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Resumen

Phormidium lacuna es una cianobacteria filamentosa que se aisló de las piscinas de rocas marinas. Este artículo describe el aislamiento de filamentos de fuentes naturales, la extracción de ADN, la secuenciación del genoma, la transformación natural, la expresión de sfGFP, la crioconservación y los métodos de motilidad.

Resumen

Las cianobacterias son el foco de la investigación básica y los proyectos biotecnológicos en los que la energía solar se utiliza para la producción de biomasa. Phormidium lacuna es una cianobacteria filamentosa recién aislada. Este artículo describe cómo se pueden aislar nuevas cianobacterias filamentosas de las piscinas de rocas marinas. También describe cómo se puede extraer el ADN de los filamentos y cómo se pueden secuenciar los genomas. Aunque la transformación se establece para muchas especies unicelulares, se informa con menos frecuencia para las cianobacterias filamentosas. Aquí se describe un método simplificado para la transformación natural de P. lacuna. P. lacuna es el único miembro del orden Oscillatoriales para el que se establece la transformación natural. Este artículo también muestra cómo se utiliza la transformación natural para expresar la proteína fluorescente verde supercarpeta (sfGFP). Un promotor endógeno de cpcB indujo aproximadamente 5 veces más fuerte la expresión que los promotores cpc560, A2813 o psbA2 de Synechocystis sp. PCC6803. Además, se estableció un método para la criopreservación de P. lacuna y Synechocystis sp.CPP 6803, y se describen métodos para evaluar la motilidad en un medio líquido y en superficies de agar y plástico.

Introducción

Las cianobacterias son organismos procariotas que utilizan la fotosíntesis como fuente de energía 1,2. La investigación se centra cada vez más en las especies de cianobacterias. Varias cianobacterias se pueden transformar con ADN3. Los genes pueden ser eliminados o sobreexpresados en estas especies. Sin embargo, la transformación está restringida a unas pocas especies 4,5,6,7,8,9,10,11, y puede ser difícil establecer la transformación en cepas de colecciones de cultivo o silvestres 8. Las cepas de la especie filamentosa Phormidium lacuna (Figura 1) se aislaron de piscinas de rocas marinas, en las que las condiciones ambientales, como las concentraciones de sal o la temperatura, fluctúan con el tiempo. Estas cianobacterias filamentosas pueden ser utilizadas como organismos modelo para el orden Oscillatoriales12 al que pertenecen.

Durante los ensayos que probaron la transferenciade genes por electroporación 13,14 se encontró que P. lacuna puede ser transformada por transformación natural15. En este proceso, el ADN es absorbido naturalmente por algunas células. En comparación con otros métodos de transformación16,17, la transformación natural tiene la ventaja de no requerir herramientas adicionales que podrían complicar el procedimiento. Por ejemplo, la electroporación requiere cubetas adecuadas, cables intactos y selección del voltaje adecuado. P. lacuna es actualmente el único miembro de Oscillatoriales susceptible a la transformación natural. Debido a que el protocolo original se basa en protocolos de electroporación, todavía incluía varios pasos de lavado que podrían ser innecesarios. Se probaron diferentes enfoques para simplificar el protocolo, lo que llevó al protocolo de transformación que se presenta aquí.

La secuencia del genoma es esencial para futuros estudios moleculares basados en la eliminación o sobreexpresión de genes. Aunque las secuencias del genoma se pueden obtener con máquinas de secuenciación de próxima generación en períodos cortos, la extracción de ADN puede ser difícil y depende de la especie. Con P. lacuna, se probaron varios protocolos. Luego se estableció un método basado en bromuro de cetil trimetil amonio (CTAB) modificado, lo que resultó en una pureza aceptable de los rendimientos de ADN y ADN de cada ciclo de purificación para el trabajo continuo en el laboratorio. El genoma de cinco cepas podría secuenciarse con este protocolo. El siguiente paso lógico de transformación fue establecer la expresión de proteínas en P. lacuna.

