טרנספורמציה טבעית, ביטוי חלבונים ושימור קריו-קונסרבציה של הציאנובקטריום הנימה פורמידיום לקונה

Summary

פורמידיום לקונה (שם מדעי: Phormidium lacuna ) הוא ציאנובקטריום נימה שבודד מסלעים ימיים. מאמר זה מתאר את הבידוד של חוטים ממקורות טבעיים, מיצוי DNA, ריצוף גנום, טרנספורמציה טבעית, ביטוי של sfGFP, קריוקונסרבציה ושיטות תנועתיות.

Abstract

ציאנובקטריה הם המוקד של מחקר בסיסי ופרויקטים ביוטכנולוגיים שבהם אנרגיה סולארית מנוצלת לייצור ביומסה. פורמידיום לקונה (שם מדעי: Phormidium lacuna ) הוא ציאנובקטריום נימה שבודד לאחרונה. מאמר זה מתאר כיצד ניתן לבודד ציאנובקטריה נימה חדשה מבורות סלעים ימיים. הוא גם מתאר כיצד ניתן לחלץ דנ"א מחוטים וכיצד ניתן לרצף את הגנומים. אף על פי שהטרנספורמציה נוצרת עבור מינים חד-תאיים רבים, היא מדווחת בתדירות נמוכה יותר על ציאנובקטריה נימה. שיטה פשוטה לטרנספורמציה הטבעית של P. lacuna מתוארת כאן. P. lacuna הוא החבר היחיד במסדר מתנדים שעבורו נוצרת טרנספורמציה טבעית. מאמר זה גם מראה כיצד טרנספורמציה טבעית משמשת לביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק בעל קיפול יתר (sfGFP). מקדם cpcB אנדוגני גרם לביטוי חזק בערך פי 5 מאשר מקדמי cpc560, A2813 או psbA2 מ- Synechocystis sp. PCC6803. יתר על כן, הוקמה שיטה לשמירת ההקפאה של P. lacuna ו - Synechocystis sp.CPP 6803, ותוארו שיטות להערכת תנועתיות בתווך נוזלי ועל משטחי אגר ופלסטיק.

Introduction

ציאנובקטריה הם אורגניזמים פרוקריוטים המשתמשים בפוטוסינתזה כמקור אנרגיה ^1,2. המחקר מתמקד יותר ויותר במינים ציאנובקטריאליים. ניתן לשנות מספר ציאנובקטריה באמצעות DNA³. גנים יכולים להיות מופלים או ביטוי יתר במינים אלה. עם זאת, השינוי מוגבל למינים בודדים 4,5,6,7,8,9,10,11, וזה יכול להיות קשה לבסס טרנספורמציה בזנים מאוספי תרבויות או 8 בטבע. זנים של המין הנימה Phormidium lacuna (איור 1) בודדו מבורות סלעים ימיים, שבהם התנאים הסביבתיים, כגון ריכוזי מלחים או טמפרטורה, משתנים עם הזמן. ציאנובקטריה נימה זו יכולה לשמש כאורגניזמים לדוגמה לסדר Oscillatoriales¹² שאליו הם שייכים.

במהלך ניסויים שבדקו העברת גנים על ידי אלקטרופורציה^13,14 נמצא כי P. lacuna יכול להשתנות על ידי טרנספורמציה טבעית¹⁵. בתהליך זה, הדנ"א נקלט באופן טבעי על ידי תאים מסוימים. בהשוואה לשיטות אחרות של טרנספורמציה^16,17, לטרנספורמציה טבעית יש יתרון בכך שאינה דורשת כלים נוספים שעלולים לסבך את ההליך. לדוגמה, אלקטרופורציה דורשת cuvettes תקין, חוטים שלמים, ובחירת המתח הנכון. P. lacuna הוא כיום חבר המתנדים היחיד הרגיש לטרנספורמציה טבעית. מכיוון שהפרוטוקול המקורי מבוסס על פרוטוקולי אלקטרופורציה, הוא עדיין כלל מספר שלבי כביסה שעשויים להיות מיותרים. גישות שונות נבדקו כדי לפשט את הפרוטוקול, מה שהוביל לפרוטוקול הטרנספורמציה שהוצג כאן.

רצף הגנום חיוני למחקרים מולקולריים נוספים המבוססים על נוקאאוט גנים או ביטוי יתר. למרות שניתן להשיג רצפי גנום עם מכונות ריצוף מהדור הבא תוך תקופות קצרות, מיצוי הדנ"א יכול להיות קשה ותלוי במין. עם P. lacuna נבדקו מספר פרוטוקולים. לאחר מכן הוקמה שיטה שונה המבוססת על צטיל טרימתיל אמוניום ברומיד (CTAB), וכתוצאה מכך נוצרה טוהר מקובל של דנ"א ותפוקות DNA של כל מחזור טיהור להמשך העבודה במעבדה. ניתן לרצף את הגנום של חמישה זנים באמצעות פרוטוקול זה. שלב הטרנספורמציה ההגיונית הבא היה לבסס ביטוי חלבונים ב-P. lacuna.

