Purificação dos canais potenciais do receptor transitório Endogenous Drosophila

Resumo

Com base no mecanismo de montagem do complexo proteico INAD, neste protocolo, foi desenvolvida uma purificação de afinidade modificada mais estratégia de concorrência para purificar o canal endogenso Drosophila TRP.

Resumo

A fototransdução de drosophila é uma das vias de sinalização mais rápidas conhecidas por proteína G. Para garantir a especificidade e eficiência dessa cascata, o canal de cáção de cálcio (Ca²⁺)permeável, o potencial de receptor transitório (TRP), liga-se firmemente à proteína do andaime, inativação-não-pós-potencial D (INAD), e forma um grande complexo proteico de sinalização com proteína específica dos olhos quinase C (ePKC) e phospholipase Cβ/No receptor potencial A (PLC/NORPA). No entanto, as propriedades bioquímicas do canal Drosophila TRP permanecem incertas. Com base no mecanismo de montagem do complexo proteico INAD, foi desenvolvida uma purificação de afinidade modificada mais estratégia de concorrência para purificar o canal endorfário. Primeiro, o fragmento de histidina purificada (His)-tagged NORPA 863-1095 foi vinculado a ni-contas e usado como isca para puxar para baixo o complexo proteico inad endógeno de Dphila cabeça homogeneiza. Em seguida, o fragmento TRP 1261-1275 com a marca excessiva purificada foi adicionado às contas ni para competir com o canal TRP. Finalmente, o canal TRP no supernante foi separado do peptídeo TRP 1261-1275 excessivo por cromatografia de exclusão de tamanho. Este método permite estudar o mecanismo de gating do canal Drosophila TRP a partir de ângulos bioquímicos e estruturais. As propriedades de eletrofisiologia dos canais TRP de Drosophila purificados também podem ser medidas no futuro.

Introdução

Fototransdução é um processo onde fótons absorvidos são convertidos em códigos elétricos de neurônios. Ele retransmite exclusivamente opsinas e a seguinte cascata de sinalização acoplada à proteína G em ambos os vertebrados e invertebrados. Em Drosophila, usando seus cinco domínios PDZ, a inativação de proteína de andaime-não-pós-potencial D (INAD) organiza um complexo de sinalização supramolecular, que consiste em um canal de receptores transitórios (TRP), phospholipase Cβ/No receptor potencial A (PLCβ/NORPA) e proteína específica dos olhos quinase C (ePKC)¹. A formação deste complexo de sinalização supramolecular garante a localização subcelular correta, alta eficiência e especificidade das máquinas de fototransdução de Drosophila. Neste complexo, canais TRP sensíveis à luz atuam como efeitos a jusante da NORPA e mediam o fluxo de cálcio e a despolarização dos fotorreceptores. Estudos anteriores mostraram que a abertura do canal Drosophila TRP é mediada por prótons, interrupção do ambiente lipídedo local ou força mecânica ^2,3,4. O canal Drosophila TRP também interage com a calmodulina⁵ e é modulado pelo cálcio pelo feedback positivo e negativo ^6,7,8.

Até agora, estudos de eletrofisiologia sobre o mecanismo de gating dos canais Drosophila TRP e TRP-like (TRPL) foram baseados em patches de membrana excisada, gravações de células inteiras de fotorreceptores drosophila dissociados e canais hetero-expressos em células S2, SF9 ou HEK 2,9,10,11,12,13, mas não em canais purificados. As informações estruturais do canal TRP Drosophila de comprimento completo também permanecem incertas. Para estudar as propriedades eletrofisiológicas da proteína purificada em um ambiente de membrana reconstituída e obter informações estruturais do canal TRP Drosophila de comprimento completo, obter canais de TRP purificados é o primeiro passo necessário, semelhante às metodologias utilizadas nos estudos do canal TRP mamífera 14,15,16,17.

