発色団の存在下および非存在下におけるCu(II)とペプチド残基間の結合相互作用の定量化

要約

この記事では、電子吸収分光法と等温滴定熱量測定を使用して、ペプチドおよびタンパク質に結合するCu(II)の熱力学をプローブおよび定量することに焦点を当てます。

要約

銅(II)は、生体系に不可欠な金属であり、相互作用する生体分子に独自の化学的特性を与えます。様々なペプチドに直接結合し、構造の媒介から電子移動特性、触媒機能の付与に至るまで、必要かつ病理学的役割を果たすことが報告されている。これらのCu(II)-ペプチド複合体の結合親和性と熱力学を インビトロで 定量化することで、結合の熱力学的駆動力、ペプチドの異なる金属イオン間またはCu(II)の異なるペプチド間の潜在的な競合、およびCu(II)-ペプチド複合体の インビボでの有病率についての洞察が得られます。しかし、結合熱力学を定量化することは、滴定実験内のすべての競合平衡を説明することを含む無数の要因のために、特にペプチド、dブロック金属イオン、およびそれらの相互作用を表す離散的な分光ハンドルが欠落している場合には困難であり得る。

ここでは、Cu(II)-ペプチド熱力学の正確な定量化のための堅牢な一連の実験が提供されています。この記事では、Cu(II)に必要な分光ハンドルを提供するために、発色性リガンドの存在下および非存在下での電子吸収分光法の使用と、ラベルフリーの等温滴定熱量測定の使用に焦点を当てています。両方の実験技術において、すべての競合する平衡を説明するプロセスが記述されている。本稿の焦点はCu(II)にあるが、記載された一連の実験はCu(II)-ペプチド相互作用を超えて適用することができ、生理学的に関連する条件下で他の金属ペプチド系を正確に定量するためのフレームワークを提供することができる。

概要

生物学は、生命が周囲の環境に適応し、生き残るために必要な金属イオンの多様な化学を利用するように進化してきました。タンパク質の推定25%〜50%が構造および機能¹に金属イオンを使用する。金属イオンの特定の役割および酸化還元状態は、それを調整する生物学的リガンドの組成および幾何学的形状に直接関係する。さらに、Cu(II)などの酸化還元活性金属イオンは、フェントン様化学を介して酸化剤と相互作用して活性酸素種(ROS)^2,3,4を形成しないように、厳密に調整する必要があります。その生化学を駆動する結合様式と親和性を理解することは、金属イオンの生物学的役割を解明するのに役立つはずです。

金属とペプチドの結合相互作用を研究するために多くの技術が使用されています。これらは主に分光学的手法ですが、アミロイドベータ(Aβ)⁵の断片とのCu(II)相互作用から見られるように、分子動力学を用いたコンピュータシミュレーションも含まれます。多くの大学がアクセスできる広く使用されている分光技術は、核磁気共鳴(NMR)です。Cu(II)の常磁性の性質を利用して、Gaggelliらは、近くの原子核⁶の緩和を通じて、金属イオンが小柄な上でどこで結合するかを示すことができた。電子常磁性共鳴(EPR)は、常磁性金属イオン結合7の位置および様式をプローブするために利用する^{こともできる}。円二色性(CD)などの他の分光技術は、トリペプチド系⁸などの系におけるCu(II)に関する配位を記述することができ、質量分析は化学量論および金属イオンが断片化パターン^9,10を介してどの残基に配位されるかを示すことができる。

NMRなどのこれらの技術のいくつかは、標識フリーですが、大量のペプチドを必要とし、研究の課題を提起します。蛍光分光法と呼ばれる別の一般的な技術は、チロシンまたはトリプトファンの位置をCu(II)^11,12からの消光に関連付けるために利用されている。同様に、この技術は、Cu(II)結合¹³の結果としての構造変化を示すことができる。しかし、これらの金属ペプチド結合研究の課題は、すべての系が持っているわけではないチロシンなどの発色性アミノ酸をプローブすること、金属イオンが古典的なモデルの下で結合すること、およびこの技術が生理学的条件下では助長されない可能性があることである。実際、そのような発色性アミノ酸を含まないか、または古典モデルの下で結合しないいくつかのペプチドが出現しており、これらの技術の使用を妨げている^14、15。この記事では、生理学的に関連する条件下でこれらのシナリオで結合特性を評価するためのアプローチについて詳しく説明します。