El sfGFP utilizado como proteína marcador en este protocolo se puede detectar con cualquier microscopio de fluorescencia. Todos los promotores que se probaron se pudieron utilizar para la expresión de P. lacuna sfGFP. El creciente número de cepas derivadas de la transformación ha dado lugar a la necesidad de un método para almacenar los cultivos. Tales métodos se establecen para Escherichia coli y muchas otras bacterias18. En los protocolos estándar, los cultivos de glicerol se preparan, se transfieren en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 °C. Este método requiere solo unos pocos pasos y es altamente confiable para aquellas especies para las que está establecido. El protocolo estándar no era factible para P. lacuna porque las células vivas no podían recuperarse en todos los casos. Sin embargo, cuando se eliminó el glicerol después de la descongelación, las células de todos los ensayos sobrevivieron. Se presentan métodos simples para el análisis de la motilidad de P. lacuna, que se pueden combinar con mutagénesis knockout para investigar el pili tipo IV o el papel de los fotorreceptores. Estos ensayos son diferentes de los de las cianobacterias unicelulares 19,20,21 y también pueden ser útiles para otros oscilatorios.

Protocolo

1. Aislamiento del medio natural

NOTA: Se pueden aislar algas verdes, diatomeas, cianobacterias filamentosas y otras microalgas. El protocolo se puede utilizar para cualquier especie de microalga de piscinas de roca que crecen en condiciones de laboratorio. Las cianobacterias filamentosas que pertenecen a Oscillatoriales se pueden reconocer fácilmente por su movimiento y forma filamentosa. La especie se puede identificar en un estado semipuro mediante secuenciación del genoma o secuenciación de ARNr 16S.

  1. Transfiera muestras líquidas de agua de mar de piscinas de rocas marinas (es decir, cavidades en la costa rocosa) a matraces de 50 ml. Para cada matraz, anote el lugar exacto o las coordenadas de la fuente natural. Si es posible, filtre el contenido a través de redes de 50 μm para reducir las cantidades de zooplancton. Conservar las muestras a 4 °C hasta que puedan ser subcultivadas.
  2. Transferir 1 ml de cultivos a placas de Petri de 10 cm que contengan bactoa-agar al 3% en f/2 medio22,23 (ver la Tabla de Materiales). Preparar hasta 20 platos. Cultivar bajo luz blanca de 50 μmol m-2 s-1.
    NOTA: Se pueden utilizar intensidades de luz más altas para el cultivo. La intensidad de hasta 400 μmol m-2 s-1 se puede utilizar para P. lacuna, aunque otras especies podrían ser más sensibles a la luz.
  3. Después de una semana, transfiera las células deseadas a placas de agar fresco usando fórceps estériles. Aislar las células bajo un microscopio binocular en condiciones estériles. Guarde la placa de agar vieja a 4 °C hasta que aparezcan las células y crezcan en la nueva placa de agar.
  4. Repita este paso de transferencia cada semana para eliminar la contaminación. Utilice el ojo desnudo para detectar una gran contaminación y un microscopio con aumento de 400x para comprobaciones adicionales de contaminación.
  5. Si una muestra parece libre de contaminación, analice la contaminación bacteriana o fúngica en las placas de agar. Transfiera una fracción del cultivo con un lazo de inoculación a una placa de agar LB24 (10 cm de diámetro), mantenga la placa a temperatura ambiente y verifique el crecimiento de contaminantes durante 1-3 días.
  6. Si se obtiene una especie de cianobacteria filamentosa estéril, úsela para trabajos de cultivo adicionales. Cultive P. lacuna en líquido o en placas de bacto-agar. Utilice matraces de 250 ml con 50 ml de medio f/2 o medio f/2+ para el cultivo líquido.

