Cuantificación de las interacciones de unión entre cu(II) y residuos peptídicos en presencia y ausencia de cromóforos

Resumen

Este artículo se centra en el uso de la espectroscopia de absorción electrónica y la calorimetría de titulación isotérmica para sondear y cuantificar la termodinámica de la unión de Cu(II) a péptidos y proteínas.

Resumen

El cobre (II) es un metal esencial en los sistemas biológicos, que confiere propiedades químicas únicas a las biomoléculas con las que interactúa. Se ha informado que se une directamente a una variedad de péptidos y desempeña funciones necesarias y patológicas que van desde la estructura mediadora hasta las propiedades de transferencia de electrones y la impartición de funciones catalíticas. La cuantificación de la afinidad de unión y la termodinámica de estos complejos de péptidos Cu(II) in vitro proporciona información sobre la fuerza impulsora termodinámica de unión, las competencias potenciales entre diferentes iones metálicos para el péptido o entre diferentes péptidos para Cu(II), y la prevalencia del complejo Cu(II)-péptido in vivo. Sin embargo, cuantificar la termodinámica de unión puede ser un desafío debido a una miríada de factores, incluida la contabilidad de todos los equilibrios competitivos dentro de un experimento de titulación, especialmente en los casos en que hay una falta de mangos espectroscópicos discretos que representen el péptido, el ion metálico del bloque d y sus interacciones.

Aquí, se proporciona un conjunto robusto de experimentos para la cuantificación precisa de la termodinámica del péptido Cu(II). Este artículo se centra en el uso de la espectroscopia de absorción electrónica en presencia y ausencia de ligandos cromofóricos para proporcionar el mango espectroscópico necesario en Cu(II) y el uso de calorimetría de titulación isotérmica sin etiquetas. En ambas técnicas experimentales, se describe un proceso para dar cuenta de todos los equilibrios en competencia. Si bien el enfoque de este artículo se centra en Cu (II), el conjunto descrito de experimentos puede aplicarse más allá de las interacciones Cu (II) -péptido, y proporcionar un marco para la cuantificación precisa de otros sistemas metal-péptido en condiciones fisiológicamente relevantes.

Introducción

La biología ha evolucionado para utilizar la diversa química de los iones metálicos necesarios para que la vida se adapte y sobreviva en su entorno circundante. Se estima que entre el 25% y el 50% de las proteínas utilizan iones metálicos para la estructura y la función¹. El papel particular y el estado redox del ion metálico está directamente relacionado con la composición y la geometría de los ligandos biológicos que lo coordinan. Además, los iones metálicos redox-activos como Cu(II) deben estar estrechamente regulados para que no interactúen con agentes oxidantes a través de la química similar a Fenton para formar especies reactivas de oxígeno (ROS)^2,3,4. Comprender los modos de unión y la afinidad que impulsan su bioquímica debería ayudar a dilucidar el papel biológico del ion metálico.

Muchas técnicas se utilizan para estudiar las interacciones de unión de metales y péptidos. Estas son en su mayoría técnicas espectroscópicas, pero también incluyen simulaciones por computadora utilizando dinámica molecular, como se ve a través de las interacciones Cu(II) con un fragmento de beta amiloide (Aβ)⁵. Una técnica espectroscópica ampliamente utilizada que es accesible para muchas universidades es la resonancia magnética nuclear (RMN). Utilizando la naturaleza paramagnética de Cu(II), Gaggelli et al. pudieron mostrar dónde se une el ion metálico en un pecíolo a través de la relajación de los núcleos cercanos⁶. La resonancia paramagnética electrónica (EPR) también se puede utilizar para sondear la ubicación y el modo de la unión de iones metálicos paramagnéticos⁷. Otras técnicas espectroscópicas como el dicroísmo circular (CD) pueden describir la coordinación sobre Cu(II) en sistemas como los sistemas tripéptidos⁸, y la espectrometría de masas puede mostrar estequiometría y a qué residuos se coordina el ion metálico a través de patrones de fragmentación ^9,10.