生物学的リガンドは、ヒスチジン上のイミダゾール環などの金属イオン結合に影響を与え得る異なるプロトン化状態を採用し得る。pHが一貫して維持されていない場合、結果は複雑または矛盾する可能性があります。このため、バッファーは金属-タンパク質/ペプチド相互作用の研究において不可欠な成分です。しかしながら、多くの緩衝液は、金属イオン^16、17と良好に相互作用することが示されている。目的の生体分子と競合することに加えて、緩衝液は、ペプチドまたはタンパク質の配位原子と区別することが困難な類似の配位原子を有し得る。本研究では、Cu(II)-ペプチド相互作用を研究するための2つの補完的手法として、緩衝液の選択に関する特別な考慮事項として、電子吸収分光法と等温滴定熱量測定(ITC)に焦点を当てています。

電子吸収分光法は、金属結合相互作用を研究するための迅速で広くアクセス可能な技術です。紫外線(UV)または可視波長の光を照射すると、金属中心d-dバンドの吸収につながる可能性があり、配位子の分類、金属形状、および見かけ上の結合親和性に関する貴重な情報を提供します^18,19。これらの複合体について、金属イオンをタンパク質またはペプチド溶液に直接滴定することで、結合化学量論および明らかな結合親和性を定量化することができる。d5または^d10電子配置などのいくつかの場合において、錯体は光を吸収しない(すなわち、分光学的に静かである)。これらの分光学的に静かな遷移金属錯体では、金属イオンに配位すると検出可能な電荷移動バンドを生成する競合する配位子を使用することによって、これらの制限を回避することができる。いずれの場合も、このアプローチは化学量論と明らかな結合親和性の定量化のみに限定され、近似なしでは結合エンタルピーに関する洞察は提供されません。

電子吸収分光法から得られた情報を補完するITCは、結合エンタル^ピー20の直接的かつ厳密な定量化のための魅力的な技術である。ITCは、結合事象中に放出または消費される熱を直接測定し、滴定は一定の圧力で行われるため、測定される熱はすべての平衡のエンタルピー(ΔH_ITC)です。さらに、結合事象(n)および見かけ上の結合親和性(_KITC)の化学量論が定量化される。これらのパラメータから、自由エネルギー(ΔG ITC)およびエントロピー(ΔS_ITC)が決定され、結合事象の熱力学的スナップショットを提供する。ITCは光吸収に依存しないため、分光学的にサイレントな種、例えば^d5または^d10金属イオン錯体にとって理想的な技術である。しかし、熱量測定は熱を測定するため、比類のないバッファーシステムや考慮されていない平衡は、金属イオン結合熱力学を正確に決定するための分析に悪影響を及ぼす可能性があり、これらの要因に対処するために細心の注意を払わなければなりません²⁰。適切な厳密さで実施すれば、ITCは金属-タンパク質/ペプチド複合体の熱力学を決定するための堅牢な技術です。

ここでは、発色学的に静かな銅結合ペプチドであるC-ペプチドを使用して、2つの技術の相補的な使用を実証します。C-ペプチドは、インスリン成熟中に形成される31残基の切断産物(EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ)である。発色性残基を欠いているが、Cu(II)と生理学的に関連する親和性で結合することが示されている^14,15。Cu(II)結合部位は、グルタミン酸塩とアスパラギン酸塩の側鎖、ならびにペプチド^14,15のN末端からなる。これらの配位原子は、一般的に使用される多くの緩衝系の原子とよく似ている。ここでは、C-ペプチドへのCu(II)結合熱力学の定量における電子吸収分光法およびITCにおけるd-dおよび電荷移動バンドのタンデム使用が示されている。C-ペプチドへのCu(II)結合を研究することからのアプローチは、他の金属イオンおよびタンパク質/ペプチド系に適用することができる。