2. Extracción de ADN

NOTA: Este método se adopta del 25 al 26

  1. Preparar dos matraces con 50 mL de f/2 medio. Inocular cada uno con ~1 mL de filamentos de P. lacuna de otros cultivos en crecimiento. Mantenga los cultivos durante 7 días o más bajo agitación (rotación horizontal) a 50 rpm bajo luz blanca (50 μmol m-2 s-1) a 25 °C.
  2. Tratar el cultivo con ultrasonido (ver la Tabla de Materiales) durante 2 min con plena energía. Medir OD a 750 nm; verifique que sea ~ 0.5. Continúe cultivando las culturas si el OD es demasiado bajo.
  3. Recoger los filamentos mediante centrifugación de 5.000 × g, 20 min. Retire el sobrenadante. Transfiera los filamentos con líquido residual a la cámara de una prensa francesa27. Ajuste la presión de la prensa francesa a 20.000 psi y extraiga las células.
    NOTA: La prensa francesa lisará todas las células y liberará el ADN; fuertes fuerzas de cizallamiento producirán fragmentos de ADN de 1.500 pb.
  4. Centrifugar la muestra durante 10 min a 10.000 × g y retirar el sobrenadante.
  5. Añadir 400 μL de tampón de lisis (4 M de urea, 0,1 M de Tris/Cl, pH 7,4) y 50 μL de proteinasa K (10 mg/ml) al pellet. Calentar la muestra a 55 °C durante 60 min con agitación a 550 rpm.
  6. Añadir 1 mL de tampón de extracción de ADN (3% CTAB, 1,4 M NaCl, 10 mM EDTA, 0,1 M Tris/Cl, 1% Sarkosyl, 0,1 M TDT, pH 8) e incubar durante 60 min a 55 °C y 550 rpm. Transfiera las soluciones a los tubos de centrifugación y agregue dos volúmenes de cloroformo/isoamilalcohol (24/1).
  7. Después de agitar, centrífugue la muestra durante 5 min a 9.000 × g. Transfiera la fase acuosa superior a viales de reacción y agregue 1 ml de etanol helado y 50 μL de acetato de sodio 3 M.
  8. Vórtice la muestra y colóquela a -20 °C durante 1 h o más.
  9. Centrifugar durante 5 min a 10.000 × g (4 °C) y desechar el sobrenadante. Lavar el pellet con etanol al 70%.
  10. Centrifugar la muestra de nuevo. Retire el sobrenadante y seque el pellet durante la noche. Disolver el ADN en agua libre de nucleasas. Mida el espectro de ADN para comprobar si el OD 260 nm/OD 280 nm está entre 1,6 y 1,9.
  11. Analizar el tamaño del ADN en un gel de electroforesis de agarosa28.
  12. Secuenciar el ADN genómico mediante secuenciación de próxima generación durante 300 ciclos, con un ajuste de extremo pareado y una longitud de lectura de 150 bases (consulte las Tablas de materiales).
  13. Realizar el montaje con el programa informático adecuado; véase el ejemplo que figura en la Tabla de materiales.
  14. Envíe el borrador del genoma al servidor RAST para su anotación.
    NOTA: Cargue secuencias de ADN para obtener una anotación completa en unos minutos.

3. Transformación natural y expresión GFP

NOTA: La transformación se basa en un vector plásmido propagado en E. coli; pGEM-T o pUC19 se pueden utilizar como vectores troncales. Las técnicas de clonación se establecen en muchos laboratorios; véanse también los protocolos estándar28 y los artículos sobre vectores de transformación para P. lacuna15,29. Los ejemplos de vectores para la expresión sfGFP se describen en la sección de resultados representativos. Los detalles de cuatro vectores aún no publicados se proporcionan en el Archivo Suplementario 1.

