Purificación de los canales potenciales del receptor transitorio de Drosophila endógeno

Resumen

Basado en el mecanismo de ensamblaje del complejo de proteínas INAD, en este protocolo, se desarrolló una estrategia modificada de purificación de afinidad más competencia para purificar el canal endógeno Drosophila TRP.

Resumen

La fototransducción de Drosophila es una de las vías de señalización acopladas a proteínas G más rápidas conocidas. Para asegurar la especificidad y eficiencia de esta cascada, el canal catiónico permeable al calcio (Ca²⁺), el potencial del receptor transitorio (TRP), se une estrechamente a la proteína del andamio, inactivación-no-post-potencial D (INAD), y forma un gran complejo proteico de señalización con proteína quinasa C específica del ojo (ePKC) y potencial del receptor de fosfolipasa Cβ/No A (PLCβ/NORPA). Sin embargo, las propiedades bioquímicas del canal TRP de Drosophila siguen sin estar claras. Basado en el mecanismo de ensamblaje del complejo de proteínas INAD, se desarrolló una estrategia modificada de purificación de afinidad más competencia para purificar el canal endógeno TRP. Primero, el fragmento NORPA 863-1095 marcado con histidina purificada (His) se unió a cuentas de Ni y se usó como cebo para derribar el complejo endógeno de proteína INAD de los homogeneizados de la cabeza de Drosophila. Luego, se agregó un fragmento excesivo de glutatión S-transferasa purificada (GST) marcado con TRP 1261-1275 a las cuentas de Ni para competir con el canal TRP. Finalmente, el canal TRP en el sobrenadante se separó del péptido TRP 1261-1275 excesivo mediante cromatografía de exclusión de tamaño. Este método permite estudiar el mecanismo de cierre del canal TRP de Drosophila desde ángulos bioquímicos y estructurales. Las propiedades electrofisiología de los canales TRP de Drosophila purificados también se pueden medir en el futuro.

Introducción

La fototransducción es un proceso en el que los fotones absorbidos se convierten en códigos eléctricos de las neuronas. Transmite exclusivamente opsinas y la siguiente cascada de señalización acoplada a proteína g tanto en vertebrados como en invertebrados. En Drosophila, mediante el uso de sus cinco dominios PDZ, la inactivación de la proteína de andamio-no-después del potencial D (INAD) organiza un complejo de señalización supramolecular, que consiste en un canal de potencial de receptor transitorio (TRP), potencial de receptor de fosfolipasa Cβ/No A (PLCβ/NORPA) y proteína quinasa C específica del ojo (ePKC)¹. La formación de este complejo de señalización supramolecular garantiza la correcta localización subcelular, alta eficiencia y especificidad de la maquinaria de fototransducción Drosophila. En este complejo, los canales TRP sensibles a la luz actúan como efectores aguas abajo de NORPA y median la afluencia de calcio y la despolarización de los fotorreceptores. Estudios previos mostraron que la apertura del canal TRP de Drosophila está mediada por protones, interrupción del entorno lipídico local o fuerza mecánica ^2,3,4. El canal TRP de Drosophila también interactúa con la calmodulina⁵ y es modulado por el calcio por retroalimentación positiva y negativa ^6,7,8.

Hasta ahora, los estudios de electrofisiología sobre el mecanismo de cierre de los canales TRP de Drosophila y TRP-like (TRPL) se basaron en parches de membrana extirpados, registros de células enteras de fotorreceptores disociados de Drosophila de tipo silvestre y canales heteroexpresados en células S2, SF9 o HEK 2,9,10,11,12,13, pero no en canales purificados. La información estructural del canal TRP de Drosophila de longitud completa tampoco está clara. Para estudiar las propiedades electrofisiológicas de la proteína purificada en un entorno de membrana reconstituida y obtener información estructural del canal TRP de Drosophila de longitud completa, la obtención de canales TRP de longitud completa purificados es el primer paso necesario, similar a las metodologías utilizadas en los estudios de canales de TRP de mamíferos 14,15,16,17.