Recentemente, com base no mecanismo de montagem do complexo proteico INAD 18,19,20, uma estratégia de purificação de afinidade mais competição foi desenvolvida pela primeira vez para purificar o canal TRP a partir de homogeneizados da cabeça de Drosophila por contas streptavidin 5. Considerando a baixa capacidade e o custo caro das contas streptavidin, um protocolo de purificação melhorado é introduzido aqui que usa proteína isca sua marcada e contas ni-beads de baixo custo correspondentes com capacidade muito maior. O método proposto ajudará a estudar o mecanismo de gating do canal TRP a partir de ângulos estruturais e a medir as propriedades eletrofisiológicas do canal TRP com proteínas purificadas.

Protocolo

1. Purificação de fragmentos TRP com etiqueta GST e norpa com sua marca

1. Purificar fragmento TRP 1261-1275 com marca GST
   1. Transforme as células pGEX 4T-1 TRP 1261-1275 plasmid¹⁰ em células Escherichia coli (E. coli) BL21 (DE3) usando o método de transformação de choque térmico CaCl₂ ²¹. Inocular uma única colônia em 10 mL de Luria Bertani (LB) média e crescer durante a noite a 37 °C. Em seguida, amplie os 10 mL de cultura de semeadura em 1 L de meio LB a 37 °C.
   2. Após a densidade óptica (OD₆₀₀) das células atingir 0,5, resfriar as células a 16 °C e adicionar 0,1 mM isopropílico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG; concentração final) para induzir a superexpressão da proteína alvo e incubar a 16 °C para 18 h.
   3. Após a superexpressão, pelota 1 L de células cultivadas por centrifugação a 3.993 × g por 20 min e resuspend em 40 mL de tampão salino tampão tampão de fosfato (PBS).
   4. Carregue as células resuspended em um homogeneizador de alta pressão pré-resfriado a 4 °C. Aumente lentamente a pressão do homogeneizador para 800 bar. Abra a torneira de entrada e deixe as células resuspendedas passarem circularmente por uma válvula com fendas muito estreitas.
      NOTA: As células são homogeneizadas pelas forças de alto corte causadas por uma grande queda de pressão e cavitação.
   5. Carregue 5 mL de contas de glutationa em uma coluna de fluxo gravitacional e lave as contas com 50 mL de tampão PBS para um total de três vezes.
   6. Centrifugar o lise celular do homogeneizador de alta pressão a 48.384 x g. Adicione o sobrenante do liseato celular centrifugado (40 mL) às contas de glutationa equilibradas na coluna de fluxo de gravidade e incubar por 30 min a 4 °C. Resuspend as contas de glutationa a cada 10 minutos.
   7. Após 30 minutos de incubação, abra a torneira da saída da coluna para separar as contas e a fração de fluxo. Descarte a fração de fluxo. Enxágüe as contas restantes de glutationa duas vezes com 50 mL de tampão PBS.
   8. Adicione 15 mL de tampão de eluição às contas de glutationa e incubar por 30 min. Resuspend as contas a cada 10 minutos.
   9. Após 30 minutos de incubação, elute o fragmento TRP 1261-1275 marcado pelo GST em um tubo cônico de 50 mL e carga em uma coluna de exclusão de tamanho (grau de preparação), que é equilibrado usando 50 mM Tris (pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) tampão.
   10. Mantenha a taxa de fluxo de elução da coluna de exclusão de tamanho para 3 mL/min. Coletar as proteínas elucidas à taxa de 5 mL/tubo.
   11. Identifique o pico da proteína alvo na coluna de exclusão de tamanho analisando os sinais de absorção UV a 280 nm e verifique pela análise do gel SDS-PAGE (parâmetros de eletroforese: 150 V para o gel de empilhamento; 200 V para o gel de resolução). Manche o gel com R250 azul Coomassie.