  1. Realice todos los pasos utilizando material estéril en condiciones de laboratorio estériles (banco limpio, cristalería estéril).
  2. Inocular 2 x 50 mL de medio líquido f/2 en dos matraces de 250 mL con 2 x 1 mL de filamentos de P. lacuna de un cultivo en funcionamiento. Cultivar en luz blanca (50 μmol m-2 s-1) bajo agitación (rotación horizontal, 50 rpm) durante ~5 días a 25 °C.
  3. Prepare ~ 200 μg del ADN del vector de transformación utilizando un kit de preparación midi (consulte la Tabla de materiales) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  4. Homogeneizar 100 mL de suspensión de células de P. lacuna (ver tabla de materiales) a 10.000 rpm durante 3 min. Mida OD a 750 nm (valor deseado = 0,35).
  5. Centrifugar la suspensión celular durante 15 min a 6.000 × g. Retire el sobrenadante y suspenda el pellet en 800 μL (volumen total, incluido el líquido residual y los filamentos) del líquido restante y el medio f/2+ adicional.
  6. Tomar ocho placas de bacto-agar f/2+ (10 cm de diámetro) que contengan 120 μg/ml de kanamicina. Pipetear 10 μg de ADN en el centro de cada placa de agar. Pipetee inmediatamente 100 μL de suspensión celular en el centro de cada placa de agar (en la parte superior del ADN).
  7. Mantenga la placa de agar sin tapa en el banco limpio para permitir que el exceso de líquido se evapore. Cierre la placa y cultive en luz blanca a 25 °C durante 2 días.
  8. Distribuya los filamentos de cada placa de agar con un lazo de inoculación en varias placas frescas de bacto-agar f/2+ que contengan 120 μg/ml de kanamicina. Cultive las placas en luz blanca a 25 °C y revise los cultivos regularmente bajo un microscopio.
  9. Identifique filamentos vivos y transformados después de 7-28 días bajo el microscopio. Busque filamentos verdes sanos (Figura 2) que sean diferentes de otros filamentos. Si se pueden identificar estos filamentos verdes, continúe con el siguiente paso; de lo contrario, mantenga el plato durante otros 7 días.
  10. Use fórceps para transferir estos filamentos vivos identificados a 50 ml de medio líquido f/2+ con 250 μg/ml de kanamicina. Cultivar en luz blanca a 25 °C en un agitador (rotación horizontal, 50 rpm). Observe el crecimiento hasta por cuatro semanas.
  11. Transfiera los filamentos de nuevo al medio de agar que contiene 250 μg/ml de kanamicina y espere a que los filamentos crezcan. Después de varios días, transfiera filamentos individuales a una placa de agar fresco con una mayor concentración de kanamicina, por ejemplo, 500 μg / ml. Mantenga la placa original.
  12. Asegúrese de que los filamentos se propaguen en una alta concentración de kanamicina en cultivo líquido o en agar. Aumentar la concentración de kanamicina de nuevo para acelerar la segregación.
    NOTA: P. lacuna transformada crece en hasta 10.000 μg/ml de kanamicina. Otras especies podrían no tolerar concentraciones tan altas.
  13. Si las células resistentes se cultivan y distribuyen ampliamente sobre una placa, pruebe la integración del inserto en el genoma de P. lacuna mediante la realización de PCR con cebadores externos e internos.
    1. Utilice cebadores que fueron diseñados para la clonación de la inserción como cebadores internos.
    2. Para el diseño de los cebadores externos, seleccione secuencias que sean 5' y 3' del sitio de inserción propuesto en el genoma de P. lacuna pero fuera de la inserción.
    3. Para las reacciones de PCR, use imprimaciones internas y cebadores externos. Utilice la(s) cepa(s) resistente(s) y el tipo salvaje.
      NOTA: Los cebadores internos indican que el inserto está presente; Los cebadores externos muestran que el inserto se inserta en el locus correcto.
  14. Para cada reacción de PCR, coloque ~ 10 mg de los filamentos directamente en los tubos de PCR y realice PCR de acuerdo con los protocolos estándar24. Si no se obtiene ningún producto, varíe la temperatura de recocido y lave los filamentos con agua.
    NOTA: Se pueden usar muchas polimerasas diferentes en la PCR. Las polimerasas estándar, como la polimerasa Taq, tienen una tasa de error más alta que las polimerasas de comprobación de errores, que son más caras. Esta PCR analítica no requiere ninguna polimerasa de comprobación de errores. Sin embargo, se debe probar la polimerasa de comprobación de errores si no se obtiene ningún producto de PCR con una polimerasa estándar.
  15. Analizar los productos de PCR de la línea resistente sobre electroforesis de agarosa24.
    1. Compare las posiciones de la banda con el marcador y compare el tipo salvaje y el transformante. Con imprimaciones internas y externas, busque una banda más grande para el transformador que el tipo salvaje (debido a la inserción del cassette de resistencia) o dos bandas para el transformador: una con el tamaño de la banda de tipo salvaje y otra más grande. Como este último caso indica una segregación incompleta, continúe el cultivo con altas concentraciones de kanamicina.
      NOTA: Para obtener más detalles sobre la PCR y la electroforesis, consulte15,24 u otra literatura estándar.
  16. Para la expresión de GFP: observe filamentos individuales con un microscopio de fluorescencia (consulte la Tabla de materiales) a un aumento del objetivo establecido en 40x o 63x. Capture una imagen de transmisión de campo brillante y una imagen de fluorescencia. Utilice los siguientes ajustes para GFP: paso de banda de 470 nm para la excitación, paso de banda de 525 nm para la emisión y un divisor de haz de 495 nm, tiempo de exposición inicial de 500 ms.
  17. Ajuste el tiempo de exposición para obtener señales de fluorescencia claras, evitando intensidades de saturación. Intente utilizar la misma configuración para todas las muestras.
  18. Como los filamentos de tipo salvaje también mostrarán fluorescencia, capture imágenes con la misma configuración que la anterior para esta fluorescencia de fondo.
    NOTA: La cepa que expresa GFP debe tener una señal más alta; de lo contrario, no está expresando GFP.
  19. En función de los tiempos de exposición y las intensidades de píxeles de las imágenes de fluorescencia, calcule y compare el contenido de GFP de los diferentes filamentos.