Recientemente, sobre la base del mecanismo de ensamblaje del complejo de proteínas INAD 18,19,20, se desarrolló por primera vez una estrategia de purificación de afinidad más competencia para purificar el canal TRP de los homogeneizados de la cabeza de Drosophila mediante perlas de estreptavidina 5. Teniendo en cuenta la baja capacidad y el costoso costo de las perlas de estreptavidina, aquí se introduce un protocolo de purificación mejorado que utiliza proteína de cebo marcada con His y las correspondientes perlas de Ni de bajo costo con una capacidad mucho mayor. El método propuesto ayudará a estudiar el mecanismo de cierre del canal TRP desde ángulos estructurales y a medir las propiedades electrofisiológicas del canal TRP con proteínas purificadas.

Protocolo

1. Purificación de fragmentos de TRP etiquetados con GST y NORPA con su etiqueta

1. Purificar el fragmento TRP 1261-1275 etiquetado con GST
   1. Transformar el plásmido pGEX 4T-1 TRP 1261-1275¹⁰ en células de Escherichia coli (E. coli) BL21 (DE3) utilizando el método de transformación de choque térmico CaCl₂ ²¹. Inocular una sola colonia en 10 mL de Luria Bertani (LB) mediana y crecer durante la noche a 37 °C. Luego, amplifique los 10 ml de cultivo de siembra en 1 L de LB medio a 37 ° C.
   2. Después de que la densidad óptica (OD₆₀₀) de las células alcance 0.5, enfríe las células a 16 ° C y agregue 0.1 mM de isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG; concentración final) para inducir la sobreexpresión de la proteína objetivo e incube a 16 ° C durante 18 h.
   3. Después de la sobreexpresión, pellet 1 L de células cultivadas por centrifugación a 3.993 × g durante 20 min y resuspend en 40 mL de tampón salino tamponado con fosfato (PBS).
   4. Cargue las celdas resuspendidas en un homogeneizador de alta presión preenfriado a 4 °C. Aumente lentamente la presión del homogeneizador a 800 bar. Abra el grifo de entrada y deje que las celdas resuspendidas pasen circularmente a través de una válvula con ranuras muy estrechas.
      NOTA: Las células están homogeneizadas por las altas fuerzas de cizallamiento causadas por una gran caída de presión y cavitación.
   5. Cargue 5 ml de perlas de glutatión en una columna de flujo por gravedad y lave las perlas con 50 ml de tampón PBS para un total de tres veces.
   6. Centrifugar el lisado celular del homogeneizador de alta presión a 48.384 x g. Añadir el sobrenadante del lisado centrifugado de células (40 ml) a las perlas de glutatión equilibradas en la columna de flujo de gravedad e incubar durante 30 min a 4 °C. Resuspend las cuentas de glutatión cada 10 min.
   7. Después de 30 minutos de incubación, abra el grifo de salida de la columna para separar las perlas y la fracción de flujo. Descarte la fracción de flujo continuo. Enjuague las perlas de glutatión restantes dos veces con 50 ml de tampón PBS.
   8. Agregue 15 ml de tampón de elución a las cuentas de glutatión e incube durante 30 min. Resuspendir las cuentas cada 10 min.
   9. Después de 30 min de incubación, eluya el fragmento TRP 1261-1275 marcado con GST en un tubo cónico de 50 ml y cargue en una columna de exclusión de tamaño (grado de preparación), que se equilibra utilizando un tampón Tris de 50 mM (pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM TDT).
   10. Mantenga el caudal de elución de la columna de exclusión de tamaño a 3 ml/min. Recoger las proteínas eluidas a razón de 5 ml/tubo.
   11. Identificar el pico de la proteína diana en la columna de exclusión de tamaño analizando las señales de absorción UV a 280 nm y verificar mediante análisis de gel SDS-PAGE (parámetros de electroforesis: 150 V para el gel de apilamiento; 200 V para el gel de resolución). Mancha el gel con Coomassie azul R250.