Algunas de estas técnicas, como la RMN, no contienen etiquetas, pero requieren grandes concentraciones de péptidos, lo que plantea desafíos para el estudio. Otra técnica común llamada espectroscopia de fluorescencia se ha utilizado para relacionar la posición de una tirosina o triptófano con el enfriamiento de un Cu(II)^11,12. Del mismo modo, esta técnica puede mostrar cambios estructurales como resultado de la unión Cu(II)¹³. Sin embargo, los desafíos con estos estudios de unión metal-péptido son que sondean aminoácidos cromofóricos como la tirosina que no todos los sistemas tienen, que el ion metálico se une bajo un modelo clásico y que la técnica puede no ser propicia en condiciones fisiológicas. De hecho, están surgiendo varios péptidos que no contienen tales aminoácidos cromofóricos ni se unen bajo modelos clásicos, lo que impide el uso de estas técnicas^14,15. Este artículo detalla los enfoques para evaluar las propiedades de unión en estos escenarios en condiciones fisiológicamente relevantes.

Los ligandos biológicos pueden adoptar diferentes estados de protonación que pueden afectar la unión de iones metálicos, como el anillo de imidazol en la histidina. Si el pH no se mantiene de manera consistente, los resultados pueden ser enrevesados o contradictorios. Por esta razón, los tampones son un componente esencial en el estudio de las interacciones metal-proteína/péptido. Sin embargo, se ha demostrado que muchos tampones interactúan favorablemente con los iones metálicos^16,17. Además de competir con la molécula biológica de interés, el tampón puede tener átomos de coordinación similares que pueden ser difíciles de distinguir de los átomos coordinadores del péptido o proteína. En este estudio, la atención se centra en la espectroscopia de absorción electrónica y la calorimetría de titulación isotérmica (ITC) como dos técnicas complementarias para estudiar las interacciones Cu(II)-péptido, con consideraciones especiales sobre la elección del tampón.

La espectroscopia de absorción electrónica es una técnica rápida y ampliamente accesible para estudiar las interacciones de unión a metales. La irradiación con luz en las longitudes de onda ultravioleta (UV) o visible puede conducir a la absorción de bandas d-d centradas en el metal, que proporcionan información valiosa sobre la clasificación de ligandos, las geometrías de los metales y las afinidades de unión^{aparentes 18,19}. Para estos complejos, las valoraciones directas de iones metálicos en soluciones proteicas o peptídicas pueden cuantificar las estequiometrías de unión y las afinidades de unión aparentes. En algunos casos, como las configuraciones de electrones d⁵ o d¹⁰, el complejo no absorbe la luz (es decir, es espectroscópicamente silencioso). En estos complejos de metales de transición espectroscópicamente silenciosos, estas limitaciones se pueden eludir mediante el uso de un ligando competidor que, al coordinarse con el ion metálico, produce bandas de transferencia de carga detectables. En cualquier caso, este enfoque se limita a cuantificar solo la estequiometría y la afinidad de unión aparente, y no se proporciona información sobre la entalpía de unión sin aproximaciones.

Complementando la información obtenida de la espectroscopia electrónica de absorción, el ITC es una técnica atractiva para la cuantificación directa y rigurosa de la entalpía de unión²⁰. ItC mide directamente el calor liberado o consumido durante un evento de unión y, dado que la titulación tiene lugar a presión constante, el calor medido es la entalpía de todos los equilibrios (ΔH_ITC). Además, se cuantifican la estequiometría del evento de unión (n) y la afinidad de unión aparente (K_ITC). A partir de estos parámetros, se determinan la energía libre (ΔG_ITC) y la entropía (ΔS_ITC), proporcionando una instantánea termodinámica del evento de unión. Como no depende de la absorción de luz, itC es una técnica ideal para especies espectroscópicamente silenciosas, por ejemplo, complejos de iones metálicos d⁵ o d¹⁰ . Sin embargo, dado que la calorimetría mide el calor, cualquier sistema tampón sin igual y equilibrios no contabilizados puede afectar negativamente el análisis para determinar con precisión la termodinámica de unión a iones metálicos, y se debe tener mucho cuidado para abordar estos factores²⁰. Si se realiza con el rigor adecuado, el ITC es una técnica robusta para determinar la termodinámica de los complejos metal-proteína/péptido.