プロトコル

1.電子吸収分光法:バッファー競合による直接滴定

1. サンプル調製
   1. 超純水を用いてpH7.4で50mM 2-[ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノ]-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-ジオール(ビストリス)の緩衝溶液を調製する(>18MΩ耐性)。その後のろ過で少なくとも2時間、高親和性樹脂とインキュベートすることにより、微量金属イオンを除去します。
   2. 既知量のペプチドを無金属緩衝液に溶解または希釈する。
      注:吸光係数²¹の小さいd-dバンドをモニタリングする場合は、高濃度のペプチドを使用する必要があります。ここで、緩衝溶液中のCペプチドの最終濃度は300μMであった(体積はキュベットのサイズに依存する)。C-ペプチドは固相ペプチド合成によって合成され、文献¹⁴の他の箇所で詳述されている。
   3. 既知の質量の_CuCl2 を超純水に溶解し、10〜15mMで溶液を作製する。
      注:沈殿を防ぐために、最初に金属塩を非緩衝水に溶解させることが重要です。他のCu(II)塩を用いてもよいが、アニオンが弱く配位するように注意しなければならない。
2. 実験の実行
   1. 電子吸収分光光度計の電源を入れ、使用前に〜15〜20分間ウォームアップさせます。分光光度計ソフトウェアを起動し、スキャン範囲(200-900 nm)、スキャンレート(200 nm/s)、ダブルビームベースライン補正などのパラメータを設定します(その他のパラメータは 補足ファイルにリストされています)。
   2. ビーム経路にキュベットやサンプルがないベースラインを収集します。
   3. ダブルビーム分光光度計でマッチした2つのキュベットを使用して、1つのキュベットに115μLの超純水を、もう1つのキュベットに115μLのペプチドサンプルを負荷します。キュベットに気泡がないことを確認します。気泡は信号に干渉するためです。
   4. 参照ビームに超純水を入れたキュベットを、サンプルビームにペプチドを入れたキュベットを置きます。
   5. 無金属(アポ)ペプチドの吸収スペクトルを収集します。
   6. 化学量論的量以下(0.5当量、150μM)のCu(II)溶液をペプチドサンプルとともにキュベットに加えます。添加したCu(II)の容量が3μL未満であることを確認し、後で分析するために容量を記録します。
   7. 静かに上下にピペットで泡の発生を避けながら溶液を混合します。溶液を反応させて5分間平衡化し、吸収スペクトルを記録する。
   8. ステップ 1.2.6 と同様に Cu(II) アリコートをペプチド溶液に繰り返し添加し、1.0、1.5、2.0、3.0、および 5.0 (または合計 300、450、600、900、および 1,500 μM) の等価物を求めます。追加したCu(II)の総体積とキュベットの総体積を必ず記録してください。
      メモ: より多くの解像度が必要な場合は、同等の間隔を狭めます。
   9. サンプルキュベットを取り外し、製造元の指示に従って徹底的に清掃します。
   10. ペプチドを含まない緩衝溶液を加え、吸収スペクトルを記録する。ステップ1.2.5-1.2.8のようにCu(II)アリコートの添加を繰り返し、各Cu(II)相当の吸収スペクトルを記録する。
   11. すべてのスペクトルを処理用のcsvファイルとしてエクスポートします。製造元の指示に従ってキュベットを徹底的に清掃し、分光光度計の電源を切ります。
3. データの処理
   1. スプレッドシートプログラムにすべてのスペクトルをロードします。
   2. バッファーのみ(0 μM Cu(II))スペクトルを他のすべてのスペクトルから減算して、バッファー自体から吸光度の特徴を削除します。
   3. Cu(II)溶液の添加による希釈を考慮して、各スペクトルを正規化します(ステップ1.2.6)。正規化の例については、 補足ファイルEq (1)¹⁴ を参照してください。ここで、v_initial はキュベットに添加されたペプチドの体積(115 μL)、v Cu(II)はステップ1.2.6で添加された_Cu(II) 溶液の体積、Abs_{バッファー減算スペクトル} はステップ1.2.7で得られたデータです。
   4. すべてのスペクトルをまとめてグラフ化して、変化領域を特定します。
      注:Cu(II)錯体の典型的なd-dバンドの範囲は500〜750nmです。この分光光度滴定は、八面体幾何学²¹におけるラポルテ禁断遷移であるd−dバンドからの小さな吸光係数のために困難であり得る。吸光度が弱すぎる場合、別のアプローチは、Cu(II)に結合する際に電荷移動バンドをもたらす発色性リガンドを利用することである(セクション2を参照)。

