Endojen Drosophila Geçici Reseptör Potansiyel Kanallarının Saflaştırılması

Özet

INAD protein kompleksinin montaj mekanizmasına dayanarak, bu protokolde, endojen Drosophila TRP kanalını saflaştırmak için modifiye edilmiş bir afinite saflaştırma artı rekabet stratejisi geliştirilmiştir.

Özet

Drosophila fototransdüksiyonu, bilinen en hızlı G proteinine bağlı sinyal yollarından biridir. Bu kaskadının özgüllüğünü ve verimliliğini sağlamak için, kalsiyum (Ca²⁺)-geçirgen katyon kanalı, geçici reseptör potansiyeli (TRP), iskele proteinine sıkıca bağlanır, inaktivasyon-sonrası-potansiyel D (INAD) ve göze özgü protein kinaz C (ePKC) ve fosfolipaz Cβ / No reseptör potansiyeli A (PLCβ / NORPA) ile büyük bir sinyal protein kompleksi oluşturur. Bununla birlikte, Drosophila TRP kanalının biyokimyasal özellikleri belirsizliğini korumaktadır. INAD protein kompleksinin montaj mekanizmasına dayanarak, endojen TRP kanalını saflaştırmak için modifiye edilmiş bir afinite saflaştırma artı rekabet stratejisi geliştirilmiştir. İlk olarak, saflaştırılmış histidin (His) etiketli NORPA 863-1095 fragmanı Ni-boncuklara bağlandı ve endojen INAD protein kompleksini Drosophila kafa homojenatlarından aşağı çekmek için yem olarak kullanıldı. Daha sonra, TRP kanalı ile rekabet etmek için Ni-boncuklara aşırı saflaştırılmış glutatyon S-transferaz (GST) etiketli TRP 1261-1275 parçası eklendi. Son olarak, süpernatanttaki TRP kanalı, boyut dışlama kromatografisi ile aşırı TRP 1261-1275 peptidinden ayrıldı. Bu yöntem, Drosophila TRP kanalının geçit mekanizmasını hem biyokimyasal hem de yapısal açılardan incelemeyi mümkün kılar. Saflaştırılmış Drosophila TRP kanallarının elektrofizyoloji özellikleri gelecekte de ölçülebilir.

Giriş

Fototransdüksiyon, emilen fotonların nöronların elektriksel kodlarına dönüştürüldüğü bir süreçtir. Sadece opsinleri ve aşağıdaki G proteinine bağlı sinyal kaskadını hem omurgalılarda hem de omurgasızlarda iletir. Drosophila'da, beş PDZ alanını kullanarak, iskele proteini inaktivasyonu-sonrası-sonrası-potansiyel D (INAD), geçici bir reseptör potansiyeli (TRP) kanalı, fosfolipaz Cβ / No reseptör potansiyeli A (PLCβ / NORPA) ve göze özgü protein kinaz C (ePKC) ^1'den oluşan bir supramoleküler sinyal kompleksi düzenler. Bu supramoleküler sinyal kompleksinin oluşumu, Drosophila fototransdüksiyon makinelerinin doğru hücre altı lokalizasyonunu, yüksek verimliliğini ve özgüllüğünü garanti eder. Bu komplekste, ışığa duyarlı TRP kanalları, NORPA'nın aşağı akış efektörleri olarak işlev görür ve kalsiyum akışına ve fotoreseptörlerin depolarizasyonuna aracılık eder. Önceki çalışmalar, Drosophila TRP kanalının açılmasına protonlar, yerel lipit ortamının bozulması veya mekanik kuvvet ^2,3,4 aracılık ettiğini göstermiştir. Drosophila TRP kanalı ayrıca kalmodulin⁵ ile etkileşime girer ve kalsiyum tarafından hem pozitif hem de negatif geri besleme ^6,7,8 ile modüle edilir.