Aquí, se utiliza un péptido de unión al cobre cromofóricamente silencioso, el péptido C, para demostrar el uso complementario de las dos técnicas. El péptido C es un producto de escisión de 31 residuos (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ) formado durante la maduración de la insulina; carece de residuos cromofóricos, pero se ha demostrado que se une a Cu(II) con afinidad fisiológicamente relevante^14,15. El sitio de unión de Cu(II) consiste en las cadenas laterales de un glutamato y un aspartato, así como el N-terminal del péptido^14,15. Estos átomos de coordinación se parecen mucho a los de muchos sistemas amortiguados de uso común. Aquí, se muestra el uso en tándem de las bandas d-d y de transferencia de carga en la espectroscopia de absorción electrónica y el ITC en la cuantificación de la termodinámica de unión de Cu(II) al péptido C. El enfoque del estudio de la unión de Cu(II) al péptido C se puede aplicar a otros iones metálicos y sistemas de proteínas/péptidos.

Protocolo

1. Espectroscopia de absorción electrónica: titulación directa con competencia tampón

1. Preparación de muestras
   1. Preparar una solución tamponada de 50 mM 2-[bis(2-hidroxietil)amino]-2-(hidroximetil)propano-1,3-diol (bisTris) a pH 7,4 utilizando agua ultrapura (resistencia >18 MΩ). Elimine los iones de metales traza incubando con una resina de alta afinidad durante al menos 2 h con la filtración posterior.
   2. Disolver o diluir una cantidad conocida del péptido en el tampón libre de metales.
      NOTA: Al monitorear bandas d-d con pequeños coeficientes de extinción²¹, se deben usar concentraciones más altas de péptido. Aquí, la concentración final de péptido C en solución tamponada fue de 300 μM (el volumen depende del tamaño de la cubeta). El péptido C fue sintetizado por síntesis de péptidos en fase sólida y se detalla en otra parte de la literatura¹⁴.
   3. Disuelva una masa conocida de CuCl₂ en agua ultrapura para hacer una solución a 10-15 mM.
      NOTA: Es importante disolver inicialmente la sal metálica en agua no búfer para evitar precipitaciones. Se pueden usar otras sales de Cu(II), pero se debe tener cuidado para garantizar que el anión se coordine débilmente.
2. Ejecución del experimento
   1. Encienda el espectrofotómetro de absorción electrónica y deje que se caliente durante ~ 15-20 minutos antes de usarlo. Inicie el software del espectrofotómetro y configure los parámetros como el rango de escaneo (200-900 nm), la velocidad de escaneo (200 nm / s) y la línea de base de doble haz corregida (se enumeran más parámetros en el Archivo suplementario).
   2. Recolecte una línea de base sin cubetas o muestras en las trayectorias del haz.
   3. Usando dos cubetas emparejadas en el espectrofotómetro de doble haz, cargue una cubeta con 115 μL de agua ultrapura y la otra cubeta con 115 μL de la muestra peptídica. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en las cubetas, ya que interferirán con la señal.
   4. Coloque la cubeta con agua ultrapura en el haz de referencia y la cubeta con péptido en el haz de muestra.
   5. Recoger el espectro de absorción del péptido libre de metales (apo).
   6. Añadir una cantidad subaquiométrica (0,5 equivalentes, 150 μM) de la solución de Cu(II) en la cubeta con la muestra peptídica. Asegúrese de que el volumen de Cu(II) añadido sea inferior a 3 μL y registre el volumen para su análisis posterior.
   7. Pipete suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar la solución mientras evita la generación de burbujas de aire. Deje que la solución reaccione y se equilibre durante 5 minutos y registre el espectro de absorción.
   8. Repita la adición de alícuotas de Cu(II) como en el paso 1.2.6 en la solución peptídica para los siguientes equivalentes: 1.0, 1.5, 2.0, 3.0 y 5.0 (o un total de 300, 450, 600, 900 y 1,500 μM). Asegúrese de registrar el volumen total de Cu(II) agregado y el volumen total de la cubeta.
      NOTA: Si se desea más resolución, reduzca el espaciado entre equivalentes.
   9. Retire la cubeta de muestra y límpiela a fondo según las instrucciones del fabricante.
   10. Agregue la solución tamponada sin péptido y registre el espectro de absorción. Repita la adición de alícuotas de Cu(II) como en los pasos 1.2.5-1.2.8, registrando el espectro de absorción para cada equivalente de Cu(II).
   11. Exporte todos los espectros como archivos csv para su procesamiento. Limpie a fondo las cubetas de acuerdo con las instrucciones del fabricante y apague el espectrofotómetro.
3. Tratamiento de los datos
   1. Cargue todos los espectros en un programa de hoja de cálculo.
   2. Reste el espectro de solo búfer (0 μM Cu(II)) de cualquier otro espectro para eliminar cualquier característica de absorbancia del propio búfer.
   3. Normalizar cada espectro para tener en cuenta la dilución resultante de la adición de la solución de Cu(II) (paso 1.2.6). Consulte el Archivo Suplementario, Eq (1)¹⁴ para un ejemplo de la normalización donde v_inicial es el volumen (115 μL) de péptido agregado a la cubeta, v_Cu(II) es el volumen de solución de Cu(II) agregado en el paso 1.2.6, y abs_{buffer restó espectro} son los datos obtenidos en el paso 1.2.7.
   4. Grafique todos los espectros juntos para identificar regiones de cambio.
      NOTA: Las bandas d-d típicas de los complejos Cu(II) varían de 500 a 750 nm. Esta titulación espectrofotométrica puede ser un desafío debido al pequeño coeficiente de extinción de las bandas d-d, que son transiciones prohibidas por Laporte en geometría octaédrica²¹. Si la absorbancia es demasiado débil, un enfoque alternativo es utilizar ligandos cromofóricos que den lugar a bandas de transferencia de carga al unirse a Cu(II) (ver sección 2).