   12. Concentre o fragmento de TRP 1261-1275 com etiqueta GST purificada da coluna de exclusão de tamanho para 1 mL usando uma coluna de rotação de ultrafiltração de 15 mL centrifuada a 3.000 x g a 4 °C em uma centrífuga refrigerada de mesa.
   13. Determine a concentração de proteína concentrada usando a Lei Beer-Lambert. Meça a absorção UV do fragmento TRP 1261-1275 marcado pelo GST a 280 nm usando um espectotômetro.
   14. Obtenha o coeficiente de extinção em 280 nm importando as sequências proteicas para o programa Protparam (https://web.expasy.org/protparam/). Tipicamente, 1 cultura L de TRP com marca GST 1261-1275 produz 1 mL de 600 μM de proteína (6 x ^10-7 mol). Consulte a Tabela 1 para os materiais necessários.
2. Purificação do fragmento NORPA 863-1095 com sua marca
   1. Transforme as células pETM.3C NORPA 863-1095 plasmid²⁰ em células E. coli BL21 (DE3) usando o método de transformação de choque térmico CaCl₂ ²¹. Inocular uma única colônia em 10 mL de meio LB e crescer durante a noite a 37 °C. Em seguida, amplie a cultura de semeadura de 10 mL em 1 L de meio LB a 37 °C.
   2. Após o OD₆₀₀ das células atingir 0,5, esfrie as células a 16 °C e adicione 0,1 mM IPTG (concentração final) para induzir a superexpressão da proteína alvo e incubar a 16 °C por 18 h.
   3. Após a superexpressão, pelota 1 L de células cultivadas por centrifugação a 3.993 x g por 20 min e resuspend em 40 mL de tampão de ligação. Em seguida,lise as células resuspended em um homogeneizador de alta pressão a 4 °C como descrito na etapa 1.1.4.
   4. Carregue 5 mL de ni-contas em uma coluna de fluxo de gravidade e lave três vezes com 50 mL de tampão de ligação.
   5. Centrifugar o lise celular do homogeneizador de alta pressão a 48.384 x g. Adicione o sobrenante da célula centrifugada lysate às contas ni equilibradas na coluna de fluxo de gravidade e incubar por 30 min a 4 °C. Resuspend as contas Ni a cada 10 minutos.
   6. Após 30 minutos de incubação, abra a torneira da saída da coluna para separar as contas e a fração de fluxo. Descarte a fração de fluxo e lave as contas ni restantes duas vezes com 50 mL de tampão de lavagem.
   7. Adicione 15 mL de tampão de eluição às contas ni e incubar por 30 minutos. Resuspend as contas Ni a cada 10 minutos.
   8. Após 30 minutos de incubação, colete o fragmento NORPA 863-1095 com etiqueta de Seu elucido em um tubo cônico de 50 mL e carregue em uma coluna de exclusão de tamanho (grau de preparação), que é equilibrada usando 50 mM Tris (pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT).
   9. Mantenha a taxa de fluxo de elução da coluna de exclusão de tamanho para 3 mL/min. Coletar a proteína elucida à taxa de 5 mL/tubo.
   10. Identifique o pico da proteína alvo na coluna de exclusão de tamanho analisando os sinais de absorção UV a 280 nm e verifique pela análise do gel SDS-PAGE (parâmetros de eletroforese: 150 V para o gel de empilhamento; 200 V para o gel de resolução). Manche o gel usando R250 azul Coomassie.
   11. Concentre o fragmento NORPA 863-1095 com sua marca purificada da coluna de exclusão de tamanho para 1 mL usando uma coluna de rotação de ultrafiltração de 15 mL centrifugada a 3.000 x g a 4 °C em uma centrífuga refrigerada de mesa.
   12. Determine a concentração de proteína concentrada usando a Lei Beer-Lambert. Meça a absorção UV do fragmento NORPA 863-1095 com marcação UV a 280 nm usando um espectrômetro.
   13. Obtenha o coeficiente de extinção em 280 nm importando as sequências proteicas para o programa Protparam (https://web.expasy.org/protparam/). Tipicamente, 1 L cultura de seu fragmento NORPA 863-1095 produz 1 mL de 600 μM de proteína (6 x ^10-7 mol). Consulte a Tabela 2 para os materiais necessários.