Şimdiye kadar, Drosophila TRP ve TRP benzeri (TRPL) kanalların geçit mekanizması üzerine yapılan elektrofizyoloji çalışmaları, eksize edilmiş membran yamalarına, ayrışmış vahşi tip Drosophila fotoreseptörlerinden tüm hücre kayıtlarına ve S2, SF9 veya HEK hücrelerinde^{hetero-eksprese} kanallara dayanıyordu. Tam uzunluktaki Drosophila TRP kanalının yapısal bilgileri de belirsizliğini koruyor. Saflaştırılmış proteinin elektrofizyolojik özelliklerini yeniden yapılandırılmış bir membran ortamında incelemek ve tam uzunluktaki Drosophila TRP kanalının yapısal bilgisini elde etmek için, saflaştırılmış tam uzunlukta TRP kanallarının elde edilmesi, memeli TRP kanalı çalışmalarında kullanılan metodolojilere benzer şekilde gerekli ilk adımdır^14,15,16,17.

Son zamanlarda, INAD protein kompleksi^18,19,20'nin montaj mekanizmasına dayanarak^, TRP kanalını streptavidin boncukları⁵ ile Drosophila kafa homojenatlarından arındırmak için bir afinite saflaştırma artı rekabet stratejisi geliştirilmiştir. Streptavidin boncuklarının düşük kapasitesi ve pahalı maliyeti göz önüne alındığında, burada His-etiketli yem proteinini ve buna karşılık gelen düşük maliyetli Ni-boncukları çok daha yüksek kapasiteye sahip kullanan gelişmiş bir saflaştırma protokolü tanıtılmıştır. Önerilen yöntem, TRP kanalının geçit mekanizmasını yapısal açılardan incelemeye ve TRP kanalının elektrofizyolojik özelliklerini saflaştırılmış proteinlerle ölçmeye yardımcı olacaktır.