   12. Concentre el fragmento purificado de TRP 1261-1275 marcado con GST de la columna de exclusión de tamaño a 1 ml utilizando una columna de espín de ultrafiltración de 15 ml centrifugada a 3.000 x g a 4 °C en una centrífuga refrigerada de escritorio.
   13. Determinar la concentración de proteína concentrada utilizando la Ley de Beer-Lambert. Mida la absorción UV del fragmento TRP 1261-1275 marcado con GST a 280 nm utilizando un espectrofotómetro.
   14. Obtener el coeficiente de extinción a 280 nm importando las secuencias de proteínas en el programa Protparam (https://web.expasy.org/protparam/). Típicamente, el cultivo de 1 L de TRP 1261-1275 marcado con GST produce 1 mL de 600 μM de proteína (6 x ^10-7 mol). Consulte la Tabla 1 para los materiales necesarios.
2. Purificación del fragmento NORPA 863-1095 etiquetado con His
   1. Transformar el plásmido pETM.3C NORPA 863-1095²⁰ en células de E. coli BL21 (DE3) utilizando el método de transformación de choque térmico CaCl^{2 21}. Inocular una sola colonia en 10 mL de LB medio y crecer durante la noche a 37 °C. Luego, amplifique el cultivo de siembra de 10 ml en 1 L de LB medio a 37 ° C.
   2. Después de que el OD₆₀₀ de las células alcance 0.5, enfríe las células a 16 ° C y agregue 0.1 mM IPTG (concentración final) para inducir la sobreexpresión de la proteína objetivo e incubar a 16 ° C durante 18 h.
   3. Después de la sobreexpresión, pellet 1 L de células cultivadas por centrifugación a 3.993 x g durante 20 min y resuspend en 40 mL de tampón de unión. A continuación, lise las células resuspendidas en un homogeneizador de alta presión a 4 °C como se describe en el paso 1.1.4.
   4. Cargue 5 ml de perlas de Ni en una columna de flujo por gravedad y lave tres veces con 50 ml de tampón de unión.
   5. Centrifugar el lisado celular del homogeneizador de alta presión a 48.384 x g. Añadir el sobrenadante del lisado centrifugado a las perlas de Ni equilibradas en la columna de flujo de gravedad e incubar durante 30 min a 4 °C. Resuspend las cuentas de Ni cada 10 min.
   6. Después de 30 minutos de incubación, abra el grifo de salida de la columna para separar las perlas y la fracción de flujo. Deseche la fracción de flujo continuo y lave las perlas de Ni restantes dos veces con 50 ml de tampón de lavado.
   7. Agregue 15 ml de tampón de elución a las perlas de Ni e incube durante 30 min. Resuspend las cuentas de Ni cada 10 min.
   8. Después de 30 min de incubación, recoja el fragmento NORPA 863-1095 eluido con etiqueta His en un tubo cónico de 50 ml y cárguelo en una columna de exclusión de tamaño (grado de preparación), que se equilibra utilizando 50 mM Tris (pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM TDT).
   9. Mantenga el caudal de elución de la columna de exclusión de tamaño a 3 ml/min. Recoger la proteína eluida a razón de 5 ml/tubo.
   10. Identificar el pico de la proteína diana en la columna de exclusión de tamaño analizando las señales de absorción UV a 280 nm y verificar mediante análisis de gel SDS-PAGE (parámetros de electroforesis: 150 V para el gel de apilamiento; 200 V para el gel de resolución). Mancha el gel usando Coomassie blue R250.
   11. Concentre el fragmento norpa 863-1095 purificado de la columna de exclusión de tamaño a 1 ml utilizando una columna de espín de ultrafiltración de 15 ml centrifugada a 3.000 x g a 4 °C en una centrífuga refrigerada de escritorio.
   12. Determinar la concentración de proteína concentrada utilizando la Ley de Beer-Lambert. Mida la absorción UV del fragmento NORPA 863-1095 marcado con His a 280 nm utilizando un espectrofotómetro.
   13. Obtener el coeficiente de extinción a 280 nm importando las secuencias de proteínas en el programa Protparam (https://web.expasy.org/protparam/). Típicamente, 1 L de cultivo de fragmento NORPA 863-1095 marcado con His produce 1 mL de 600 μM de proteína (6 x ^10-7 mol). Consulte la Tabla 2 para los materiales necesarios.