4. Crioconservación

NOTA: P. lacuna y la cianobacteria unicelular Synechocystis sp. Se utiliza PCC 6803. El método actual funciona mejor para P. lacuna.

  1. Cultivar P. lacuna o Synechocystissp PCC 6803 durante al menos 10 días en 10 mL de medio f/2+ o BG-11, respectivamente, bajo luz blanca (50 μmol m-2 s-1) a 25 °C bajo agitación (rotaciones horizontales, 50 rpm).
  2. Homogeneizar el cultivo de P. lacuna (ver la Tabla de Materiales) a 10.000 rpm durante 3 min o con un dispositivo de ultrasonido (ver la Tabla de Materiales) durante 2 min a plena energía. Determine OD 750 nm de cualquiera de las referencias culturales para comprobar si el valor está entre 1 y 7.
  3. Recoger las células por centrifugación a 6.000 × g durante 15 min. Retire el sobrenadante.
  4. Suspender el pellet celular en 800 μL de medio f/2+ o BG-11 (volumen final) y transferirlo a un criovial de 2 mL. Añadir 800 μL de una solución de glicerol al 50% a la suspensión celular. Cierre el vial y mezcle invirtiendo repetidamente.
  5. Transfiera el criovial al nitrógeno líquido y guárdelo en un criobox en un congelador de -80 °C. Anote la posición de la caja dentro del congelador y las coordenadas de la muestra dentro de la caja.
  6. Para la recuperación de las células, saque el criovial y descongele el contenido a temperatura ambiente. Transfiera el contenido a un tubo de reacción de 2 ml.
  7. Lave la muestra dos veces. Para el1er lavado, centrifugar a 6.000 × g durante 5 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 2 ml de medio f/2+ o BG-11. Para elsegundo lavado, recentrífugo a 6.000 × g durante 5 min, retire el sobrenadante y suspenda el pellet en 2 ml de medio f/2+ o BG-11.
  8. Para comprobar la integridad de estas células que están listas para el cultivo, transfiera el pellet a 9 mL de medio y cultivarlos en luz blanca (50 μmol m-2 s-1) bajo agitación (55 rpm). Compare los OD 750 nm del cultivo el primer día y después de 1 semana.

5. Motilidad de Phormidium lacuna

NOTA: Se describirán tres ensayos diferentes. La misma cultura se utiliza en todos los casos.