ניתן לזהות את ה-sfGFP המשמש כחלבון סמן בפרוטוקול זה באמצעות כל מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כל היזמים שנבדקו יכלו לשמש לביטוי P. lacuna sfGFP. המספר ההולך וגדל של זנים הנובעים מטרנספורמציה הביא לצורך בשיטה לאחסון התרבויות. שיטות כאלה הוקמו עבור Escherichia coli וחיידקים רבים אחרים¹⁸. בפרוטוקולים סטנדרטיים, תרביות גליצרול מוכנות, מועברות בחנקן נוזלי ומאוחסנות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. שיטה זו דורשת רק כמה צעדים והיא אמינה מאוד עבור אותם מינים שעבורם היא הוקמה. הפרוטוקול הסטנדרטי לא היה אפשרי עבור P. lacuna מכיוון שלא ניתן היה לשחזר תאים חיים בכל המקרים. עם זאת, כאשר הגליצרול הוסר לאחר ההפשרה, תאים של כל הניסויים שרדו. שיטות פשוטות מוצגות לניתוח תנועתיות של P. lacuna, אשר ניתן לשלב עם מוטגנזה נוקאאוט כדי לחקור סוג IV pili או את התפקיד של photoreceptors. מבחנים אלה שונים מאלו של ציאנובקטריה חד-תאית 19,20,21 ויכולים להיות שימושיים גם עבור תנודות אחרות.

Protocol

1. בידוד מהסביבה הטבעית

הערה: ניתן לבודד אצות ירוקות, דיאטומים, ציאנובקטריה נימה ומיקרו-אצות אחרות. הפרוטוקול יכול לשמש עבור כל מיני מיקרו-אלגה מבורות סלעים הגדלים בתנאי מעבדה. ציאנובקטריה נימה השייכת לתנודות ניתן לזהות בקלות על ידי תנועתם וצורתם החוטית. ניתן לזהות את המין במצב חצי-פורה על ידי ריצוף גנום או ריצוף 16S rRNA.

1. העברת דגימות מי ים נוזליים מבורות סלע ימיים (כלומר, חללים בחוף הסלעי) לצלוחיות של 50 מ"ל. עבור כל בקבוקון, שים לב למיקום המדויק או לקואורדינטות של המקור הטבעי. במידת האפשר, סנן את התוכן דרך רשתות של 50 מיקרומטר כדי להפחית את כמויות הזואופלנקטון. אחסנו את הדגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שניתן יהיה לאחסן אותן בתת-תרבות.
2. מעבירים תרביות של 1 מ"ל ל-10 ס"מ צלחות פטרי המכילות 3% בקט-אגר ב-f/2 בינוני ^22,23 (ראו טבלת החומרים). הכן עד 20 צלחות. מטפחים תחת אור לבן של 50 מיקרומול ^{m-2 s-1}.
   הערה: ניתן להשתמש בעוצמות אור גבוהות יותר לטיפוח. עוצמה של עד 400 מיקרומול ^{m-2 s-1} יכולה לשמש עבור P. lacuna, אם כי מינים אחרים עשויים להיות רגישים יותר לאור.
3. לאחר שבוע, מעבירים את התאים הרצויים לצלחות אגר טריות באמצעות מלקחיים סטריליים. לבודד את התאים תחת מיקרוסקופ דו-עיני בתנאים סטריליים. אחסנו את צלחת האגר הישנה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שהתאים יופיעו ויגדלו על צלחת האגר החדשה.
4. חזור על שלב העברה זה מדי שבוע כדי למנוע זיהום. השתמש בעין בלתי לאיתור זיהום כבד ובמיקרוסקופ עם הגדלה של פי 400 לבדיקות נוספות לזיהום.
5. אם דגימה נראית נקייה מזיהום, בדוק זיהום חיידקי או פטרייתי על צלחות אגר. מעבירים שבריר מהתרבית עם לולאת חיסון ללוח אגר LB²⁴ (קוטר 10 ס"מ), שומרים על הצלחת בטמפרטורת החדר, ובודקים את צמיחת המזהמים במשך 1-3 ימים.
6. אם מתקבל מין ציאנובקטריאלי נימה סטרילי, השתמש בו לעבודת תרבית נוספת. טפחו P. lacuna בנוזל או על צלחות בקטו-אגר. השתמש בצלוחיות של 250 מ"ל עם 50 מ"ל של f/2 בינוני או f/2⁺ בינוני לתרבית נוזלית.