2. 電子吸収分光法:発色性リガンドとのペプチド競合

1. サンプル調製
   1. 1,10−フェナントロリン(フェン)を超純水に溶解し、〜1mMの最終濃度を得た。
   2. ペプチド(工程1.1.2)およびCu(II)(工程1.1.3)についてセクション1.1で説明したサンプル調製に加えて、緩衝液中の10μMのCu(II)および40μMのフェン溶液([Cu(phen)₃]²⁺)を調製する。ボリュームがキュベットに充填されていることを確認します。
2. 実験の実行
   1. 手順1.2.1および1.2.2のように電子吸収分光光度計を起動し、スキャン範囲を200-400 nmに設定します。
   2. マッチした2つのキュベットに、1つのキュベットに115μLの超純水を、もう1つのキュベットに115μLの[Cu(phen)₃]²⁺ 溶液をロードします。参照ビームに水を入れたキュベットを、サンプルビームに[Cu(phen)₃]²⁺ 溶液を入れたキュベットを置きます。
   3. 金属配位子錯体の吸収スペクトルを収集する。
   4. 化学量論量(≈1当量、≈10μM)のペプチドを[Cu(phen)₃]²⁺ 溶液に加える。軽く上下にピペットで混ぜ合わせますが、気泡が入らないように注意してください。将来の分析のために添加されたペプチドの量を記録します。
      注:115 μLを保持するキュベットを使用して、3.83 μLの300 μMペプチドを加えると、最終ペプチド濃度9.7 μMが得られます。
   5. 平衡に達するために溶液を5分間インキュベートする。吸収スペクトルを記録します。
      注:金属ペプチドと金属リガンドの結合親和性が類似している場合、添加されるペプチドの濃度は大きく過剰である必要があります。正規化のために添加されたペプチドの総量を必ず考慮してください。
   6. ペプチドアリコートを [Cu(phen)3]²⁺ 溶液に繰り返し添加し、2、₃、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、22、および 26 の近似等価物を求めます。希釈濃度が決定できるように添加したペプチドの量を記録する。
   7. サンプルを取り出し、製造元の指示に従ってキュベットを徹底的に清掃します。バッファーのスペクトルを収集します。バッファー中の50 μMペプチドのスペクトルを収集します。
   8. すべてのデータを処理用のcsvファイルとしてエクスポートし、製造元の指示に従ってキュベットをクリーニングします。
3. データの処理
   1. スペクトルをスプレッドシートプログラムにロードし、他のスペクトルからバッファスペクトルを減算します。
   2. 補足ファイルEq (2)¹⁴に従ってスペクトルを正規化します。
   3. 265nmにおける[Cu(phen)₃]²⁺(ε_max=90,000 ^{M-1 cm-1})²²における[Cu(phen)3]2+の吸光係数を用いて、ペプチドを添加するたびに[Cu(phen)₃]²⁺の濃度を求める。
   4. ペプチドを添加するたびに、[Cu(phen)3]2+の初期濃度(0 μMペプチド時)から、ステップ2.3.2で決定した[Cu(phen)₃]²⁺の残存濃度を差し引いて、Cu(II)-ペプチド複合体の濃度を決定します。
   5. 遊離フェンリガンドの濃度は、補足ファイルの式(3)¹⁴により計算する。
   6. 補足ファイル、式(4)¹⁴を使用して遊離ペプチドの濃度を計算し、ここで、[ペプチド]_stockはキュベットに滴定された希釈されていないペプチドを表し、_V1は添加されたストックペプチドの体積を表し、_V2はキュベットの全体積であり、[^Cu2+-ペプチド]はステップ2.3.4で決定される。
   7. 実験的結合親和性(_Kex)は、補足ファイル²³のEq(5)を用いて計算する。
   8. 補足ファイルのEq (6)²³によってCu(II)-ペプチドの解離定数を_Kexに関連付け、ここでK_{d,Cu(II)-phen} = 1.0 × ^10-9(²²参照)。決定されたすべての解離定数から平均と標準偏差を求めます。
      注:フェン:Cu(II)、[Cu(phen)₃]2+、[Cu(phen)2]2+、および[Cu(phen)]₂⁺の4:1の比率では、溶液中に存在し、ペプチドは種([Cu(phen)]2+)から離れてCu(II)をキレートし、最も弱い結合²²でキレートします。