2. Preparação de cabeças de Drosophila

1. Coletar moscas adultas em tubos de centrifugação cônica de 50 mL utilizando o método de anestesia DE CO₂ 2 ^22,23; congele imediatamente o nitrogênio líquido por 10 minutos e armazene em um congelador de -80°C.
2. Depois de coletar um número suficiente de moscas, agite vigorosamente os tubos cônicos congelados de 50 mL à mão para separar as pernas, cabeças, asas e corpos das moscas. Transfira a mistura para três peneiras de aço inoxidável pré-resfriadas (tamanho de malha 20/30/40, respectivamente) e agite as peneiras.
3. Em seguida, uma vez que as cabeças não podem passar pela peneira de 40 malhas, use um pincel para varrer as cabeças de mosca da peneira de 40 malhas, transfira-as para tubos cônicos de 50 mL e armazene-as a −80 °C.
4. Colete continuamente as moscas e suas cabeças e armazene-as em um congelador de -80 °C até atingir a quantidade necessária para experimentação (0,5 g). Normalmente, para coletar 0,5 g de cabeças, são necessários 35 mL de moscas em um tubo cônico de 50 mL. Consulte a Tabela 3 para obter os materiais necessários.

3. Purificação do canal Drosophila TRP

1. Pesar um total de 0,5 g de cabeças e homogeneizar completamente em nitrogênio líquido usando um pilão de argamassa pré-resfriado. Dissolva as cabeças homogeneizadas em 10x v/w tampão de lise (5 mL), incubar em um agitador a 4 °C por 20 min e, em seguida, centrífuga a 20.817 x g por 20 min a 4 °C.
2. Colete o supernante spin-down ("20817 g S", Figura 4) e centrifuse-o ainda mais a 100.000 x g por 60 min a 4 °C. Use o supernatante spin-down ("100.000 g S", Figura 4) para o seguinte ensaio de recuo.
3. Adicione 1 mL de ni-contas na coluna de fluxo de gravidade e lave as contas com 10 mL de H₂O destilado duplo (ddH₂O) a 4 °C para um total de três vezes. Equilibre as contas com 10 volumes de coluna de tampão de lise três vezes a 4 °C.
4. Adicione 500 μL de 600 μM purificado Sua proteína NORPA 863-1095 (3 x ^10-7 mol) na coluna Ni e incubar por 30 min a 4 °C. Resuspend as contas a cada 10 minutos.
5. Abra a torneira de saída da coluna para separar as contas e a fração de fluxo. Pegue a fração de fluxo para análise SDS-PAGE (NORPA F, Figura 4). Nesta seção, as proteínas iscas são imobilizadas nas contas ni.
6. Lave as contas ni com 10 volumes de coluna de tampão de lise (10 mL) a 4 °C e mantenha a fração de lavagem para análise SDS-PAGE (Wash 1, Figura 4A). Repita as etapas acima e mantenha a amostra para análise SDS-PAGE (Wash 2, Figura 4A). Nesta seção, as proteínas de isca excessivas nas contas-de-ni são removidas.
7. Adicione o supernatante da cabeça de Drosophila homogeneizado após centrifugação de 100.000 x g na coluna Ni a 4 °C, onde o fragmento NORPA 863-1095 marcado foi imobilizado.
8. Incubar o supernante com as contas ni a 4 °C por 30 min. Resuspend as contas a cada 10 minutos. Em seguida, abra a torneira de saída da coluna para separar as contas e a fração de fluxo.
9. Colete o supernatante para análise SDS-PAGE (Dro head lysis F, Figure 4A). Nesta seção, os complexos proteicos INAD (INAD/TRP/ePKC) na cabeça homogeneizados são capturados pelos fragmentos norpa 863-1095 imobilizados nas contas-de-ni.
10. Lave as contas ni com 10 volumes de coluna de tampão de lise (10 mL) a 4 °C e mantenha o sobrenatante da precipitação gravitacional para análise SDS-PAGE (Wash 3, Figure 4A). Repita as etapas acima e colete o supernatante para análise SDS-PAGE (Wash 4, Figura 4A). Nesta seção, as proteínas não ligadas nas contas ni são removidas.
11. Adicione 500 μL de 600 μM de proteína TRP 1261-1275 com etiqueta GST (3 x ^10-7 mol) nas contas ni e incubar por 20 min a 4 °C. Resuspend as contas a cada 10 minutos.
12. Colete a fração elucida da coluna de gravidade (TRP E1, Figura 4B), que contém o canal erógeno Drosophila TRP. Repita as etapas acima e colete a fração de eluição (TRP E2, Figura 4B). Nesta etapa, utilizando os fragmentos TRP 1261-1275 marcados pelo GST como concorrente, os canais TRP são elucidos dos complexos proteicos INAD capturados (INAD/TRP/ePKC) nas contas Ni.
13. Lave as contas ni com 10 volumes de coluna de tampão de ligação (10 mL; Tabela 1) a 4 °C e coletar a fração de lavagem para análise SDS-PAGE (Wash 5, Figura 4B).
14. Adicione 500 μL de tampão de eluição (Tabela 1) nas contas ni e incubar por 20 min a 4 °C. Recolher a fração de elução da coluna de fluxo gravitacional (NORPA E1, Figura 4B). Repita as etapas acima e colete a fração de eluição (NORPA E2, Figura 4B).
15. Utilizando o tampão de elução, elute o fragmento NORPA 863-1095 marcado por Sua marca acompanhado dos complexos proteicos INAD/ePKC. Em seguida, resuspende as contas Ni em 500 μL de buffer de ligação.
16. Leve as ni-contas resuspended para executar o SDS-PAGE (manchado por R250 azul Coomassie) para analisar a eficiência da elução e avaliar se o buffer elute funciona (contas, Figura 4B). Consulte a Tabela 4 para obter os materiais necessários.