2. Preparación de cabezas de Drosophila

1. Recolectar moscas adultas en tubos de centrifugación cónica de 50 ml utilizando el método de anestesia de CO₂ ^22,23; congelar inmediatamente en nitrógeno líquido durante 10 min y almacenar en un congelador de -80°C.
2. Después de recolectar un número suficiente de moscas, agite vigorosamente los tubos cónicos congelados de 50 ml a mano para separar las patas, cabezas, alas y cuerpos de las moscas. Transfiera la mezcla a tres tamices de acero inoxidable preenfriados apilados secuencialmente (tamaño de malla 20/30/40, respectivamente) y agite los tamices.
3. A continuación, dado que las cabezas no pueden pasar a través del tamiz de 40 mallas, use un cepillo para barrer las cabezas de las moscas del tamiz de 40 mallas, transfiéralas a tubos cónicos de 50 ml y guárdelas a -80 ° C.
4. Recoger continuamente las moscas y sus cabezas y almacenarlas en un congelador de -80 °C hasta que alcancen la cantidad requerida necesaria para la experimentación (0,5 g). Por lo general, para recolectar 0,5 g de cabezas, se necesitan 35 ml de moscas en un tubo cónico de 50 ml. Consulte la Tabla 3 para los materiales necesarios.

3. Purificación del canal TRP de Drosophila

1. Pesar un total de 0,5 g de cabezales y homogeneizar completamente en nitrógeno líquido utilizando un mortero preenfriado. Disolver los cabezales homogeneizados en tampón de lisis 10x v/w (5 mL), incubar en un agitador a 4 °C durante 20 min, y luego centrifugar a 20.817 x g durante 20 min a 4 °C.
2. Recoge el sobrenadante spin-down ("20817 g S", Figura 4) y centrífugalo aún más a 100.000 x g durante 60 min a 4 °C. Utilice el sobrenadante spin-down ("100.000 g S", Figura 4) para el siguiente ensayo desplegable.
3. Agregue 1 ml de perlas de Ni en la columna de flujo de gravedad y lave las perlas con 10 ml de H₂O (ddH 2 O) de doble destilación a 4° C para un total de tres veces. Equilibre las cuentas con 10 volúmenes de columna de tampón de lisis tres veces a 4 °C.
4. Añadir 500 μL de proteína NORPA 863-1095 purificada con 600 μM (3 x ^10-7 mol) en la columna de Ni e incubar durante 30 min a 4 °C. Resuspendir las cuentas cada 10 min.
5. Abra el grifo de salida de la columna para separar las perlas y la fracción de flujo. Tome la fracción de flujo continuo para el análisis SDS-PAGE (NORPA F, Figura 4). En esta sección, las proteínas de cebo se inmovilizan en las perlas de Ni.
6. Lave las perlas de Ni con 10 volúmenes de columna de tampón de lisis (10 ml) a 4 °C y mantenga la fracción de lavado para el análisis SDS-PAGE (Lavado 1, Figura 4A). Repita los pasos anteriores y guarde la muestra para el análisis SDS-PAGE (Lavado 2, Figura 4A). En esta sección, se eliminan las proteínas de cebo excesivas en las perlas de Ni.
7. Añadir el sobrenadante del homogeneizado de cabeza de Drosophila después de una centrifugación de 100.000 x g en la columna de Ni a 4 °C, donde se ha inmovilizado el fragmento NORPA 863-1095 marcado con His.
8. Incubar el sobrenadante con las perlas de Ni a 4 °C durante 30 min. Resuspendir las cuentas cada 10 min. Luego, abra el grifo de salida de la columna para separar las cuentas y la fracción de flujo.
9. Recoger el sobrenadante para el análisis SDS-PAGE (Lisis F de la cabeza de Dro, Figura 4A). En esta sección, los complejos de proteínas INAD (INAD/TRP/ePKC) en los homogeneizados de la cabeza son capturados por los fragmentos inmovilizados de NORPA 863-1095 en las perlas de Ni.
10. Lave las perlas de Ni con 10 volúmenes de columna de tampón de lisis (10 ml) a 4 °C y mantenga el sobrenadante de la precipitación por gravedad para el análisis SDS-PAGE (Lavado 3, Figura 4A). Repita los pasos anteriores y recoja el sobrenadante para el análisis SDS-PAGE (Lavado 4, Figura 4A). En esta sección, se eliminan las proteínas no unidas en las perlas de Ni.
11. Añadir 500 μL de 600 μM de proteína TRP 1261-1275 marcada con GST (3 x ^10-7 mol) en las perlas de Ni e incubar durante 20 min a 4 °C. Resuspendir las cuentas cada 10 min.
12. Recoja la fracción eluida de la columna de gravedad (TRP E1, Figura 4B), que contiene el canal endógeno Drosophila TRP. Repita los pasos anteriores y recoja la fracción de elución (PRT E2, Figura 4B). En este paso, al utilizar los fragmentos TRP 1261-1275 etiquetados con GST como competidor, los canales TRP se eluyen de los complejos de proteínas INAD capturados (INAD / TRP / ePKC) en las cuentas de Ni.
13. Lavar las perlas de Ni con 10 volúmenes de columna de tampón de unión (10 ml; Tabla 1) a 4 °C y recoger la fracción de lavado para el análisis SDS-PAGE (Lavado 5, Figura 4B).
14. Añadir 500 μL de tampón de elución (Tabla 1) en las perlas de Ni e incubar durante 20 min a 4 °C. Recoger la fracción de elución de la columna de flujo de gravedad (NORPA E1, Figura 4B). Repita los pasos anteriores y recoja la fracción de elución (NORPA E2, Figura 4B).
15. Usando el tampón de elución, elute el fragmento NORPA 863-1095 marcado con His acompañado de los complejos de proteínas INAD/ePKC. A continuación, resuspend las perlas de Ni en 500 μL de tampón de unión.
16. Tome las perlas de Ni resuspendidas para ejecutar el SDS-PAGE (teñido por coomassie azul R250) para analizar la eficiencia de la elución y evaluar si el tampón eluye (perlas, Figura 4B). Consulte la Tabla 4 para los materiales necesarios.