3. 等温滴定熱量測定

1. サンプル調製
   1. 超純水を用いてpH7.4で15mM 3-モルホリノプロパン-1-スルホン酸(MOPS)の緩衝溶液を調製する(>18MΩ耐性)。高親和性樹脂と少なくとも2時間インキュベートし、その後ボトルトップ0.45μm膜を通る真空ろ過を行うことで、微量金属イオンを除去します。
   2. 既知の質量の_CuCl2 を超純水に溶解し、≈50〜100mMの溶液を調製した。このCu(II)溶液を緩衝液に希釈し、終濃度1.4mM Cu(II)の1.0mL溶液を得た。使用した_CuCl2 溶液の正確な体積を記録する。
   3. ペプチド溶液を緩衝液に溶解または希釈して、450 μLの154 μMペプチド溶液を作ります。ステップ3.1.2からの追加の超純水を同じ割合でペプチド溶液に添加することを確認し、希釈熱を低減し、シグナル対ノイズを増加させる。
   4. サンプルの調製後、溶液が同じpHにあることを確認し、必要に応じて調整します。
   5. オプションのステップ:ITCにロードされるマイクロバブルを最小限に抑えるために、溶液を脱気します。
2. 実験の実行
   1. ITC をオンにします。ITCソフトウェアを起動して計測器を実行します。最初の初期化を待ってから、ビュレットをリホームするように要求します。次に、画面の指示に従います。
   2. 参照セルからカバーを取り外します。基準セルから水を取り除き、450 μLの脱気超純水で3回すすいでください。
   3. ローディングシリンジの450μLマークに超純水をゆっくりと吸い上げ、シリンジに気泡を入らないように注意します。ローディングシリンジを底部から≈1mmになるまで基準セルに挿入し、150μLがローディングシリンジに残るまで溶液の一部をゆっくりと注入する。ローディングシリンジプランジャーを≈25 μLずつ素早く上下に数回動かして、細胞表面の気泡を取り除きます。プランジャーがローディングシリンジの100 μLマークに達するまでゆっくりと注入し、それによって合計350 μLの超純水を基準セルに分配し、基準細胞カバーを交換する。
   4. サンプルセルから残留溶液を取り出し、ローディングシリンジを使用して450 μLの10 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を負荷します。EDTAが微量金属と結合するため、微量金属イオンが除去されるように10分間浸します。
   5. EDTA溶液(結合した微量金属イオンを含む)を取り出し、大量の超純水でローディングシリンジを十分にすすいでください。
   6. 製造元の指示に従ってITCを洗浄し、サンプルセルを超純水ですすいでください。
   7. 450 μLのバッファーで少なくとも3回リンスすることにより、サンプル細胞をコンディショニングします。
   8. サンプルセルをコンディショニングしているバッファーを削除します。ローディングシリンジを使用してペプチド溶液をサンプルセルにロードします(ステップ3.2.3に従います)。
   9. 滴定シリンジを200μLの緩衝溶液ですすいでください。これを行うには、プランジャーを取り外し、マイクロピペットを使用して、ガラス滴定シリンジの上部にある穴、シリンジ、および下の針を通してバッファーをピペットします。
   10. プランジャーを滴定シリンジに完全に挿入します。
   11. 滴定シリンジ針の先端を金属溶液に浸し、プランジャーをゆっくりと引き上げて、金属溶液がシリンジを満たし、滴定シリンジのガラス部分の上部に空隙体積をもたらす。滴定シリンジを床に平行に回転させて空隙体積の大部分を取り除き、プランジャーを取り外し、ガラス部分を床に向かってわずかに傾ける。溶液が滴定シリンジのガラス部分の端に移動し、空隙体積の大部分を満たすように滴定シリンジを穏やかに振るが、2〜3μLの空隙容積が残っていることを確認する。シリンジを床に平行に保ちながら、プランジャーを挿入し直します。
   12. 滴定シリンジを直立させ、針の先端を金属溶液に浸し直し、空気が針から出なくなるまでプランジャーを押し下げます。針の先端を溶液中に保ちながら、プランジャーを50 μLマークのすぐ上までゆっくりと引き上げて、滴定シリンジに負荷をかけます。