2. Espectroscopia de absorción electrónica: competencia peptídica con ligando cromofórico

1. Preparación de muestras
   1. Disolver 1,10-fenantrolina (fen) en agua ultrapura para obtener una concentración final de ~1 mM.
   2. Además de la preparación de la muestra descrita en la sección 1.1 para el péptido (paso 1.1.2) y Cu(II) (paso 1.1.3), preparar una solución de 10 μM Cu(II) y 40 μM de fen en tampón ([Cu(phen)₃]²⁺). Asegúrese de que el volumen llene la cubeta.
2. Ejecución del experimento
   1. Inicie el espectrofotómetro de absorción electrónica como en los pasos 1.2.1 y 1.2.2, pero establezca el rango de escaneo en 200-400 nm.
   2. En dos cubetas combinadas, cargue una cubeta con 115 μL de agua ultrapura y la otra cubeta con 115 μL de la solución [Cu(phen)₃]²⁺ . Coloque la cubeta con agua en el haz de referencia y la cubeta con la solución [Cu(phen)₃]²⁺ en el haz de muestra.
   3. Recoger el espectro de absorción del complejo metal-ligando.
   4. Añadir una cantidad estequiométrica (equivalentes ≈1, ≈10 μM) de péptido a la solución [Cu(phen)₃]²⁺ . Pipete suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar bien, pero tenga cuidado de no introducir burbujas de aire. Registre el volumen de péptido agregado para futuros análisis.
      NOTA: El uso de cubetas que contienen 115 μL, la adición de 3,83 μL de péptido de 300 μM produce una concentración final de péptido de 9,7 μM.
   5. Incubar la solución durante 5 min para alcanzar el equilibrio. Registre el espectro de absorción.
      NOTA: Si la afinidad de unión del metal-péptido y el metal-ligando son similares, la concentración de péptido agregado deberá ser en gran exceso. Asegúrese de tener en cuenta el volumen total de péptido agregado para la normalización.
   6. Repita la adición de alícuotas peptídicas en la solución [Cu(phen)₃]²⁺ para los siguientes equivalentes aproximados: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 22 y 26. Registre el volumen de péptido agregado para que se pueda determinar la concentración diluida.
   7. Retire la muestra y limpie bien la cubeta de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Recopile un espectro del búfer. Recoger un espectro de 50 μM de péptido en el tampón.
   8. Exporte todos los datos como archivos csv para procesar y limpie las cubetas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
3. Tratamiento de los datos
   1. Cargue los espectros en un programa de hoja de cálculo y reste el espectro de búfer de los otros espectros.
   2. Normalice los espectros siguiendo El archivo suplementario, Eq (2)¹⁴.
   3. Usando el coeficiente de extinción para [Cu(phen)₃]²⁺ a 265 nm (ε_max = 90,000 ^{M-1 cm-1})²², determine la concentración de [Cu(phen)₃]²⁺ con cada adición del péptido.
   4. Para cada adición del péptido, determine la concentración del complejo Cu(II)-péptido restando la concentración restante de [Cu(phen)₃]²⁺, según lo determinado en el paso 2.3.2, de la concentración inicial de [Cu(phen)₃]²⁺ (a 0 μM de péptido).
   5. Calcule la concentración de ligando fen libre mediante la ecuación en Supplemental File, Eq (3)¹⁴.
   6. Calcule la concentración de péptido libre utilizando Supplemental File, Eq (4)¹⁴, donde [peptide]_stock representa el péptido sin diluir titulado en la cubeta, V₁ representa el volumen de péptido stock agregado, V₂ es el volumen total de la cubeta, y [Cu²⁺-peptide] se determina en el paso 2.3.4.
   7. Calcule la afinidad de enlace experimental (K_ex) utilizando Eq (5) en el archivo complementario²³.
   8. Relacionar la constante de disociación del péptido Cu(II)con K_ex por Eq (6)²³ en Supplemental File, donde K_{d,Cu(II)-phen} = 1.0 × 10-9 (ver ²²). Determinar el promedio y la desviación estándar de todas las constantes de disociación determinadas.
      NOTA: Bajo una proporción de 4:1 de phen:Cu(II), [Cu(phen)₃]²⁺, [Cu(phen)₂]²⁺, y [Cu(phen)]²⁺ existen en la solución, y el péptido quelatará Cu(II) lejos de la especie ([Cu(phen)]²⁺) con la unión más débil²².