Protokol

1. GST etiketli TRP ve Onun etiketli NORPA parçalarının saflaştırılması

1. GST etiketli TRP 1261-1275 parçasını saflaştır
   1. CaCl 2 ısı şoku dönüşüm yöntemi 21'i kullanarak pGEX 4T-1 TRP 1261-1275 plazmid^10'u Escherichia coli (E. coli)_BL21 (DE3) hücrelerine dönüştürün. Tek bir koloniye 10 mL Luria Bertani (LB) ortamında aşılayın ve 37 ° C'de gece boyunca büyüyün. Daha sonra, 10 mL tohumlama kültürünü 37 ° C'de 1 L LB ortamında yükseltin.
   2. Hücrelerin optik yoğunluğu (OD₆₀₀) 0.5'e ulaştıktan sonra, hücreleri 16 ° C'ye soğutun ve hedef proteinin aşırı ekspresyonunu indüklemek ve 18 saat boyunca 16 ° C'de inkübe etmek için 0.1 mM izopropil β-D-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG; son konsantrasyon) ekleyin.
   3. Aşırı ekspresyondan sonra, 3.993 × g'de santrifüjleme ile 1 L kültürlenmiş hücreyi 20 dakika boyunca pelet ve 40 mL fosfat tamponlu salin (PBS) tamponunda yeniden askıya alır.
   4. Yeniden askıya alınan hücreleri, 4 °C'de önceden soğutulmuş yüksek basınçlı bir homojenizatöre yükleyin. Homojenizatör basıncını yavaşça 800 bar'a yükseltin. Giriş musluğunu açın ve yeniden askıya alınan hücrelerin dairesel olarak çok dar yarıklara sahip bir valften geçmesine izin verin.
      NOT: Hücreler, büyük bir basınç düşüşü ve kavitasyonun neden olduğu yüksek kesme kuvvetleri ile homojenize edilir.
   5. Bir yerçekimi akış kolonuna 5 mL glutatyon boncuk yükleyin ve boncukları toplam üç kez 50 mL PBS tamponu ile yıkayın.
   6. Hücre lizatını yüksek basınçlı homojenizatörden 48.384 x g'de santrifüj yapın. Santrifüjlü hücre lizatının (40 mL) süpernatantını, yerçekimi akış sütunundaki dengelenmiş glutatyon boncuklarına ekleyin ve 4 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Glutatyon boncuklarını her 10 dakikada bir yeniden askıya alın.
   7. 30 dakikalık inkübasyondan sonra, boncukları ve akış fraksiyonunu ayırmak için sütun çıkış musluğunu açın. Akış kesirini atın. Kalan glutatyon boncuklarını 50 mL PBS tamponu ile iki kez durulayın.
   8. Glutatyon boncuklarına 15 mL elüsyon tamponu ekleyin ve 30 dakika boyunca kuluçkaya yatırın. Boncukları her 10 dakikada bir yeniden askıya alın.
   9. 30 dakikalık inkübasyondan sonra, GST etiketli TRP 1261-1275 parçasını 50 mL'lik bir konik tüp içinde boşaltın ve 50 mM Tris (pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) tamponu kullanılarak dengelenen bir boyut hariç tutma sütununa (hazırlama sınıfı) yükleyin.
   10. Boyut hariç tutma sütununun elüsyon akış hızını 3 mL/dk'da tutun. Salınan proteinleri 5 mL/tüp oranında toplayın.
   11. UV absorpsiyon sinyallerini 280 nm'de analiz ederek boyut dışlama sütunundaki hedef proteinin zirvesini tanımlayın ve SDS-PAGE jel analizi ile doğrulayın (elektroforez parametreleri: istifleme jeli için 150 V; çözme jeli için 200 V). Jeli Coomassie mavisi R250 ile sabitleyin.
   12. Saflaştırılmış GST etiketli TRP 1261-1275 parçasını, masa üstü soğutulmuş bir santrifüjde 4 °C'de 3.000 x g'de santrifüj edilmiş 15 mL ultrafiltrasyon spin sütunu kullanarak boyut hariç tutma sütunundan 1 mL'ye yoğunlaştırın.
   13. Bira-Lambert Yasasını kullanarak konsantre protein konsantrasyonunu belirleyin. GST etiketli TRP 1261-1275 parçasının UV emilimini bir spektrofotometre kullanarak 280 nm'de ölçün.
   14. Protein dizilerini Protparam programına (https://web.expasy.org/protparam/) aktararak 280 nm'de yok olma katsayısını elde edin. Tipik olarak, GST etiketli TRP 1261-1275'in 1 L kültürü, 1 mL 600 μM protein (6 x ^10-7 mol) verir. Gerekli malzemeler için Tablo 1'e bakınız.
2. Onun etiketli NORPA 863-1095 parçasının saflaştırılması
   1. CaCl 2 ısı şoku dönüşüm yöntemi 21'i kullanarak pETM.3C NORPA 863-1095 plazmid^20'yi E. coli _BL21 (DE3) hücrelerine dönüştürün. Tek bir koloniyi 10 mL LB ortamında aşılayın ve 37 ° C'de gece boyunca büyüyün. Daha sonra, 10 mL tohumlama kültürünü 37 ° C'de 1 L LB ortamında yükseltin.
   2. Hücrelerin OD_600'ü 0.5'e ulaştıktan sonra, hücreleri 16 ° C'ye soğutun ve hedef proteinin aşırı ekspresyonunu indüklemek ve 18 saat boyunca 16 ° C'de inkübe etmek için 0.1 mM IPTG (son konsantrasyon) ekleyin.
   3. Aşırı ekspresyondan sonra, 20 dakika boyunca 3.993 x g'de santrifüjleme ile 1 L kültürlenmiş hücreyi toplayın ve 40 mL bağlanma tamponunda yeniden askıya alın. Daha sonra, yeniden askıya alınmış hücreleri, adım 1.1.4'te açıklandığı gibi 4 ° C'de yüksek basınçlı bir homojenizatörde lize edin.
   4. Bir yerçekimi akış kolonuna 5 mL Ni-boncuk yükleyin ve 50 mL bağlayıcı tamponla üç kez yıkayın.
   5. Hücre lizatını yüksek basınçlı homojenizatörden 48.384 x g'de santrifüj yapın. Santrifüjlü hücre lizatının süpernatantını, yerçekimi akış sütunundaki dengelenmiş Ni-boncuklarına ekleyin ve 4 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Ni-boncukları her 10 dakikada bir yeniden askıya alın.
   6. 30 dakikalık inkübasyondan sonra, boncukları ve akış fraksiyonunu ayırmak için sütun çıkış musluğunu açın. Akış fraksiyonunu atın ve kalan Ni-boncukları 50 mL yıkama tamponu ile iki kez yıkayın.
   7. Ni-boncuklara 15 mL elüsyon tamponu ekleyin ve 30 dakika kuluçkaya yatırın. Ni-boncukları her 10 dakikada bir yeniden askıya alın.
   8. 30 dakikalık inkübasyondan sonra, salınımlı His-etiketli NORPA 863-1095 parçasını 50 mL'lik bir konik tüpte toplayın ve 50 mM Tris (pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) kullanılarak dengelenen bir boyut hariç tutma sütununa (hazırlama sınıfı) yükleyin.
   9. Boyut hariç tutma sütununun elüsyon akış hızını 3 mL/dk'da tutun. Salınan proteini 5 mL / tüp oranında toplayın.
   10. UV absorpsiyon sinyallerini 280 nm'de analiz ederek boyut dışlama sütunundaki hedef proteinin zirvesini tanımlayın ve SDS-PAGE jel analizi ile doğrulayın (elektroforez parametreleri: istifleme jeli için 150 V; çözme jeli için 200 V). Coomassie mavi R250 kullanarak jeli lekeleyin.
   11. Saflaştırılmış His etiketli NORPA 863-1095 parçasını, masa üstü soğutulmuş bir santrifüjde 4 °C'de 3.000 x g'de santrifüj edilmiş 15 mL ultrafiltrasyon spin sütunu kullanarak boyut hariç tutma sütunundan 1 mL'ye konsantre edin.
   12. Bira-Lambert Yasasını kullanarak konsantre protein konsantrasyonunu belirleyin. Bir spektrofotometre kullanarak His-etiketli NORPA 863-1095 parçasının UV emilimini 280 nm'de ölçün.
   13. Protein dizilerini Protparam programına (https://web.expasy.org/protparam/) aktararak 280 nm'de yok olma katsayısını elde edin. Tipik olarak, His-etiketli NORPA 863-1095 fragmanının 1 L kültürü, 1 mL 600 μM protein (6 x ^10-7 mol) verir. Gerekli malzemeler için Tablo 2'ye bakınız.