2. מיצוי DNA

הערה: שיטה זו מאומצת מ ^{- 25 26}

1. הכן שני צלוחיות עם 50 מ"ל של f /2 בינוני. חסן כל אחד עם ~ 1 מ"ל של חוטי P. lacuna מתרבויות צומחות אחרות. שמור את התרביות במשך 7 ימים או יותר תחת תסיסה (סיבוב אופקי) ב 50 סל"ד תחת אור לבן (50 μmol ^{m-2 s-1}) ב 25 °C (74 °F).
2. טפלו בתרבית באמצעות אולטרסאונד (ראו את טבלת החומרים) למשך 2 דקות באנרגיה מלאה. מדוד OD ב- 750 ננומטר; בדוק כדי לוודא שזה ~ 0.5. המשך להגדיל את התרבויות אם ה- OD נמוך מדי.
3. לאסוף את החוטים על ידי 5,000 × גרם, 20 דקות צנטריפוגה. הסר את ה-supernatant. העבר את החוטים עם שאריות נוזלים לחדר של מכבש צרפתי²⁷. הגדר את הלחץ של העיתונות הצרפתית ל-20,000 psi וחלץ את התאים.
   הערה: העיתונות הצרפתית תשקר את כל התאים ותשחרר את הדנ"א; כוחות גזירה חזקים ייצרו 1,500 שברי דנ"א של bp.
4. צנטריפוגה הדגימה במשך 10 דקות ב 10,000 × g ולהסיר את supernatant.
5. הוסיפו לכדור 400 μL של מאגר ליזיס (4 M אוריאה, 0.1 M Tris/Cl, pH 7.4) ו-50 μL של פרוטאינאז K (10 מ"ג/מ"ל). מחממים את הדגימה ל-55 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות עם רעידות ב-550 סל"ד.
6. הוסף 1 מ"ל של מאגר מיצוי DNA (3% CTAB, 1.4 M NaCl, 10 mM EDTA, 0.1 M Tris/Cl, 1% Sarkosyl, 0.1 M DTT, pH 8) ודגירה במשך 60 דקות ב 55 °C ו 550 סל"ד. העבר את הפתרונות לצינורות צנטריפוגה, והוסף שני נפחים של כלורופורם/איזואמילקוהול (24/1).
7. לאחר הרעידות, צנטריפוגה הדגימה במשך 5 דקות ב 9,000 × גרם. מעבירים את השלב העליון והמימי לבקבוקוני התגובה ומוסיפים 1 מ"ל של אתנול קר כקרח ו-50 μL של 3 M נתרן אצטט.
8. סובבו את הדגימה והניחו אותה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת או יותר.
9. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 10,000 × גרם (4 ° C) ולהשליך את supernatant. לשטוף את הכדור עם 70% אתנול.
10. צנטריפוגה שוב את המדגם. מוציאים את הסופרנטנט ומייבשים את הכדור למשך הלילה. ממיסים את הדנ"א במים נטולי נוקלאזות. מדוד את ספקטרום הדנ"א כדי לבדוק אם OD 260 ננומטר/OD 280 ננומטר הוא בין 1.6 ל-1.9.
11. לנתח את גודל הדנ"א על ג'ל אלקטרופורזה אגרוז²⁸.
12. רוצחו את הדנ"א הגנומי לפי ריצוף הדור הבא במשך 300 מחזורים, עם הגדרת קצה מזווגת ואורך קריאה של 150 בסיסים (ראו טבלאות חומרים).
13. בצע את ההרכבה עם תוכנית המחשב המתאימה; ראה את הדוגמה שניתנה בטבלת החומרים.
14. שלח את טיוטת הגנום לשרת RAST לביאור.
    הערה: העלה רצפי דנ"א כדי לקבל ביאור מלא תוך מספר דקות.

3. טרנספורמציה טבעית וביטוי GFP

הערה: הטרנספורמציה מבוססת על וקטור פלסמיד המופץ ב- E. coli; pGEM-T או pUC19 עשויים לשמש כווקטורים של עמוד שדרה. טכניקות שיבוט מבוססות במעבדות רבות; ראה גם פרוטוקולים סטנדרטיים²⁸ והמאמרים על וקטורי טרנספורמציה עבור P. lacuna^15,29. דוגמאות לווקטורים לביטוי sfGFP מתוארות בסעיף התוצאות הייצוגיות. פרטים על ארבעה וקטורים שטרם פורסמו מופיעים בקובץ משלים 1.