3. Calorimetría de titulación isotérmica

1. Preparación de muestras
   1. Preparar una solución tamponada de ácido 3-morfolinopropano-1-sulfónico (MOPS) de 15 mM a pH 7.4 utilizando agua ultrapura (resistencia >18 MΩ). Elimine los iones de metal traza incubando con una resina de alta afinidad durante al menos 2 h con la posterior filtración al vacío a través de una membrana de 0,45 μm en la tapa de la botella.
   2. Disuelva una masa conocida de CuCl₂ en agua ultrapura para preparar una solución de ≈50-100 mM. Diluya esta solución de Cu(II) en tampón para obtener una solución de 1,0 mL con concentración final de 1,4 mM Cu(II). Registre el volumen exacto de la solución cuCl₂ utilizada.
   3. Disolver o diluir la solución peptídica en tampón para hacer 450 μL de una solución peptídica de 154 μM. Asegúrese de que se agregue la misma proporción de agua ultrapura adicional del paso 3.1.2 a la solución peptídica, lo que reducirá el calor de dilución y aumentará la señal al ruido.
   4. Después de la preparación de las muestras, asegúrese de que las soluciones estén al mismo pH y, si es necesario, ajuste en consecuencia.
   5. Paso opcional: Desgasificar las soluciones para minimizar las microburbujas cargadas en el ITC.
2. Ejecución del experimento
   1. Encienda el ITC. Inicie el software ITC para ejecutar el instrumento. Espere la primera inicialización, que pedirá reubicar el buret; a continuación, siga las instrucciones que aparecen en pantalla.
   2. Retire la cubierta de la celda de referencia. Retire el agua de la celda de referencia y enjuague tres veces con 450 μL de agua ultrapura desgasificada.
   3. Extraiga lentamente agua ultrapura hasta la marca de 450 μL de una jeringa de carga, teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire en la jeringa. Inserte la jeringa de carga en la celda de referencia hasta que esté ≈1 mm desde la parte inferior e inyecte lentamente parte de la solución hasta que queden 150 μL en la jeringa de carga. Mueva el émbolo de la jeringa de carga rápidamente hacia arriba y hacia abajo ≈25 μL varias veces para desalojar cualquier burbuja en la superficie de la célula. Inyecte lentamente hasta que el émbolo alcance la marca de 100 μL en la jeringa de carga, dispensando así un total de 350 μL de agua ultrapura en la celda de referencia, y reemplace la cubierta de la celda de referencia.
   4. Retire cualquier solución residual de la célula de muestra y cargue con 450 μL de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) de 10 mM utilizando una jeringa de carga. Remoje durante 10 minutos para asegurarse de que se eliminen los iones de metales traza porque el EDTA unirá los metales traza.
   5. Retire la solución de EDTA (con iones metálicos traza unidos) y enjuague bien la jeringa de carga con grandes cantidades de agua ultrapura.
   6. Limpie el ITC de acuerdo con las instrucciones del fabricante, enjuagando la celda de muestra con agua ultrapura.
   7. Acondicionar la célula de la muestra enjuagando con 450 μL de tampón al menos tres veces.
   8. Quite el búfer que está condicionando la celda de muestra. Cargue la solución peptídica en la célula de muestra con la jeringa de carga (siga el paso 3.2.3).
   9. Enjuague la jeringa de valoración con 200 μL de solución tamponada. Para hacer esto, retire el émbolo y use una micropipeta para pipetear el tampón a través del orificio en la parte superior de la jeringa de titulación de vidrio, a través de la jeringa y fuera de la aguja de abajo.
   10. Inserte completamente el émbolo en la jeringa de valoración.
   11. Sumerja la punta de la aguja de la jeringa de valoración en la solución de metal y tire lentamente del émbolo hacia arriba, haciendo que la solución de metal llene la jeringa y resulte en un volumen de vacío en la parte superior de la parte de vidrio de la jeringa de titulación. Retire la mayor parte del volumen del vacío girando la jeringa de valoración paralela al piso, retire el émbolo e incline ligeramente la parte de vidrio hacia el piso. Dé a la jeringa de valoración un batido suave para que la solución se mueva hasta el extremo de la parte de vidrio de la jeringa de valoración y llene la mayor parte del volumen del vacío, pero asegúrese de que queden 2-3 μL de volumen vacío. Mientras mantiene la jeringa paralela al suelo, vuelva a insertar el émbolo.