2. Drosophila kafalarının hazırlanması

1. CO 2 anestezi yöntemi_22,23'ü kullanarak yetişkin sinekleri 50 mL konik santrifüjleme tüplerinde toplayın; hemen sıvı azotta 10 dakika dondurun ve -80 ° C'lik bir dondurucuda saklayın.
2. Yeterli sayıda sinek topladıktan sonra, sineklerin bacaklarını, kafalarını, kanatlarını ve vücutlarını ayırmak için donmuş 50 mL konik tüpleri elle kuvvetlice sallayın. Karışımı sıralı olarak istiflenmiş üç adet önceden soğutulmuş paslanmaz çelik eleğe (sırasıyla 20/30/40 ağ boyutu) aktarın ve elekleri sallayın.
3. Daha sonra, kafalar 40 örgülü elek içinden geçemediğinden, sinek kafalarını 40 örgülü elek dışına süpürmek, 50 mL konik tüplere aktarmak ve -80 ° C'de saklamak için bir fırça kullanın.
4. Sinekleri ve kafalarını sürekli olarak toplayın ve deney için gerekli miktara (0,5 g) ulaşana kadar -80 ° C'lik bir dondurucuda saklayın. Tipik olarak, 0.5 g kafa toplamak için, 50 mL'lik bir konik tüpte 35 mL sinek gerekir. Gerekli malzemeler için Tablo 3'e bakınız.