4. Purificação da coluna de exclusão de tamanho do canal Drosophila TRP

1. Instale uma coluna de exclusão de tamanho (grau analítico) no sistema de purificação de proteínas. Equilibre a coluna com o tampão da coluna (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, 0,75 mM DDM), que é filtrado por um filtro de 0,45 μm.
2. Concentre a fração TRP E1 e E2 a partir da etapa 3.14 usando uma coluna de rotação de ultrafiltração de 4 mL, centrifugada a 3.000 x g a 4 °C em uma centrífuga refrigerada.
3. Enxágüe o laço amostral com o tampão da coluna e carregue a amostra no laço amostral. Injete a amostra na coluna de exclusão de tamanho e elute as proteínas com uma taxa de fluxo adequada (0,5 mL/min).
4. Identifique o pico da proteína alvo por absorção a 280 nm e execute um gel SDS-PAGE para detectar o canal 1RP endógeno e endógeno purificado (Figura 5). Consulte a Tabela 5 para obter os materiais necessários.

Resultados

Neste artigo, demonstra-se um método de purificação de proteínas para purificar o canal Drosophila TRP endógeno (Figura 1).

Em primeiro lugar, a expressão e purificação da proteína recombinante são aplicadas para obter a isca e proteínas concorrentes. Em seguida, um fragmento TRP 1261-1275 marcado pelo GST é expresso em células E. coli BL21 (DE3) em média LB e purificado usando contas de glutationa e uma coluna de exclusão de taman...