4. Purificación de la columna de exclusión de tamaño del canal TRP de Drosophila

1. Instale una columna de exclusión de tamaño (grado analítico) en el sistema de purificación de proteínas. Equilibrar la columna con el tampón de columna (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, 0.75 mM DDM), que se filtra mediante un filtro de 0.45 μm.
2. Concentre la fracción TRP E1 y E2 del paso 3.14 utilizando una columna de espín de ultrafiltración de 4 ml, centrifugada a 3.000 x g a 4 °C en una centrífuga refrigerada.
3. Enjuague el bucle de muestra con el búfer de columna y cargue la muestra en el bucle de muestra. Inyecte la muestra en la columna de exclusión de tamaño y eluya las proteínas con un caudal adecuado (0,5 ml/min).
4. Identifique el pico de la proteína objetivo por absorción a 280 nm y ejecute un gel SDS-PAGE para detectar el canal endógeno purificado de Drosophila TRP (Figura 5). Consulte la Tabla 5 para los materiales necesarios.

Resultados

En este artículo, se demuestra un método de purificación de proteínas para purificar el canal endógeno de Drosophila TRP (Figura 1).

En primer lugar, se aplica la expresión y purificación de proteínas recombinantes para obtener las proteínas de cebo y de la competencia. Luego, un fragmento de TRP 1261-1275 marcado con GST se expresa en células de E. coli BL21 (DE3) en medio LB y se purifica utilizando perlas de glutatión y una columna ...