3. Drosophila TRP kanal saflaştırma

1. Toplam 0,5 g kafa tartın ve önceden soğutulmuş bir harç havanesi kullanarak sıvı azotta tamamen homojenize edin. Homojenize edilmiş kafaları 10x v/w lizis tamponunda (5 mL) çözün, 20 dakika boyunca 4 °C'de bir çalkalayıcıda inkübe edin ve ardından 4 °C'de 20 dakika boyunca 20.817 x g'de santrifüj yapın.
2. Spin-down süpernatantını ("20817 g S", Şekil 4) toplayın ve 4 ° C'de 60 dakika boyunca 100.000 x g'de santrifüj yapın. Aşağıdaki aşağı çekme testi için spin-down süpernatantını ("100.000 g S", Şekil 4) kullanın.
3. Yerçekimi akış sütununa 1 mL Ni-boncuk ekleyin ve boncukları 4 ° C'de 10 mL çift damıtılmış H₂O (ddH₂O) ile toplam üç kez yıkayın. Boncukları, 4 ° C'de üç kez 10 sütun hacimli lizis tamponu ile dengeleyin.
4. Ni-kolonuna 500 μL 600 μM saflaştırılmış His-etiketli NORPA 863-1095 proteini (3 x ^10-7 mol) ekleyin ve 4 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Boncukları her 10 dakikada bir yeniden askıya alın.
5. Boncukları ve akış fraksiyonunu ayırmak için sütun çıkış musluğunu açın. SDS-PAGE analizi için akış kesirini alın (NORPA F, Şekil 4). Bu bölümde, yem proteinleri Ni-boncuklar üzerinde hareketsiz hale getirilir.
6. Ni-boncukları 4 °C'de 10 kolon hacimli lizis tamponu (10 mL) ile yıkayın ve SDS-PAGE analizi için yıkama fraksiyonunu saklayın (Yıkama 1, Şekil 4A). Yukarıdaki adımları tekrarlayın ve SDS-PAGE analizi için numuneyi saklayın (Yıkama 2, Şekil 4A). Bu bölümde, Ni-boncuklar üzerindeki aşırı yem proteinleri uzaklaştırılır.
7. 100.000 x g santrifüjlemeden sonra Drosophila kafa homojenatının süpernatantını, 4 ° C'de Ni-sütununa ekleyin, burada His etiketli NORPA 863-1095 parçası hareketsiz hale getirilmiştir.
8. Süpernatantı Ni-boncuklarla 4 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Boncukları her 10 dakikada bir yeniden askıya alın. Ardından, boncukları ve akış fraksiyonunu ayırmak için sütun çıkış musluğunu açın.
9. SDS-PAGE analizi için süpernatantı toplayın (Dro kafa lizisi F, Şekil 4A). Bu bölümde, kafa homojenatlarındaki INAD protein kompleksleri (INAD / TRP / ePKC), Ni-boncuklar üzerindeki hareketsiz NORPA 863-1095 parçaları tarafından yakalanır.
10. Ni-boncukları 4 °C'de 10 sütun hacimli lizis tamponu (10 mL) ile yıkayın ve SDS-PAGE analizi için süpernatantı yerçekimi çökelmesinden uzak tutun (Yıkama 3, Şekil 4A). Yukarıdaki adımları tekrarlayın ve SDS-PAGE analizi için süpernatantı toplayın (Yıkama 4, Şekil 4A). Bu bölümde, Ni-boncuklar üzerindeki bağlanmamış proteinler uzaklaştırılır.
11. Ni-boncuklara 500 μL 600 μM GST etiketli TRP 1261-1275 protein (3 x ^10-7 mol) ekleyin ve 4 ° C'de 20 dakika kuluçkaya yatırın. Boncukları her 10 dakikada bir yeniden askıya alın.
12. Endojen Drosophila TRP kanalını içeren yerçekimi sütunundan (TRP E1, Şekil 4B) salınan fraksiyonu toplayın. Yukarıdaki adımları tekrarlayın ve elüsyon fraksiyonunu toplayın (TRP E2, Şekil 4B). Bu adımda, GST etiketli TRP 1261-1275 parçalarını rakip olarak kullanarak, TRP kanalları Ni-boncuklar üzerindeki yakalanan INAD protein komplekslerinden (INAD / TRP / ePKC) salınır.
13. Ni-boncukları 10 sütun hacimli bağlayıcı tamponla (10 mL; Tablo 1) 4 °C'de ve SDS-PAGE analizi için yıkama fraksiyonunu toplayın (Yıkama 5, Şekil 4B).
14. Ni-boncuklara 500 μL elüsyon tamponu (Tablo 1) ekleyin ve 4 ° C'de 20 dakika kuluçkaya yatırın. Yerçekimi akış kolonundan elüsyon fraksiyonunu toplayın (NORPA E1, Şekil 4B). Yukarıdaki adımları tekrarlayın ve elüsyon fraksiyonunu toplayın (NORPA E2, Şekil 4B).
15. Elüsyon tamponunu kullanarak, INAD / ePKC protein kompleksleri ile birlikte His-etiketli NORPA 863-1095 fragmanını etkisiz hale getirin. Ardından, Ni-boncukları 500 μL bağlayıcı tamponda yeniden askıya alın.
16. Elüsyonun verimliliğini analiz etmek ve elute tamponun çalışıp çalışmadığını değerlendirmek için SDS-PAGE'i (Coomassie mavisi R250 ile boyanmış) çalıştırmak için yeniden askıya alınmış Ni-boncukları alın (boncuklar, Şekil 4B). Gerekli malzemeler için Tablo 4'e bakınız.