1. בצע את כל השלבים באמצעות חומר סטרילי בתנאי מעבדה סטריליים (ספסל נקי, כלי זכוכית סטריליים).
2. חסן 2 x 50 מ"ל של f/2 תווך נוזלי בשני צלוחיות 250 מ"ל עם 2 x 1 מ"ל של חוטי P. lacuna מתרבות ריצה. יש לטפח באור לבן (50 μmol m-2 ^s-1) תחת תסיסה (סיבוב אופקי, 50 סל"ד) במשך ^כ-5 ימים ב-25 מעלות צלזיוס.
3. הכן כ-200 מיקרוגרם של הדנ"א וקטורי של הטרנספורמציה באמצעות ערכת הכנה של midi (ראה טבלת החומרים) בהתאם להוראות היצרן.
4. הומוגניזציה של 100 מ"ל של תרחיף תא P. lacuna (ראה טבלת החומרים) ב-10,000 סל"ד למשך 3 דקות. מדוד OD ב- 750 ננומטר (ערך רצוי = 0.35).
5. צנטריפוגה של תרחיף התא למשך 15 דקות ב-6,000 × גרם. הסר את הסופרנטנט, והשעה את הכדור ב- 800 μL (נפח כולל שאריות נוזלים וחוטים) של הנוזל הנותר ושל מדיום f/2⁺ נוסף.
6. קח שמונה לוחות f/2⁺ בקט-אגר (קוטר 10 ס"מ) המכילים 120 מיקרוגרם /מ"ל קנאמיצין. פיפטה 10 מיקרוגרם של דנ"א באמצע כל צלחת אגר. מיד פיפטה 100 μL של תרחיף התא לאמצע כל צלחת אגר (על גבי הדנ"א).
7. שמור את צלחת האגר ללא מכסה על הספסל הנקי כדי לאפשר לנוזל העודף להתאדות. סגרו את הצלחת וטפחו אותה באור לבן בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך יומיים.
8. פזרו את החוטים של כל צלחת אגר עם לולאת חיסון על מספר צלחות בקט-אגר טריות המכילות 120 מיקרוגרם/מ"ל קנאמיצין. טפחו את הצלחות באור לבן בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס ובדקו את התרביות באופן קבוע תחת מיקרוסקופ.
9. זהה חוטים חיים שעברו טרנספורמציה לאחר 7-28 ימים מתחת למיקרוסקופ. חפשו חוטים ירוקים ובריאים (איור 2) השונים מחוטים אחרים. אם ניתן לזהות את החוטים הירוקים האלה, המשך עם השלב הבא; אחרת, שמור את הצלחת עוד 7 ימים.
10. השתמשו במלקחיים כדי להעביר את החוטים החיים המזוהים האלה ל-50 מ"ל של מדיום f/2⁺ נוזלי עם קנאמיצין של 250 מיקרוגרם/מ"ל. יש לטפח באור לבן בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס על שייקר (סיבוב אופקי, 50 סל"ד). צפו בצמיחה עד ארבעה שבועות.
11. מעבירים את החוטים בחזרה למדיום אגר המכיל 250 מיקרוגרם/מ"ל קנאמיצין ומחכים שהחוטים יגדלו. לאחר מספר ימים, העבירו חוטים בודדים לצלחת אגר טרייה עם ריכוז גבוה יותר של קנאמיצין, למשל, 500 מיקרוגרם/מ"ל. שמור על הצלחת המקורית.
12. ודא כי החוטים מופצים בריכוז גבוה של kanamycin בתרבית נוזלית או על אגר. הגדל שוב את ריכוז הקנאמיצין כדי להאיץ את ההפרדה.
    הערה: P. lacuna שעבר טרנספורמציה גדל עד 10,000 מיקרוגרם / מ"ל kanamycin. ייתכן שמינים אחרים לא יסבלו ריכוזים כה גבוהים.
13. אם תאים עמידים גדלים ומופצים באופן נרחב על פני צלחת, בדקו את השילוב של התוסף בגנום של P. lacuna על ידי ביצוע PCR עם פריימרים חיצוניים ופנימיים.
    1. השתמש בפריימרים שנועדו לשיבוט ההחדרה כפריימרים פנימיים.
    2. לתכנון הפריימרים החיצוניים, בחרו רצפים שהם 5' ו-3' מאתר ההחדרה המוצע על הגנום של P. lacuna אך מחוץ להחדרה.
    3. לתגובות PCR, השתמשו בפריימרים פנימיים ובפריימרים חיצוניים. השתמשו בזנים העמידים ובסוג הפראי.
       הערה: פריימרים פנימיים מציינים שהתוספת קיימת; פריימרים חיצוניים מראים שהתוספת מוכנסת במוקד הנכון.
14. עבור כל תגובת PCR, יש להניח כ-10 מ"ג מהחוטים ישירות בצינורות ה-PCR ולבצע PCR בהתאם לפרוטוקולים הסטנדרטיים²⁴. אם לא מתקבל מוצר, לשנות את טמפרטורת החישול ולשטוף את החוטים עם מים.
    הערה: ניתן להשתמש בפולימראזות רבות ושונות ב-PCR. לפולימראזות סטנדרטיות, כגון Taq polymerase, יש שיעור שגיאה גבוה יותר מאשר פולימראזות לבדיקת שגיאות, שהן יקרות יותר. PCR אנליטי זה אינו דורש פולימראז לבדיקת שגיאות. עם זאת, יש לבדוק פולימראז לבדיקת שגיאות אם לא מתקבל מוצר PCR עם פולימראז סטנדרטי.
15. לנתח את תוצרי ה- PCR של הקו העמיד על אלקטרופורזה אגרוזה²⁴.
    1. השווה את מיקומי הפסים עם סמן והשווה את הסוג הפראי ואת הטרנספורמציה. עם פריימרים פנימיים וחיצוניים , חפשו רצועה גדולה יותר עבור הטרנספורמט מאשר הסוג הפראי (עקב החדרת קלטת ההתנגדות) או שתי רצועות עבור הטרנספורמט: אחת בגודל של רצועה מסוג פרא ואחת גדולה יותר. כפי שהמקרה האחרון מצביע על הפרדה לא שלמה, המשך טיפוח עם ריכוזי קנאמיצין גבוהים.
       הערה: לפרטים נוספים על PCR ואלקטרופורזה, ראה ^15,24 או ספרות סטנדרטית אחרת.
16. לביטוי GFP: שימו לב לחוטים בודדים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (ראו טבלת החומרים) בהגדלה של המטרה שנקבעה על פי 40 או 63x. צלם תמונת שידור בשדה בהיר ותמונת פלואורסצנציה. השתמש בהגדרות הבאות עבור GFP: פס פס של 470 ננומטר לעירור, פס פס של 525 ננומטר לפליטה ומפצל קרן של 495 ננומטר, זמן חשיפה ראשוני של 500 אלפיות השנייה.
17. התאם את זמן החשיפה לאותות פלואורסצנטיים ברורים, תוך הימנעות מעוצמות רוויות. נסה להשתמש באותה הגדרה עבור כל הדוגמאות.
18. מכיוון שהחוטים מסוג פרא יציגו גם פלואורסצנציה, צלם תמונות עם אותן הגדרות כמו לעיל עבור פלואורסצנציה ברקע זה.
    הערה: המתח המבטא GFP חייב להיות בעל אות גבוה יותר; אחרת, הוא אינו מבטא GFP.
19. בהתבסס על זמני החשיפה ועל עוצמות הפיקסלים של תמונות הפלואורסצנציה, חישבו והשוו את תוכן ה-GFP של החוטים השונים.