  1. Cultive P. lacuna en medio f/2 bajo agitación horizontal (50 rpm) en luz blanca (50 μmol m-2 s-1) durante ~5 días hasta que el OD estimado de 750 nm sea de 0.35. Conservar la muestra a 4 °C hasta su uso.
  2. Homogeneizar los filamentos (ver la Tabla de Materiales) a 10.000 rpm durante 3 min o con ultrasonido (ver la Tabla de Materiales) durante 1 min a potencia máxima y ciclo de 1. Medida OD 750 nm. Si está por encima de 0,35, diluya la fracción con f/2 medio. Utilice esta solución en ensayos de motilidad en los pasos 5.3, 5.4 y 5.5.
  3. Ensayo para el movimiento en medio líquido
    1. Para la observación directa de la motilidad, transfiera 8 ml de medio que contenga P. lacuna (a partir del paso 5.2) a una placa de Petri de 6 cm. Espere unos minutos hasta que la muestra alcance la temperatura ambiente. Cubra la placa de Petri con papel de celofán.
    2. Coloque un portaobjetos de microscopio en la mesa x-y de un microscopio estándar con una cámara. Encienda la luz del microscopio. Idealmente, siempre use la misma configuración eléctrica y óptica para la iluminación. Mueva un objetivo 4x o 10x en el camino de la luz.
    3. Coloque la placa de Petri en la parte superior de la diapositiva. Ajuste filamentos individuales o haces de filamentos por los movimientos x, y y z de la mesa.
      NOTA: Debido a la disposición tridimensional, solo una parte de la sección relevante puede estar enfocada. La lámina de celofán permite ajustar el enfoque sin restricciones.
    4. Observe los movimientos de filamentos individuales o haces. Asegúrese de que la lente del objetivo no toque el líquido. Grabe los movimientos de los filamentos con una cámara de microscopio estándar (consulte el video suplementario S1).
  4. Ensayo para el movimiento en la superficie
    1. Para la observación de la motilidad del filamento en superficies de agar, prepare placas de Petri de 6 cm con f/2 bacto-agar. Asegúrese de que el agar sea lo suficientemente alto como para que la lente del objetivo se acerque a la superficie del agar. Alternativamente, prepare una capa de agar de ~ 3 mm de espesor y registre los filamentos a través del agar (mantenga la placa boca abajo o use un microscopio invertido).
    2. Pipetear 0,5 ml de una solución que contenga P. lacuna (a partir del paso 5.2) sobre la superficie de bacto-agar de una placa de Petri de 6 cm. Permita que el líquido entre en la superficie. Cierre la placa de Petri y observe el movimiento de los filamentos en la superficie utilizando un objetivo de 4x o 10x.
    3. Asegúrese de que se utilizan los mismos ajustes eléctricos y ópticos del microscopio durante toda la grabación y en las grabaciones posteriores.
    4. Capture grabaciones de lapso de tiempo utilizando una cámara ocular y un sistema de minicomputadora. Asegúrese de que el intervalo de tiempo entre las imágenes posteriores sea de 5 s-1 min. Programe el script Linux de la minicomputadora para controlar la grabación de lapso de tiempo. Consulte el archivo complementario 2 para ver un script de ejemplo y el vídeo suplementario S2 como ejemplo.
  5. Ensayo para fototaxis
    1. Para experimentos de fototaxis, prepare soportes de diodos emisores de luz (LED) (aquí, con una impresora 3D) en los que se montan los LED de 5 mm seleccionados para irradiar un área de 20 mm2 de abajo hacia arriba (Figura 3). Si es necesario, use muchos soportes LED en paralelo, conectando cada LED eléctricamente a través de una resistencia y potenciómetro a una fuente de alimentación ajustable. Mida y ajuste las intensidades del LED, dependiendo del experimento. Asegúrese de que toda la configuración esté en una habitación oscura o en un recipiente oscuro cerrado.
    2. Coloque 8 ml del medio que contiene P. lacuna (a partir del paso 5.2) en una placa de Petri de 6 cm. Ajuste la intensidad de la luz del LED. Cierre la placa de Petri con la tapa y colóquela en un soporte LED para que el LED esté en el centro de la placa de Petri.
    3. Después de la duración deseada (generalmente 2 días), capture una imagen de la placa de Petri con una cámara de teléfono inteligente dirigida directamente a la posición del tratamiento de luz. Utilice un panel LED blanco para la irradiación de la muestra. Utilice la configuración manual de la cámara; evitar los reflejos de la luz; ajuste siempre para obtener la misma distancia entre la lente de la cámara y la muestra. Asegúrese de que la configuración de exposición proporcione una imagen adecuada para análisis posteriores utilizando ImageJ.
    4. Cuantifique el diámetro del círculo central de filamentos utilizando el software ImageJ.
      1. Abra ImageJ, haga clic en archivo | Abrir, seleccione el archivo deseado y haga clic en Entrar.
      2. Seleccione el botón Recto (con una línea recta). Pulse el botón izquierdo del ratón para dibujar una línea desde un extremo de la placa de Petri hasta el extremo opuesto. Asegúrese de que la línea pase a través del centro del círculo de filamentos.
      3. Presione Ctrl-K en el teclado o haga clic en Analizar | Trazar perfil en el menú ImageJ. Busque una ventana x-y con intensidades de píxeles trazadas frente a distancia: un perfil 1D de la placa de Petri. Asegúrese de que la intensidad de píxeles más baja esté ligeramente por encima de 0 y el valor más alto por debajo de 255.
      4. Calcule un valor promedio para la intensidad de píxeles fuera del círculo y otro valor promedio para la intensidad de píxeles en el círculo. En la posición y- entre estos valores, calcule los valores x de ambos lados del círculo apuntando con el ratón a estas posiciones. Anote ambos valores y calcule la diferencia.
      5. Obtenga el valor x más alto apuntando el ratón al eje y de la derecha. Nótese que este valor e representa el diámetro de la placa de Petri. Si este diámetro es de 5 cm, calcule el diámetro del círculo central del filamento como d/e × 5 cm.