4. Drosophila TRP kanalının boyut hariç tutma kolon saflaştırılması

1. Protein saflaştırma sistemine bir boyut hariç tutma sütunu (analitik sınıf) takın. Kolonu 0,45 μm filtre ile filtrelenen sütun tamponu (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, 0,75 mM DDM) ile dengeleyin.
2. TRP E1 ve E2 fraksiyonunu 3.14. adımdan itibaren, soğutulmuş bir santrifüjde 4 °C'de 3.000 x g'de santrifüjlenmiş 4 mL ultrafiltrasyon spin sütunu kullanarak konsantre edin.
3. Numune döngüsünü kolon tamponuyla durulayın ve numuneyi numune döngüsüne yükleyin. Numuneyi boyut hariç tutma kolonuna enjekte edin ve proteinleri uygun bir akış hızıyla (0,5 mL / dak) süzün.
4. Hedef proteinin zirvesini 280 nm'de absorpsiyonla tanımlayın ve saflaştırılmış endojen Drosophila TRP kanalını tespit etmek için bir SDS-PAGE jeli çalıştırın (Şekil 5). Gerekli malzemeler için Tablo 5'e bakınız.

Sonuçlar

Bu makalede, endojen Drosophila TRP kanalını saflaştırmak için bir protein saflaştırma yöntemi gösterilmiştir (Şekil 1).

İlk olarak, yem ve rakip proteinleri elde etmek için rekombinant protein ekspresyonu ve saflaştırma uygulanır. Daha sonra, GST etiketli bir TRP 1261-1275 fragmanı, LB ortamındaki E. coli BL21 (DE3) hücrelerinde eksprese edilir ve glutatyon boncukları ve bir boyut hariç tutma sütunu kullanılarak saflaştı...