4. שימור קריו-קונסרבציה

הערה: P. lacuna והציאנובקטריום החד-תאי Synechocystis sp. PCC 6803 משמשים. השיטה הנוכחית עובדת טוב יותר עבור P. lacuna.

1. טפח P. lacuna או Synechocystissp PCC 6803 במשך 10 ימים לפחות ב-10 מ"ל של f/2⁺ או BG-11 בינוני, בהתאמה, תחת אור לבן (50 μmol ^{m-2 s-1}) ב-25 °C תחת תסיסה (סיבובים אופקיים, 50 סל"ד).
2. הומוגניזציה של תרבית P. lacuna (ראו טבלת החומרים) ב-10,000 סל"ד למשך 3 דקות או עם מכשיר אולטרסאונד (ראו טבלת החומרים) למשך 2 דקות באנרגיה מלאה. קבע OD 750 ננומטר של כל אחת מהתרביות כדי לבדוק אם הערך הוא בין 1 ל- 7.
3. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 6,000 × גרם במשך 15 דקות. הסר את ה-supernatant.
4. השעו את גלולת התא ב-800 μL של מדיום f/2⁺ או BG-11 (נפח סופי) והעבירו לקריוביטל של 2 מ"ל. הוסף 800 μL של תמיסת 50% גליצרול לתרחיף התא. סגור את הבקבוקון וערבב על ידי היפוך חוזר ונשנה.
5. מעבירים את הקריוביה לחנקן נוזלי ומאחסנים אותו בקופסת קריובוקס במקפיא של -80 מעלות צלזיוס. שימו לב למיקום הקופסה בתוך המקפיא ולקואורדינטות של הדגימה בתוך הקופסה.
6. להתאוששות התאים, מוציאים את הקריוביה ומפשירים את התוכן בטמפרטורת החדר. העבר את התוכן לצינור תגובה של 2 מ"ל.
7. שטפו את הדגימה פעמיים. עבור שטיפה 1^st , צנטריפוגה ב 6,000 × גרם במשך 5 דקות. הסר את הסופרנטנט, והחזיר את הכדור ב-2 מ"ל של f/2⁺ או BG-11 בינוני. עבור שטיפה^{2 nd} , recentrifuge ב 6,000 × גרם במשך 5 דקות, להסיר את supernatant, ולהשאיל את הכדור ב 2 מ"ל של f/2⁺ או BG-11 בינוני.
8. כדי לבדוק את שלמותם של תאים אלה המוכנים לטיפוח, העבירו את הכדור ל-9 מ"ל של מדיום וטיפחו אותם באור לבן (50 מיקרומול ^{m-2 s-1}) תחת תסיסה (55 סל"ד). השווה את OD 750 ננומטר של התרבות ביום הראשון ואחרי שבוע אחד.

5. תנועתיות של פורמידיום לקונה

הערה: יתוארו שלושה מבחנים שונים. אותה תרבות משמשת בכל המקרים.