Resultados

Siguiendo los métodos mencionados anteriormente, se aislaron 5 cepas diferentes de P. lacuna de los pozos de rocas y se secuenciaron (Figura 1 y Tabla 1). Todos los cultivos fueron estériles después de ~ 1 año de subcultivo excepto P. lacuna HE10JO. Esta cepa todavía está contaminada con Marivirga atlantica, una bacteria marina. Durante las excursiones posteriores a Helgoland, otras cianobacterias filamentosas se aislaron de piscinas de roca,...

Discusión

Aunque muchas cepas de cianobacterias están disponibles en colecciones de cultivo 32,33,34,35,36, todavía hay una demanda de nuevas cianobacterias de la naturaleza porque estas especies están adaptadas a propiedades específicas. P. lacuna se recogió de los pozos de roca y se adapta a las variaciones de las concentraciones de sal y la temperatura<...

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

El trabajo fue apoyado por el Instituto de Tecnología de Karlsruher.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Autoclave 3870 ELVTuttnauer3870 ELV
Bacto AgarOttoNorwald214010
BG-11 Freshwater SolutionSigma AldrichC3061
BG-11 mediumMerck73816-250ML
Boric acidMerck10043-35-3H3BO3
Calcium chloride dihydrateCarl Roth10035-04-8CaCl2 · 2 H2O
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 250 mLGreiner658190
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 50 mLGreiner601975
Centrifuge LYNX 4000Thermo Scientific75006580and rotor
Centrifuge microstar 17VWR InternationalN/Afor up to 13,000 rpm
Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB)PanReac AppliChem57-09-0C19H42BrN
Chloroform : Isoamyl Alcohol 24 : 1PanReac AppliChem
A1935
Cobalt(II) chloride hexahydrateMerck7791-13-1CoCl2 · 6 H2O
Copper(II) sulphate pentahydrateMerck7758-99-8 CuSO4 · 5 H2O
D(+)-BiotinCarl Roth58-85-5 C10H16N2O3S
DNA ladder 1 kbNew England BiolabsN3232
DNA ladder 100 bpNew England BiolabsN3231
Electrical pipetting help accujet-pro SBrand GmbH26360for pipetting 1-25 mL
EthanolVWR64-17-5C2H6O
Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrateCarl Roth6381-92-6EDTA-Na2 · 2 H2O
Fluorescence microscope ApoTomeZeiss
Fluorescence microscope Axio Imager 2Zeiss
French Pressure Cell PressAmerican Instrument CompanyN/A
Gel documation System Saffe ImageInvitrogen
Gelelctrophoresis system Mupid-One/-exuADVANCED
Glassware, different
GlycerolCarl Roth56-81-5C3H8O3
Iron(III) chloride hexahydrateMerck10025-77-1 FeCl3 · 6 H2O
KanamycinSigma-Aldrich25389-94-0
Kanamycin sulphateCarl Roth25389-94-0C18H36N4O11 · H2SO4
Lauroylsarcosine, Sodium Salt (Sarcosyl)Sigma Aldrich137-16-6C15H28NO3 · Na
LB Broth (Lennox)Carl RothX964.4
Light source, fluorescent tube L18W/954 daylightOSRAMcultivation of cyanobacteria
Light source, LED panel XL 6500K 140 WBloom StarN/Acultivation of cyanobacteria, up to 1,000 µmol m-2 s-1
Magnesium chloride hexahydrateCarl Roth7791-18-6MgCl2 · 6 H2O
Manganese(II) chloride tetrahydrateServa13446-34-9MnCl2 · 4 H2O
Microscope DM750Zeiss
Midi prep plasmid extraction kit NucleoBond Xtra Midi kitMacherey-NAGEL GmbH & Co. KGREF740410.50
Minicomputer Raspberry Pi 4 +Conrad Electronics2138863-YDfor time-lapse recording