Tartışmalar

Beş PDZ alanı içeren INAD, Drosophila fototransdüksiyon makinelerinin temel organizatörüdür. Önceki çalışmalar, INAD PDZ3'ün TRP kanalı C-terminal kuyruğuna zarif bir özgüllükle bağlandığını göstermiştir (K_D = 0.3 μM)¹⁸. INAD PDZ45 tandem, NORPA 863-1095 fragmanı ile son derece yüksek bir bağlanma afinitesi ile etkileşime girer (K_D = 30 nM). Bu bulgular, NORPA CC-PBM parçasının aşağı çekme yemi olarak kullanılmasını sağlayan af...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacterial strains
BL21(DE3) Competent Cells	Novagen	69450	Protein overexpression
Experiment models
D.melanogaster: W1118 strain	Bloomington Drosophila Stock Center	BDSC:3605	Drosophila head preparation
Material
20/30/40 mesh stainless steel sieves	Jiufeng metal mesh company	GB/T6003.1	Drosophila head preparation
30% Acrylamide-N,N′-Methylenebisacrylamide(29:1)	Lablead	A3291	SDS-PAGE gel preparation
Ammonium Persulfate	Invitrogen	HC2005	SDS-PAGE gel preparation
Cocktail protease inhibitor	Roche	05892953001	Protease inhibitor
Coomassie brilliant blue R-250	Sangon Biotech	A100472-0025	SDS-PAGE gel staining
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sangon Biotech	A620058-0100	Size-exclusion column buffer preparation
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA)	Sangon Biotech	A500838-0500	Size-exclusion column buffer preparation
Glycine	Sangon Biotech	A610235-0005	SDS-PAGE buffer preparation
Glutathione Sepharose 4 Fast Flow beads	Cytiva	17513202	Affinity chromatography
Imidazole	Sangon Biotech	A500529-0001	Elution buffer preparation for Ni-column
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sangon Biotech	A600168-0025	Induction of protein overexpression
LB Broth Powder	Sangon Biotech	A507002-0250	E.coli. cell culture
L-Glutathione reduced (GSH)	Sigma-aldrich	G4251-100G	Elution buffer preparation for Glutathione beads
Ni-Sepharose excel beads	Cytiva	17371202	Affinity chromatography
N-Dodecyl beta-D-maltoside (DDM)	Sangon Biotech	A610424-001	Detergent for protein purification
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma-aldrich	T9281-100ML	SDS-PAGE gel preparation
PBS	Sangon Biotech	E607008-0500	Homogenization buffer for E.coli. cell
PMSF	Lablead	P0754-25G	Protease inhibitor
Prestained protein marker	Thermo Scientific	26619/26616	Prestained protein ladder
Size exclusion column (preparation grade)	Cytiva	28989336	HiLoad 26/60 Superdex 200 PG column
Size exclusion column (analytical grade)	Cytiva	29091596	Superose 6 Increase 10/300 GL column
Sodium chloride	Sangon Biotech	A501218-0001	Protein purification buffer preparation
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sangon Biotech	A500228-0001	SDS-PAGE gel/buffer preparation
Tris base	Sigma-aldrich	T1503-10KG	Protein purification buffer preparation
Ultrafiltration spin column	Millipore	UFC901096/801096	Protein concentration
Equipment
Analytical Balance	DENVER	APX-60	Metage of Drosophila head
Desk-top high-speed refrigerated centrifuge for 15mL and 50mL conical centrifugation tubes	Eppendorf	5810R	Protein concentration
Desk-top high-speed refrigerated centrifuge 1.5mL centrifugation tubes	Eppendorf	5417R	Centrifugation of Drosophila head lysate after homogenization
Empty gravity flow column (Inner Diameter=1.0cm)	Bio-Rad	738-0015	TRP protein purification
Empty gravity flow column (Inner Diameter=2.5cm)	Bio-Rad	738-0017	Bait and competitor protein purification from E.coli.
Gel Documentation System	Bio-Rad	Universal Hood II Gel Doc XR System	SDS-PAGE imaging
High-speed refrigerated centrifuge	Beckman coulter	Avanti J-26 XP	Centrifugation of E.coli. cells/cell lysate
High pressure homogenizer	UNION-BIOTECH	UH-05	Homogenization of E.coli. cells
Liquid nitrogen tank	Taylor-Wharton	CX-100	Drosophila head preparation
Protein purification system	Cytiva	AKTA purifier	Protein purification
Refrigerator (-80°C)	Thermo	900GP	Drosophila head preparation
Spectrophotometer	MAPADA	UV-1200	OD600 measurement of E.coli. cells
Spectrophotometer	Thermo Scientific	NanoDrop 2000c	Determination of protein concentration
Ultracentrifuge	Beckman coulter	Optima XPN-100 Ultracentrifuge	Ultracentrifugation