Discusión

INAD, que contiene cinco dominios PDZ, es el organizador central de la maquinaria de fototransducción Drosophila. Estudios previos demostraron que INAD PDZ3 se une a la cola terminal C del canal TRP con una especificidad exquisita (K_D = 0,3 μM)¹⁸. El tándem INAD PDZ45 interactúa con el fragmento NORPA 863-1095 con una afinidad de unión extremadamente alta (K_D = 30 nM). Estos hallazgos proporcionan una base bioquímica sólida para diseñar la estrategia de purif...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacterial strains
BL21(DE3) Competent Cells	Novagen	69450	Protein overexpression
Experiment models
D.melanogaster: W1118 strain	Bloomington Drosophila Stock Center	BDSC:3605	Drosophila head preparation
Material
20/30/40 mesh stainless steel sieves	Jiufeng metal mesh company	GB/T6003.1	Drosophila head preparation
30% Acrylamide-N,N′-Methylenebisacrylamide(29:1)	Lablead	A3291	SDS-PAGE gel preparation
Ammonium Persulfate	Invitrogen	HC2005	SDS-PAGE gel preparation
Cocktail protease inhibitor	Roche	05892953001	Protease inhibitor
Coomassie brilliant blue R-250	Sangon Biotech	A100472-0025	SDS-PAGE gel staining
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sangon Biotech	A620058-0100	Size-exclusion column buffer preparation
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA)	Sangon Biotech	A500838-0500	Size-exclusion column buffer preparation
Glycine	Sangon Biotech	A610235-0005	SDS-PAGE buffer preparation
Glutathione Sepharose 4 Fast Flow beads	Cytiva	17513202	Affinity chromatography
Imidazole	Sangon Biotech	A500529-0001	Elution buffer preparation for Ni-column
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sangon Biotech	A600168-0025	Induction of protein overexpression
LB Broth Powder	Sangon Biotech	A507002-0250	E.coli. cell culture
L-Glutathione reduced (GSH)	Sigma-aldrich	G4251-100G	Elution buffer preparation for Glutathione beads
Ni-Sepharose excel beads	Cytiva	17371202	Affinity chromatography
N-Dodecyl beta-D-maltoside (DDM)	Sangon Biotech	A610424-001	Detergent for protein purification
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma-aldrich	T9281-100ML	SDS-PAGE gel preparation
PBS	Sangon Biotech	E607008-0500	Homogenization buffer for E.coli. cell
PMSF	Lablead	P0754-25G	Protease inhibitor
Prestained protein marker	Thermo Scientific	26619/26616	Prestained protein ladder
Size exclusion column (preparation grade)	Cytiva	28989336	HiLoad 26/60 Superdex 200 PG column
Size exclusion column (analytical grade)	Cytiva	29091596	Superose 6 Increase 10/300 GL column
Sodium chloride	Sangon Biotech	A501218-0001	Protein purification buffer preparation
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sangon Biotech	A500228-0001	SDS-PAGE gel/buffer preparation
Tris base	Sigma-aldrich	T1503-10KG	Protein purification buffer preparation
Ultrafiltration spin column	Millipore	UFC901096/801096	Protein concentration
Equipment
Analytical Balance	DENVER	APX-60	Metage of Drosophila head
Desk-top high-speed refrigerated centrifuge for 15mL and 50mL conical centrifugation tubes	Eppendorf	5810R	Protein concentration
Desk-top high-speed refrigerated centrifuge 1.5mL centrifugation tubes	Eppendorf	5417R	Centrifugation of Drosophila head lysate after homogenization
Empty gravity flow column (Inner Diameter=1.0cm)	Bio-Rad	738-0015	TRP protein purification
Empty gravity flow column (Inner Diameter=2.5cm)	Bio-Rad	738-0017	Bait and competitor protein purification from E.coli.
Gel Documentation System	Bio-Rad	Universal Hood II Gel Doc XR System	SDS-PAGE imaging
High-speed refrigerated centrifuge	Beckman coulter	Avanti J-26 XP	Centrifugation of E.coli. cells/cell lysate
High pressure homogenizer	UNION-BIOTECH	UH-05	Homogenization of E.coli. cells
Liquid nitrogen tank	Taylor-Wharton	CX-100	Drosophila head preparation
Protein purification system	Cytiva	AKTA purifier	Protein purification
Refrigerator (-80°C)	Thermo	900GP	Drosophila head preparation
Spectrophotometer	MAPADA	UV-1200	OD600 measurement of E.coli. cells
Spectrophotometer	Thermo Scientific	NanoDrop 2000c	Determination of protein concentration
Ultracentrifuge	Beckman coulter	Optima XPN-100 Ultracentrifuge	Ultracentrifugation