яблоком и приближать его к реальной ситуации. Это конечная процедура; Поэтому требуются только чистые инструменты (не стерильная техника).
   1. Отметьте центральную роговицу мыши с помощью пуансона биопсии кожи (диаметром 2 мм), чтобы подтвердить хорошо очерченную и хорошо измеримую область раны.
   2. Аккуратно вдавите перфоратор на центральную роговицу, чтобы оставить круговую отметку (рис. 1B). Используя ручное кольцо для удаления ржавчины роговицы с заусенцем 0,5 мм, удалите эпителий роговицы до слоя Боумена, чтобы не повредить последний (рис. 1C). Удалите остаточные, рыхлые ткани внутри края раны с помощью щипцов роговицы.
   3. Подтвердите область санации флуоресцеиновым окрашиванием (рис. 1D). Чтобы выполнить окрашивание флуоресцеином, нанесите каплю нормального физиологического раствора на флуоресцеиновую бумагу, чтобы растворить флуоресцеин, а затем поместите каплю, содержащую флуоресцеин, на дефект эпителия мыши, чтобы визуализировать его под синим светом кобальта.
3. Культура ex vivo модели ссадины роговицы мыши.
   1. Для заготовки мышиных глазных яблок действуйте следующим образом.
   2. Принесите мышей в жертву вывихом шейки матки после индуцирования анестезии 5% изофлураном в индукционной камере. Убедитесь, что анестезия работает, подтвердив потерю движения из-за вредного стимула и потерю рефлекса выпрямления у мышей.
   3. Аккуратно надавите кончиком щипцов на верхний и нижний края орбиты, чтобы вытолкнуть глазное яблоко. Введите кончик закрытых ножниц роговицы в ретробульбарное пространство вдоль нижней орбитальной стенки, следя за тем, чтобы он не проник в глазное яблоко.
   4. Держите глазное яблоко неподвижно с помощью щипцов роговицы 0,3 мм, а затем отрежьте зрительный нерв и периорбитальные мягкие ткани ножницами роговицы, чтобы изолировать глазное яблоко.
   5. Для культивирования глазных яблок мышей ex vivo действуйте следующим образом.
   6. Подготовьте 48-луночную пластину с расплавленным воском внутри лунки и дождитесь застывания. Кончиком щипцов конъюнктивы создайте на поверхности застывшего воска круглое отверстие для размещения глазных яблок.
   7. Поместите собранные глазные яблоки непосредственно на 48-луночную пластину (рис. 1E) с покрытыми воском дном и боковыми стенками, чтобы установить стабилизацию (рис. 1F).
   8. Культивируйте глазные яблоки с помощью модифицированной орлиной среды (DMEM) Дульбекко, содержащей 1% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), в увлажненной атмосфере 5% CO₂ при 37 ° C с антибиотиками или без них, в зависимости от цели исследования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если модель используется для изучения заживления эпителиальных ран роговицы, для предотвращения инфекции потребуются антибиотики. Однако, если эта модель используется для оценки эффективности антибиотиков или смешанных агентов, профилактические антибиотики не потребуются.
   9. Погрузите поверхность глаза в питательную среду, не вызывая всплытия глазного яблока.
   10. Задокументируйте ход заживления ран с помощью флуоресцеинового окрашивания (этап 1.2.3) и сбора фотографий с помощью цифровой камеры под кобальтовым синим светом.
       ПРИМЕЧАНИЕ: В проспективных экспериментах с моделями механического повреждения роговицы на мышах те, кто получал истирание роговицы и был дополнительно протестирован на эффективность терапевтических агентов, рассматриваются как экспериментальная группа, а те, кто получает истирание роговицы без дальнейшего лечения, рассматриваются как отрицательная контрольная группа.

2. Модель кролика in vivo щелочной травмы роговицы

ПРИМЕЧАНИЕ: В этой модели индуцируется травма от щелочного ожога с последующей механической обработкой эпителия роговицы для создания четко определенной и ровной области раны для последующей количественной оценки. Стерилизуйте все инструменты перед использованием.