   12. Sostenga la jeringa de valoración en posición vertical, vuelva a sumergir la punta de la aguja en la solución de metal y empuje el émbolo hacia abajo hasta que el aire deje de salir de la aguja. Cargue la jeringa de valoración tirando lentamente del émbolo hasta justo por encima de la marca de 50 μL mientras mantiene la punta de la aguja en la solución.
   13. Inserte cuidadosamente la parte de vidrio de la jeringa de valoración en el buret y atornille hasta que quede apretado con los dedos. Cuando salga una pequeña cantidad de solución de la jeringa de titulación debido a la compresión del émbolo, use un limpiaparabrisas delicado de servicio ligero para absorber cuidadosamente la solución sin tocar la punta de la aguja.
   14. Inserte el buret con jeringa de titulación en la célula de muestra y sujéntelo de forma segura.
   15. Configure los parámetros en el software ITC. A partir del control por instrumentos, establezca la velocidad de agitación (las tasas de agitación típicas oscilan entre 150 y 350 RPM) y la temperatura a la que se llevará a cabo el experimento (generalmente 25 ° C). Introduzca la jeringa y las concentraciones celulares en unidades milimolares en Detalles del experimento.
   16. En la sección Método de experimento , seleccione Valoración incremental. Haga clic en Configurar y especifique 20 inyecciones de 2,5 μL. Si se requiere más resolución para observar el evento de unión, aumente el número de inyecciones y disminuya el volumen por inyección. Introduzca el espacio de tiempo entre cada inyección para que sea lo suficientemente largo como para que la señal se equilibre y vuelva a la línea de base, generalmente 300 s.
   17. Haga clic en el botón Ejecutar para iniciar el experimento y especificar dónde se guardan los datos.
   18. Al finalizar el experimento, limpie la célula de muestra y la jeringa de titulación.
   19. Ejecute todos los experimentos al menos por triplicado para garantizar una recopilación de datos precisa.
   20. Ejecute un experimento de control en el que la solución metálica se titule en la solución tamponada (en ausencia de péptido) para garantizar que el calor de dilución del ion metálico sea pequeño y que no haya equilibrios no contabilizados. Si el calor de dilución es grande, considere un sistema tampón diferente, si es posible.
3. Tratamiento de los datos
   1. Inicie el software de análisis ITC y cargue el archivo de datos para su análisis.
   2. Desplácese hasta la pestaña Línea base e inspeccione el termograma. Tenga en cuenta cualquier calor exógeno evolucionado o absorbido por burbujas de aire u otros artefactos en el termograma. Busque picos que no se deban a la inyección de la solución de metal.
   3. Asegúrese de que la línea de base generada por el software de análisis siga la parte de los datos después de la inyección y el equilibrio. Si se desvía, utilice puntos dinámicos de línea base para ajustar la línea base. Asegúrese de que las Regiones de Integración incluyan el pico generado por la inyección del metal, pero ocluyan cualquier burbuja de aire o artefacto en el termograma que se encuentra en el paso 2. Reste la línea de base del termograma.
      NOTA: Este tipo de manipulación se recomienda solo después de que se recopilan varios termogramas, para que el experimentador sepa qué son datos reales y qué es un artefacto, ya que ajustar la línea de base y las regiones de integración puede afectar drásticamente los datos.
   4. Navegue hasta la ventana Modelado para comenzar a ajustar los datos donde el software de análisis mostrará los datos integrados y normalizados de concentración para cada inyección.
   5. Haga clic con el botón izquierdo en el dato de la primera inyección para eliminarlo del algoritmo de ajuste.
      NOTA: Esto es común ya que habrá una mezcla menor entre el valorante y la solución de células de muestra que conduce a la dispensación molar inexacta de la primera inyección.
   6. En la sección Modelos , seleccione Blanco (constante) en el menú desplegable Estilo , que se basa en la entalpía de inyección final y se restará de cada punto de datos, teniendo en cuenta el calor de dilución. Además, seleccione Independiente (o el mejor modelo para el sistema) en el segundo menú desplegable Estilo para ajustarse a los datos.
      NOTA: Para las interacciones de enlace 1:1 estándar, el modelo más común es Independiente.
   7. Ajuste los datos utilizando los dos modelos presionando el botón de reproducción verde con una Σ.
      NOTA: Otro software para procesar datos ITC es SEDPHAT²⁴.
   8. Tenga en cuenta todos los equilibrios competitivos en el análisis post hoc previamente reportado por Grossoehme et al. ²⁰.