Discussão

INAD, que contém cinco domínios PDZ, é o principal organizador das máquinas de fototransdução Drosophila. Estudos anteriores mostraram que o INAD PDZ3 se liga à cauda terminal C do canal TRP com especificidade requintada (K_D = 0,3 μM)¹⁸. Inad PDZ45 tandem interage com o fragmento NORPA 863-1095 com uma afinidade de ligação extremamente alta (K_D = 30 nM). Esses achados fornecem uma base bioquímica sólida para projetar a purificação de afinidade mais a es...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacterial strains
BL21(DE3) Competent Cells	Novagen	69450	Protein overexpression
Experiment models
D.melanogaster: W1118 strain	Bloomington Drosophila Stock Center	BDSC:3605	Drosophila head preparation
Material
20/30/40 mesh stainless steel sieves	Jiufeng metal mesh company	GB/T6003.1	Drosophila head preparation
30% Acrylamide-N,N′-Methylenebisacrylamide(29:1)	Lablead	A3291	SDS-PAGE gel preparation
Ammonium Persulfate	Invitrogen	HC2005	SDS-PAGE gel preparation
Cocktail protease inhibitor	Roche	05892953001	Protease inhibitor
Coomassie brilliant blue R-250	Sangon Biotech	A100472-0025	SDS-PAGE gel staining
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sangon Biotech	A620058-0100	Size-exclusion column buffer preparation
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA)	Sangon Biotech	A500838-0500	Size-exclusion column buffer preparation
Glycine	Sangon Biotech	A610235-0005	SDS-PAGE buffer preparation
Glutathione Sepharose 4 Fast Flow beads	Cytiva	17513202	Affinity chromatography
Imidazole	Sangon Biotech	A500529-0001	Elution buffer preparation for Ni-column
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sangon Biotech	A600168-0025	Induction of protein overexpression
LB Broth Powder	Sangon Biotech	A507002-0250	E.coli. cell culture
L-Glutathione reduced (GSH)	Sigma-aldrich	G4251-100G	Elution buffer preparation for Glutathione beads
Ni-Sepharose excel beads	Cytiva	17371202	Affinity chromatography
N-Dodecyl beta-D-maltoside (DDM)	Sangon Biotech	A610424-001	Detergent for protein purification
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma-aldrich	T9281-100ML	SDS-PAGE gel preparation
PBS	Sangon Biotech	E607008-0500	Homogenization buffer for E.coli. cell
PMSF	Lablead	P0754-25G	Protease inhibitor
Prestained protein marker	Thermo Scientific	26619/26616	Prestained protein ladder
Size exclusion column (preparation grade)	Cytiva	28989336	HiLoad 26/60 Superdex 200 PG column
Size exclusion column (analytical grade)	Cytiva	29091596	Superose 6 Increase 10/300 GL column
Sodium chloride	Sangon Biotech	A501218-0001	Protein purification buffer preparation
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sangon Biotech	A500228-0001	SDS-PAGE gel/buffer preparation
Tris base	Sigma-aldrich	T1503-10KG	Protein purification buffer preparation
Ultrafiltration spin column	Millipore	UFC901096/801096	Protein concentration
Equipment
Analytical Balance	DENVER	APX-60	Metage of Drosophila head
Desk-top high-speed refrigerated centrifuge for 15mL and 50mL conical centrifugation tubes	Eppendorf	5810R	Protein concentration
Desk-top high-speed refrigerated centrifuge 1.5mL centrifugation tubes	Eppendorf	5417R	Centrifugation of Drosophila head lysate after homogenization
Empty gravity flow column (Inner Diameter=1.0cm)	Bio-Rad	738-0015	TRP protein purification
Empty gravity flow column (Inner Diameter=2.5cm)	Bio-Rad	738-0017	Bait and competitor protein purification from E.coli.
Gel Documentation System	Bio-Rad	Universal Hood II Gel Doc XR System	SDS-PAGE imaging
High-speed refrigerated centrifuge	Beckman coulter	Avanti J-26 XP	Centrifugation of E.coli. cells/cell lysate
High pressure homogenizer	UNION-BIOTECH	UH-05	Homogenization of E.coli. cells
Liquid nitrogen tank	Taylor-Wharton	CX-100	Drosophila head preparation
Protein purification system	Cytiva	AKTA purifier	Protein purification
Refrigerator (-80°C)	Thermo	900GP	Drosophila head preparation
Spectrophotometer	MAPADA	UV-1200	OD600 measurement of E.coli. cells
Spectrophotometer	Thermo Scientific	NanoDrop 2000c	Determination of protein concentration
Ultracentrifuge	Beckman coulter	Optima XPN-100 Ultracentrifuge	Ultracentrifugation