1. Подготовка кролика с предоперационной анальгезией, включая внутримышечное введение системных анальгетиков и глазных капель для местного применения.
   1. Вводят общую анестезию новозеландским белым кроликам путем внутримышечной инъекции гидрохлорида кетамина (35-44 мг / кг массы тела), смешанного с ксилазином (5-10 мг / кг массы тела) на заднюю ногу.
   2. Расположив кролика и накрыв его полотенцем, нанесите местную анестезию на правый глаз каплей 0,5% офтальмологического раствора пропаракаина гидрохлорида (рис. 2А) под стереомикроскопом. Трижды продезинфицируйте глазную поверхность и веки 5% бетадином.
2. Индуцирование щелочного ожога роговицы
   1. Поместите круглую фильтровальную бумагу диаметром 8 мм (разрезанную перфоратором 8 мм) в чашку Петри. С помощью пипетки добавьте 0,5 Н гидроксида натрия (NaOH) в чашку Петри, чтобы пропитать фильтровальную бумагу. Слейте излишки раствора NaOH с фильтровальной бумаги, прежде чем помещать их на роговицу кролика.
      ВНИМАНИЕ: 0,5 N NaOH может вызвать серьезное эрозивное повреждение тканей человека. При работе надевайте перчатки. Если кожа или глаза вступают в контакт с каплями NaOH, требуется орошение обильным количеством физиологического раствора и медицинская помощь, чтобы уменьшить дальнейшее повреждение.
   2. Открыв веки зеркалом век и убедившись, что мигательная мембрана кролика не препятствует введению фильтровальной бумаги (рис. 2B), поместите круглую фильтровальную бумагу, пропитанную 0,5 N NaOH, на центральную роговицу на 30 с, а затем удалите ее щипцами (рис. 2C).
   3. После удаления фильтровальной бумаги промойте поверхность глаза 10 мл физиологического раствора, чтобы смыть щелочной материал.
3. Завершение дефекта эпителия роговицы
   1. Удалите эпителий роговицы в пределах ушедшей области до мембраны Боумена с помощью кольца для удаления ржавчины роговицы с заусенцем 0,5 мм (рис. 2D).
   2. Подтвердите область санации флуоресцеиновым окрашиванием под кобальтовым синим светом и удалите остаточный эпителий роговицы с помощью щипцов роговицы (рис. 2E).
4. Надежное состояние раны при тарзорафии
   1. Убедитесь, что мигательная мембрана плавно покрывает глазную поверхность и дефект эпителия роговицы со стороны носа. Следите за тем, чтобы мигательная мембрана не была сложена или искажена слишком сильно, чтобы помешать процессу заживления ран и эксперименту.
   2. Выполните временную тарзорафию с местными средствами или без них, используя шов 6-0, чтобы защитить глазную поверхность и предотвратить ее расчесывание кроликом (рис. 2F). Убедитесь, что шов при тарзорафии находится на расстоянии 3-4 мм от краев верхнего и нижнего века с 4-5 завязками и более длинными узлами, чтобы кролик не разорвал швы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если эксперимент не связан с исследованием антибиотиков, можно рассмотреть возможность применения местных препаратов с антибиотиками.
   3. В этой модели кроликов те, кто получил щелочной ожог и удаление эпителия роговицы, рассматривались как контрольная группа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В проспективных экспериментах кролики, получившие повреждение роговицы от ожога щелочью и дополнительно обработанные терапевтическими средствами, рассматриваются как экспериментальная группа. Кролики, получающие только щелочную обработку от ожогов, без дополнительной обработки, рассматриваются как отрицательная контрольная группа.
5. Послеоперационная анальгезия и обезболивание
   1. Оцените физиологическое состояние и уровень боли USDA в течение 7 дней после процедуры, наблюдая за болью и дистрессом у животных. Рассмотрите возможность использования мази тобрамицина и одной капли 0,5% офтальмологического раствора пропаракаина гидрохлорида в зависимости от результата оценки. Вводите бупренорфин гидрохлорид (0,03 мг / кг) каждые 6-8 часов в течение 3 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для ежедневного измерения площади дефекта и наблюдения после операции процедура относится к категории D Министерства сельского хозяйства США.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Модель заживления ран эпителия роговицы мыши ex vivo:
После обработки эпителия роговицы мыши in vivo ручным средством для удаления ржавчины роговицы в центральной области 2 мм можно обнаружить слегка вдавленную центральную область роговицы с положительным флу?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Мышиные и кроличьи модели повреждения роговицы обеспечивают полезную платформу ex vivo и in vivo для мониторинга заживления ран, тестирования новых терапевтических средств и изучения основных механизмов заживления ран и путей лечения. Различные модели животных могут быть использ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
6/0 Ethicon vicryl suture	Ethicon	6/0VICRYL	tarsorrhaphy
Barraquer lid speculum	katena	K1-5355	15 mm
Barraquer needle holder	Katena	K6-3310	without lock
Barron Vacuum Punch 8.0 mm	katena	K20-2108	for cutting filter paper
C57BL/6 mice	National Laboratory Animal Center	RMRC11005	mouse strain
Castroviejo forceps 0.12 mm	katena	K5-2500
Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr	Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX	CHI-675	for debridement of the corneal epithelium
Filter paper	Toyo Roshi Kaisha,Ltd.	1.11
Fluorescein sodum ophthalmic strips U.S.P	OPTITECH	OPTFL100	staining for corneal epithelial defect
Ketamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	61763-23-3	intraperitoneal or intramuscular anesthetics
New Zealand White Rabbits	Livestock Research Institute, Council of Agriculture,Executive Yuan		Rabbit models
Normal saline	TAIWAN BIOTECH CO., LTD.	100-120-1101
Proparacaine	Alcon	ALC2UD09	topical anesthetics
Skin biopsy punch 2mm	STIEFEL	22650
Sodium chloride (NaOH)	Sigma-Aldrich	1310-73-2	a chemical agent for alkali burn
Stereomicroscope	Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA	SV11	microscope for surgery
Westcott Tenotomy Scissors Medium	katena	K4-3004
Xylazine hydrochloride 23.32 mg/10 mL	Elanco animal health Korea Co., LTD.	047-956	intraperitoneal or intramuscular anesthetics