Ocular camera EC3Leicafor continuous recording up to 30 s
Ocular camera MikrOkular Full HDBresserfor time-lapse recordings, coupled to Raspberry Pi minicomputer
Petri dishes polystyrole, 100 mm x 20 mmMerckP5606-400EA
Petri dishes polystyrole, 60 mm x 15 mmMerckP5481-500EA
Photometer Nanodrop ND-1000Peqlab Biotechnologie
Photometer Uvikon XSGoebel Instrumentelle Analytik GmbH
Pipetman 100-1,000 µLGilsonSKU: FA10006M
Pipetman 10-100 µLGilsonSKU: FA10004M
Plastic pipettes 10 mL, sterileGreiner607107
Plastic tube, sterile, 15 mLGreiner188271
Plastic tube, sterile, 50 mLGreiner227261
Potassium bromideCarl Roth7758-02-3KBr
Potassium chlorideCarl Roth7447-40-7KCl
Power supply Statron 3252-1Statron Gerätetechnik GmbH
Power supply Voltcraft PPS 16005Conrad Electronicsfor LED
Proteinase KPromegaMC500Cfrom Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470
Q5 polymeraseNew England BiolabsM0491S
Sequencing kit NextSeq 500/550 v2.5Illumina
Sequencing system NextSeq 550 SY-415-1002Illumina
Shaker Unimax 2010Heidolph Instrumentsfor cultivation
Sodium acetateCarl Roth127-09-3NaCH3COO
Sodium chlorideCarl Roth7647-14-5NaCl
Sodium dihydrogen phosphate monohydrateCarl Roth10049-21-5NaH2PO4 · H2O
Sodium fluorideCarl Roth7681-49-4NaF
Sodium hydrogen carbonateCarl Roth144-55-8NaHCO3
Sodium molybdate dihydrateServa10102-40-6Na2MoO4 · 2 H2O
Sodium nitrateMerck7631-99-4NaNO3
Sodium sulphateCarl Roth7757-82-6Na2SO4
Strontium chloride hexahydrateCarl Roth10025-70-4SrCl2 · 6 H2O
Thiamine hydrochlorideMerck67-03-8C12H17ClN4OS · HCl
TRISCarl Roth77-86-1C4H11NO3
Ultrasonic device UP100H with sonotrode MS3Hielscher Ultrasound TechnologyUP100H
Ultraturrax Silent Crusher MHeidolph Instrumentshomogenizer
UreaCarl Roth57-13-6CH4N2O
Vitamin B12Sigma68-19-9C63H88CoN14O14P
Vitamin solution0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin
Water Stills, Water treatmentVEOLIA water technologiesELGA_21001
Zinc sulphate heptahydrateSigma7446-20-0ZnSO4 · 7 H2O
software, URL
gatb-minia program for DNA assemblyhttps://github.com/GATB/gatb-minia-pipelinemakes large scaffolds from short DNA reads, Linux based
ImageJsoftware for immage processing (pixel intensities, circle diameter)
RAST annotation serverhttps://rast.nmpdr.orginput: genome DNA sequence, detects open reading frames, lists protein sequences and their functions
Culture media
Artificial seawater0.41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM  KCl , 2.4 mM NaHCO3 ,0.84 mM KBr, 0.49 mM H3BO3, 90 µM SrCl2, 72 µM NaF
f/2 -liquid mediumartificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution, 0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4 
f/2+ liquid mediumf/2-medium, with 10 times increased NaNO3 and NaH2PO4 (0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
f/2+-agar3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,8.8 mM NaNO3, 0.36 mM NaH2PO4
f/2-agar3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
Trace element solution0.36 mM NaH2PO4, 12 µM Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0.91 µM MnCl2
Vitamin solution0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin

Referencias

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