   13. 滴定シリンジのガラス部分を慎重にビュレットに挿入し、指がきつく締められるまでねじ込みます。プランジャーの圧縮により滴定シリンジから少量の溶液が出た場合は、軽量の繊細なワイパーを使用して、針の先端に触れることなく溶液を慎重に吸収します。
   14. 滴定シリンジ付きのビュレットをサンプルセルに挿入し、しっかりと固定します。
   15. ITCソフトウェアのパラメータを設定します。機器制御から始めて、攪拌速度(典型的な攪拌速度は150〜350 RPMの範囲)と実験を行う温度(通常25°C)を設定します。シリンジと細胞濃度をミリモル単位で「実験の詳細」に入力します。
   16. [実験方法]セクションで、[増分滴定]を選択します。「セットアップ」をクリックし、2.5 μL の注入を 20 回指定します。結合事象を観察するためにより多くの分解能が必要な場合は、注射回数を増やし、注射あたりの体積を減少させる。各注入間の時間間隔を入力して、信号が平衡化してベースラインに戻るのに十分な長さ(通常は300秒)になるようにします。
   17. [ 実行 ] ボタンをクリックして実験を開始し、データの保存場所を指定します。
   18. 実験の完了時に、試料細胞および滴定シリンジを洗浄する。
   19. すべての実験を少なくとも 3 回で実行して、正確なデータ収集を確保します。
   20. 金属溶液を緩衝溶液(ペプチドの非存在下)に滴定して、金属イオンからの希釈熱が小さく、考慮されていない平衡がないことを確認する対照実験を実行します。希釈熱が大きい場合は、可能であれば別のバッファーシステムを検討してください。
3. データの処理
   1. ITC 解析ソフトウェアを起動し、解析用のデータファイルをロードします。
   2. [ ベースライン] タブに移動し、サーモグラムを調べます。サーモグラム内の気泡やその他のアーチファクトから発生または吸収された外因性熱に注意してください。金属溶液の注入によるものではないスパイクを探します。
   3. 解析ソフトウェアによって生成されたベースラインが、注入および平衡化後のデータの一部に従っていることを確認します。逸脱した場合は、「 ベースライン」ピボットポイント を使用してベースラインを調整します。 積分領域 には金属の注入から生成されたピークが含まれていることを確認しますが、手順2で見つかったサーモグラム内の気泡やアーチファクトは隠します。サーモグラムからベースラインを減算します。
      注: このタイプの操作は、複数のサーモグラムが収集された後にのみ推奨されるため、ベースラインと 統合領域 を調整するとデータに大きく影響する可能性があるため、実験者は実際のデータとアーティファクトが何であるかを把握できます。
   4. [ モデリング] ウィンドウに移動して、分析ソフトウェアが各注射の統合および濃度正規化されたデータを表示するデータの適合を開始します。
   5. 最初の射出のデータムを左クリックして、継ぎ手アルゴリズムから除去します。
      注:滴定液とサンプル細胞溶液の間にはわずかな混合があり、最初の注射の不正確なモル分注につながるため、これは一般的です。
   6. [モデル]セクションで、[スタイル]ドロップダウンメニューの[空白(定数)]を選択します。これは、最終的な射出エンタルピーに基づいており、希釈熱を考慮してすべてのデータポイントから差し引かれます。さらに、2 番目の [スタイル] ドロップダウン メニューで [独立] (またはシステムに最適なモデル) を選択して、データを適合させます。
      メモ: 標準の 1:1 バインディング相互作用の場合、最も一般的なモデルは独立モデルです。
   7. 2つのモデルを使用してデータを当てはめるには、緑色の 再生 ボタンをΣで押します。
      メモ: ITC データを処理するもう 1 つのソフトウェアは、SEDPHAT²⁴ です。
   8. Grossoehmeらによって以前に報告された事後分析におけるすべての競合する均衡を説明する。²⁰。