Resultados

El objetivo fue cuantificar y corroborar la termodinámica de la unión de Cu(II) al péptido C utilizando las técnicas complementarias de espectroscopia de absorción electrónica e ITC. Debido a la naturaleza robusta de la espectroscopia de absorción electrónica, se realizó una titulación directa de Cu(II) en péptido C de 300 μM (Figura 1). La adición de 150 μM de Cu(II) causó un aumento inmediato en la banda a 600 nm, atribuido a la banda d-d de Cu(II), y continuó aumentando ha...

Discusión

Este artículo proporciona un método robusto para cuantificar la afinidad y la termodinámica de la unión de Cu(II) a los péptidos. Los complejos con Cu(II) son ideales para monitorear la banda de absorción d-d en el sitio del metal debido a su configuración de electrones d⁹ . Aunque el coeficiente de extinción es pequeño, por lo que requiere mayores concentraciones del complejo para producir una señal confiable, las valoraciones de Cu (II) en péptido pueden proporcionar rápidamente información sobr...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,10-phenanthroline	Sigma Aldrich	131377-25G
bis-Tris buffer	Fisher	BP301-100
Bottle-top 0.45 micron membrane	Nalgene	296-4545	Any filtration system that removes the resin without introducing contaminants is acceptable
Copper(II) chloride	Alfa Aesar	12458
EDTA	Sigma Aldrich	EDS-500G
Electronic absorption spectrophotometer	Varian	Cary 5000	Another suitable sensitive spectrophotometer is acceptable
high affinity resin	Sigma Aldrich	C7901-25G
Isothermal titration calorimeter (ITC)	TA Instruments	Nano ITC Low Volume
ITC analysis software	TA Instruments	NanoAnalyze	SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137–148) may also be used
ITC software	TA Instruments	ITCRun
light-duty delicate wiper	Kimwipe	34155
loading syringe	Hamilton	Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL
matched cuvettes	Starna Cells, Inc	16.100-Q-10/Z20	Ensure that the window for the small volume cuvette matches the beam height of the spectrophotometer
MOPS buffer	Alfa Aesar	A12914
spectrophotometer software	Cary	WinUV Scan
spreadsheet program	Microsoft	Excel	Any suitable spreadsheet program will work
titration syringe	TA Instruments	5346
ultrapure water	Millipore Sigma	Milli-Q	Any water is okay as long as >18 MΩ resistance