1. יש לטפח את P. lacuna במדיום f/2 תחת תסיסה אופקית (50 סל"ד) באור לבן (50 μmol m-2 ^s-1) במשך ^{כ-5 ימים עד שה-OD} המשוער של 750 ננומטר הוא 0.35. אחסנו את הדגימה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
2. הומוגניזציה של החוטים (ראו טבלת החומרים) ב-10,000 סל"ד למשך 3 דקות או באמצעות אולטרסאונד (ראו טבלת החומרים) למשך דקה אחת בעוצמה ובמחזור מרביים של 1. מדוד OD 750 ננומטר. אם מעל 0.35, דיללו את השבר עם תווך f/2. השתמש בפתרון זה במבחני תנועתיות בשלבים 5.3, 5.4 ו- 5.5.
3. בדיקה לתנועה במדיום נוזלי
   1. לתצפית ישירה על תנועתיות, העבירו 8 מ"ל של מדיום המכיל P. lacuna (משלב 5.2) לתוך צלחת פטרי 6 ס"מ. יש להמתין מספר דקות עד שהדגימה תגיע לטמפרטורת החדר. מכסים את צלחת הפטרי בנייר כסף צלופן.
   2. מקם שקופית מיקרוסקופ על שולחן x-y של מיקרוסקופ סטנדרטי עם מצלמה. הפעילו את אור המיקרוסקופ. באופן אידיאלי, השתמש תמיד באותן הגדרות חשמליות ואופטיות עבור התאורה. הזז מטרה של פי 4 או 10x לנתיב האור.
   3. הניחו את צלחת הפטרי על גבי המגלשה. התאם חוטים בודדים או צרורות נימה בתנועות x, y ו-z של הטבלה.
      הערה: בשל הסידור התלת-ממדי, רק חלק מהחלק הרלוונטי יכול להיות בפוקוס. רדיד הצלופן מאפשר להתאים את המיקוד ללא הגבלה.
   4. שימו לב לתנועות של חוטים בודדים או צרורות. ודא שהעדשה האובייקטיבית אינה נוגעת בנוזל. תעדו את תנועות החוטים באמצעות מצלמת מיקרוסקופ סטנדרטית (ראו סרטון משלים S1).
4. בדיקה לתנועה על פני השטח
   1. לתצפית על תנועתיות נימה על משטחי אגר, הכינו צלחות פטרי 6 ס"מ עם f/2 bacto-agar. ודא שהאגר גבוה מספיק כדי שהעדשה האובייקטיבית תתקרב למשטח האגר. לחלופין, הכינו שכבת אגר בעובי של כ-3 מ"מ ותעדו את החוטים דרך האגר (שמרו על הצלחת הפוכה או השתמשו במיקרוסקופ הפוך).
   2. פיפטה 0.5 מ"ל של תמיסה המכילה P. lacuna (משלב 5.2) על משטח הבקטו-אגר של צלחת פטרי 6 ס"מ. אפשרו לנוזל להיכנס לפני השטח. סגור את צלחת הפטרי והתבונן בתנועת החוטים על פני השטח באמצעות מטרה של 4x או 10x.
   3. ודא שאותן הגדרות חשמליות ואופטיות של המיקרוסקופ משמשות לאורך כל ההקלטה ובהקלטות הבאות.
   4. צלם הקלטות של קיטועי זמן באמצעות מצלמת עיניים ומערכת מיני-מחשב. ודא שמרווח הזמן בין התמונות הבאות הוא 5 s-1 דקות. תכנת את סקריפט הלינוקס של המיני-מחשב כדי לשלוט בהקלטת קיטועי הזמן. ראה קובץ משלים 2 לדוגמה סקריפט ווידאו משלים S2 כדוגמה.
5. בדיקה לפוטוטקסיס
   1. לניסויים בפוטוטקסיס, הכינו מחזיקי דיודה פולטת אור (LED) (כאן, עם מדפסת תלת-ממד) שבה נוריות ה-LED הנבחרות בקוטר 5 מ"מ מותקנות כדי להקרין שטח של 20 מ"מ² מלמטה למעלה (איור 3). במידת הצורך, השתמש במחזיקי LED רבים במקביל, תוך חיבור כל נורית LED חשמלית דרך נגד ופוטנציומטר לאספקת חשמל מתכווננת. מדדו והתאימו את עוצמות ה-LED, בהתאם לניסוי. ודאו שהתפאורה כולה נמצאת בחדר חשוך או במיכל חשוך סגור.
   2. מניחים 8 מ"ל של המדיום המכיל P. lacuna (משלב 5.2) לתוך צלחת פטרי 6 ס"מ. התאם את עוצמת האור של נורית ה- LED. סגרו את צלחת הפטרי עם המכסה והניחו אותה על מחזיק LED כך שהנורית תהיה במרכז צלחת הפטרי.
   3. לאחר משך הזמן הרצוי (בדרך כלל יומיים), צלם תמונה של צלחת פטרי עם מצלמת סמארטפון המכוונת ישירות למיקום הטיפול באור. השתמש בלוח LED לבן להקרנה של הדגימה. השתמש בהגדרות הידניות של המצלמה; להימנע מהשתקפויות של אור; התאימו תמיד כדי לקבל את אותו המרחק בין עדשת המצלמה לדגימה. ודא שהגדרות החשיפה מספקות תמונה המתאימה לניתוחים מאוחרים יותר באמצעות ImageJ.
   4. לכמת את הקוטר של המעגל המרכזי של חוטים באמצעות תוכנת ImageJ.
      1. פתח את ImageJ, לחץ על קובץ | פתח, בחר את הקובץ הרצוי ולחץ על Enter.
      2. בחר בלחצן ישר (עם קו ישר). לחץ על לחצן העכבר השמאלי כדי לצייר קו מקצה אחד של צלחת פטרי לקצה הנגדי. ודא שהקו עובר דרך מרכז מעגל החוטים.
      3. הקש Ctrl-K בלוח המקשים או לחץ על נתח | פרופיל העלילה בתפריט ImageJ. חפשו חלון x-y עם עוצמות פיקסלים משורטטות לעומת מרחק - פרופיל חד-ממדי של צלחת פטרי. ודא שעוצמת הפיקסלים הנמוכה ביותר היא מעט מעל 0 והערך הגבוה ביותר נמוך מ- 255.
      4. הערך ממוצע עבור עוצמת הפיקסלים מחוץ למעגל וערך ממוצע נוסף עבור עוצמת הפיקסלים במעגל. במיקום y- בין ערכים אלה, הערך את ערכי x של שני צידי המעגל על ידי הצבעה עם העכבר על מיקומים אלה. שים לב לשני הערכים וחשב את ההפרש.
      5. השג את ערך ה- x הגבוה ביותר על-ידי הפניית העכבר לציר y בצד ימין. שים לב שערך זה e מייצג את הקוטר של צלחת פטרי. אם קוטר זה הוא 5 ס"מ, חשב את קוטר מעגל החוטים המרכזי כ - d/e × 5 ס"מ.