結果

目標は、電子吸収分光法とITCの相補的技術を使用して、Cu(II)とC-ペプチドに結合する熱力学を定量化し、裏付けることでした。電子吸収分光法の堅牢な性質により、Cu(II)を300μM Cペプチドに直接滴定しました(図1)。150μMのCu(II)を添加すると、Cu(II)のd-dバンドに起因する600nmでのバンドの即時増加が起こり、300μMのCu(II)が添加されるまで増加し続けた。さらに300μMを超えるC...

ディスカッション

本稿では、ペプチドへのCu(II)結合の親和性と熱力学を定量化するための堅牢な方法を提供します。Cu(II)との錯体は、その^d9 電子配置のために金属部位のd-d吸収帯を監視するのに理想的である。吸光係数は小さいため、信頼性の高いシグナルを得るためには、より高い濃度の複合体が必要ですが、Cu(II)をペプチドに滴定すると、結合化学量論と近似結合親和性に関する洞察が迅速に得?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,10-phenanthroline	Sigma Aldrich	131377-25G
bis-Tris buffer	Fisher	BP301-100
Bottle-top 0.45 micron membrane	Nalgene	296-4545	Any filtration system that removes the resin without introducing contaminants is acceptable
Copper(II) chloride	Alfa Aesar	12458
EDTA	Sigma Aldrich	EDS-500G
Electronic absorption spectrophotometer	Varian	Cary 5000	Another suitable sensitive spectrophotometer is acceptable
high affinity resin	Sigma Aldrich	C7901-25G
Isothermal titration calorimeter (ITC)	TA Instruments	Nano ITC Low Volume
ITC analysis software	TA Instruments	NanoAnalyze	SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137–148) may also be used
ITC software	TA Instruments	ITCRun
light-duty delicate wiper	Kimwipe	34155
loading syringe	Hamilton	Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL
matched cuvettes	Starna Cells, Inc	16.100-Q-10/Z20	Ensure that the window for the small volume cuvette matches the beam height of the spectrophotometer
MOPS buffer	Alfa Aesar	A12914
spectrophotometer software	Cary	WinUV Scan
spreadsheet program	Microsoft	Excel	Any suitable spreadsheet program will work
titration syringe	TA Instruments	5346
ultrapure water	Millipore Sigma	Milli-Q	Any water is okay as long as >18 MΩ resistance