תוצאות

בעקבות השיטות הנ"ל, 5 זנים שונים של P. lacuna בודדו מבורות סלעים ורוצפו (איור 1 וטבלה 1). כל התרבויות היו סטריליות לאחר ~ שנה אחת של תת-תרבות למעט P. lacuna HE10JO. זן זה עדיין מזוהם ב-Marivirga atlantica, חיידק ימי. במהלך טיולי הלגולנד הבאים, ציאנובקטריה נימה אחרים בודדו מברי...

Discussion

למרות שזנים רבים של ציאנובקטריה זמינים מאוספי תרביות 32,33,34,35,36, עדיין יש ביקוש לציאנובקטריה חדשה מהטבע מכיוון שמינים אלה מותאמים לתכונות ספציפיות. P. lacuna נאסף מבורות סלעים והוא מותאם לווריאציות ש...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Autoclave 3870 ELV	Tuttnauer	3870 ELV
Bacto Agar	OttoNorwald	214010
BG-11 Freshwater Solution	Sigma Aldrich	C3061
BG-11 medium	Merck	73816-250ML
Boric acid	Merck	10043-35-3	H3BO3
Calcium chloride dihydrate	Carl Roth	10035-04-8	CaCl2 · 2 H2O
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 250 mL	Greiner	658190
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 50 mL	Greiner	601975
Centrifuge LYNX 4000	Thermo Scientific	75006580	and rotor
Centrifuge microstar 17	VWR International	N/A	for up to 13,000 rpm
Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB)	PanReac AppliChem	57-09-0	C19H42BrN
Chloroform : Isoamyl Alcohol 24 : 1	PanReac AppliChem	A1935
Cobalt(II) chloride hexahydrate	Merck	7791-13-1	CoCl2 · 6 H2O
Copper(II) sulphate pentahydrate	Merck	7758-99-8	CuSO4 · 5 H2O
D(+)-Biotin	Carl Roth	58-85-5	C10H16N2O3S
DNA ladder 1 kb	New England Biolabs	N3232
DNA ladder 100 bp	New England Biolabs	N3231
Electrical pipetting help accujet-pro S	Brand GmbH	26360	for pipetting 1-25 mL
Ethanol	VWR	64-17-5	C2H6O
Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate	Carl Roth	6381-92-6	EDTA-Na2 · 2 H2O
Fluorescence microscope ApoTome	Zeiss
Fluorescence microscope Axio Imager 2	Zeiss
French Pressure Cell Press	American Instrument Company	N/A
Gel documation System Saffe Image	Invitrogen
Gelelctrophoresis system Mupid-One/-exu	ADVANCED
Glassware, different
Glycerol	Carl Roth	56-81-5	C3H8O3
Iron(III) chloride hexahydrate	Merck	10025-77-1	FeCl3 · 6 H2O
Kanamycin	Sigma-Aldrich	25389-94-0
Kanamycin sulphate	Carl Roth	25389-94-0	C18H36N4O11 · H2SO4
Lauroylsarcosine, Sodium Salt (Sarcosyl)	Sigma Aldrich	137-16-6	C15H28NO3 · Na
LB Broth (Lennox)	Carl Roth	X964.4
Light source, fluorescent tube L18W/954 daylight	OSRAM		cultivation of cyanobacteria
Light source, LED panel XL 6500K 140 W	Bloom Star	N/A	cultivation of cyanobacteria, up to 1,000 µmol m-2 s-1
Magnesium chloride hexahydrate	Carl Roth	7791-18-6	MgCl2 · 6 H2O
Manganese(II) chloride tetrahydrate	Serva	13446-34-9	MnCl2 · 4 H2O
Microscope DM750	Zeiss
Midi prep plasmid extraction kit NucleoBond Xtra Midi kit	Macherey-NAGEL GmbH & Co. KG	REF740410.50
Minicomputer Raspberry Pi 4 +	Conrad Electronics	2138863-YD	for time-lapse recording
Ocular camera EC3	Leica		for continuous recording up to 30 s
Ocular camera MikrOkular Full HD	Bresser		for time-lapse recordings, coupled to Raspberry Pi minicomputer
Petri dishes polystyrole, 100 mm x 20 mm	Merck	P5606-400EA
Petri dishes polystyrole, 60 mm x 15 mm	Merck	P5481-500EA
Photometer Nanodrop ND-1000	Peqlab Biotechnologie
Photometer Uvikon XS	Goebel Instrumentelle Analytik GmbH
Pipetman 100-1,000 µL	Gilson	SKU: FA10006M
Pipetman 10-100 µL	Gilson	SKU: FA10004M
Plastic pipettes 10 mL, sterile	Greiner	607107
Plastic tube, sterile, 15 mL	Greiner	188271
Plastic tube, sterile, 50 mL	Greiner	227261
Potassium bromide	Carl Roth	7758-02-3	KBr
Potassium chloride	Carl Roth	7447-40-7	KCl
Power supply Statron 3252-1	Statron Gerätetechnik GmbH
Power supply Voltcraft PPS 16005	Conrad Electronics		for LED
Proteinase K	Promega	MC500C	from Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470
Q5 polymerase	New England Biolabs	M0491S
Sequencing kit NextSeq 500/550 v2.5	Illumina
Sequencing system NextSeq 550 SY-415-1002	Illumina
Shaker Unimax 2010	Heidolph Instruments		for cultivation
Sodium acetate	Carl Roth	127-09-3	NaCH3COO
Sodium chloride	Carl Roth	7647-14-5	NaCl
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate	Carl Roth	10049-21-5	NaH2PO4 · H2O
Sodium fluoride	Carl Roth	7681-49-4	NaF
Sodium hydrogen carbonate	Carl Roth	144-55-8	NaHCO3
Sodium molybdate dihydrate	Serva	10102-40-6	Na2MoO4 · 2 H2O
Sodium nitrate	Merck	7631-99-4	NaNO3
Sodium sulphate	Carl Roth	7757-82-6	Na2SO4
Strontium chloride hexahydrate	Carl Roth	10025-70-4	SrCl2 · 6 H2O
Thiamine hydrochloride	Merck	67-03-8	C12H17ClN4OS · HCl
TRIS	Carl Roth	77-86-1	C4H11NO3
Ultrasonic device UP100H with sonotrode MS3	Hielscher Ultrasound Technology	UP100H
Ultraturrax Silent Crusher M	Heidolph Instruments		homogenizer
Urea	Carl Roth	57-13-6	CH4N2O
Vitamin B12	Sigma	68-19-9	C63H88CoN14O14P
Vitamin solution			0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin
Water Stills, Water treatment	VEOLIA water technologies	ELGA_21001
Zinc sulphate heptahydrate	Sigma	7446-20-0	ZnSO4 · 7 H2O
software, URL
gatb-minia program for DNA assembly	https://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline	makes large scaffolds from short DNA reads, Linux based
ImageJ		software for immage processing (pixel intensities, circle diameter)
RAST annotation server	https://rast.nmpdr.org	input: genome DNA sequence, detects open reading frames, lists protein sequences and their functions
Culture media
Artificial seawater	0.41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM  KCl , 2.4 mM NaHCO3 ,0.84 mM KBr, 0.49 mM H3BO3, 90 µM SrCl2, 72 µM NaF
f/2 -liquid medium	artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution, 0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
f/2+ liquid medium	f/2-medium, with 10 times increased NaNO3 and NaH2PO4 (0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
f/2+-agar	3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,8.8 mM NaNO3, 0.36 mM NaH2PO4
f/2-agar	3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
Trace element solution	0.36 mM NaH2PO4, 12 µM Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0.91 µM MnCl2
Vitamin solution	0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin