Infección viral experimental en mosquitos adultos por alimentación oral y microinyección

Resumen

Esta metodología, que incluyó la alimentación oral y la infección por inyección intratorácica, podría evaluar eficazmente la influencia de las barreras del intestino medio y/o de las glándulas salivales en la infección por arbovirus.

Resumen

Los virus transmitidos por mosquitos (MBV), que son patógenos infecciosos para los vertebrados, se propagan por muchas especies de mosquitos, lo que representa una grave amenaza para la salud pública. Una vez ingeridos, los virus deben superar la barrera del intestino medio del mosquito para llegar a la hemolinfa, desde donde podrían propagarse a las glándulas salivales. Cuando un mosquito pica, estos virus se propagan a nuevos huéspedes vertebrados. Del mismo modo, el mosquito puede recoger diferentes virus. En general, solo una pequeña porción de virus puede ingresar a las glándulas salivales a través del intestino. La eficiencia de transmisión de estos virus a las glándulas se ve afectada por las dos barreras físicas que se encuentran en diferentes especies de mosquitos: las barreras del intestino medio y las barreras de las glándulas salivales. Este protocolo presenta un método para la detección del virus en las glándulas salivales de Aedes aegypti después de la alimentación oral y la infección por inyección intratorácica. Además, determinar si los intestinos y / o las glándulas salivales dificultan la propagación viral puede ayudar en las evaluaciones de riesgo de MBV transmitidos por Aedes aegypti.

Introducción

Los virus transmitidos por mosquitos (MBV), un grupo heterogéneo de virus de ARN, pueden persistir en los mosquitos vectores y posteriormente propagarse a los huéspedes vertebrados¹. Los MBV clínicamente importantes se distribuyen principalmente en cuatro familias de virus, a saber, Flaviviridae, Togaviridae, Reoviridae y Peribunyavividae ^2,3. En las últimas décadas, estos virus se han reportado en todo el mundo, causando problemas de salud pública. Como uno de los MBV más conocidos, el virus del dengue (DENV) se ha convertido en el arbovirus emergente o reemergente más prevalente en más de 100 países durante los últimos 20 años⁴. Desde el descubrimiento del virus del Zika (ZIKV) en el interior, casi todos los países y territorios tropicales y subtropicales del continente han notificado infecciones humanas por ZIKV⁵. Con el fin de evaluar el riesgo de transmisión del virus, numerosos estudios en los últimos años se han centrado en la competencia del vector mosquito para estos virus ^6,7. Como resultado, es fundamental prevenir y controlar eficazmente las enfermedades transmitidas por vectores.

Aedes aegypti (Ae. aegypti), uno de los mosquitos más fáciles de criar en el laboratorio, es un vector importante de DENV, ZIKV, virus Chikungunya (CHIKV) y virus de la fiebre amarilla (YFV)⁸. Durante mucho tiempo, Ae. aegypti se encontró únicamente en el continente africano y en el sudeste asiático, pero en los últimos años ha colonizado casi todos los continentes⁹. Además, la abundancia global de Ae. aegypti ha estado creciendo continuamente, con un aumento estimado del 20% para fines del siglo¹⁰. De 2004 a 2009 en China, hubo un aumento evidente en la competencia vectorial Ae. aegypti para DENV debido a temperaturas diarias más altas¹¹. El estado de Ae. aegypti como vector patógeno ha aumentado significativamente en China. En consecuencia, para abordar estos desafíos, es necesario investigar la competencia vectorial de Ae. aegypti para transmitir virus.

Como artrópodo hematófago, el mosquito hembra perfora la piel de un huésped vertebrado y se alimenta de la sangre. Los mosquitos ocasionalmente adquieren virus de huéspedes infectados por virus y luego transfieren los virus a un nuevo huésped. Como tal, para determinar la competencia del vector, los mosquitos son alimentados con una harina de sangre artificial que contiene arbovirus a través de un sistema de alimentación en el entorno de laboratorio¹². Los mosquitos individuales se separan en cabezas, cuerpos y secreciones de saliva varios días después de la infección. Para medir las tasas de infección, diseminación y transmisión del virus, se han detectado títulos de virus mediante PCR cuantitativa con transcripción inversa (qRT-PCR) o ensayo de placa. Sin embargo, no todos los mosquitos desarrollan infecciones del intestino medio y la capacidad de transferir un virus al siguiente huésped después de la alimentación con sangre. Está relacionado con las barreras fisiológicas de los mosquitos, que evitan que los patógenos penetren en el cuerpo y juegan un papel vital en su inmunidad innata¹³. Las barreras del intestino medio, en particular la barrera de infección del intestino medio (MIB) y la barrera de escape del intestino medio (MEB), influyen en si el virus podría infectar el vector sistémicamente y la eficiencia con la que se propaga. Obstruye el análisis de la infección de otros tejidos, como las glándulas salivales, que también presentan infección de las glándulas salivales y barreras de escape^13,14. Para caracterizar mejor la infección del intestino medio y las glándulas salivales en el vector, se presenta aquí un protocolo detallado para la alimentación oral y la inoculación intratorácica de arbovirus en Ae. aegypti. Este protocolo podría aplicarse a infecciones adicionales por arbovirus en una variedad de mosquitos vectores, como la infección por DENV y ZIKV en Aedes spp., y podría resultar un procedimiento practicable.

Protocolo

1. Preparación de virus y mosquitos

1. Preparación de virus
   NOTA: Todos los procesos se llevaron a cabo en un laboratorio de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2). El nivel de contención de bioseguridad utilizado debe determinarse mediante la evaluación de riesgos del patógeno y las regulaciones específicas de las naciones y regiones. El proceso debe realizarse en un gabinete de bioseguridad.
   1. Inocular 1 x 10⁶ células C6/36 en un matraz de cultivo T75. Llene el matraz con 10 ml de medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 que contenga 10% de suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor y 1% de penicilina/estreptomicina (P/S).
      NOTA: El medio L-15 de Leibovitz (L15) o el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) también se pueden usar para mantener las células C6/36.
   2. Mantener las células en 5% de_CO2 a 28 °C durante la noche y eliminar el sobrenadante celular al día siguiente cuando las células estén 80%-90% confluentes.
   3. Añadir 1 ml de dilución del virus (Multiplicidad de infección (MOI) = 0,01) en el matraz e incubar las células durante 1 h en_CO2 al 5% a 28 °C. El virus del lago Ebinur (EBIV)¹⁵, un orthobunyavirus transmitido por mosquitos, se utilizó como virus modelo para este protocolo.
   4. Retire el sobrenadante y lave las células 3 veces con 5 ml de PBS. Llenar el matraz con 15 ml de medio RPMI nuevo con FBS al 2%. Mantener el matraz en_CO2 al 5% a 28 °C.
   5. Recoja el sobrenadante que contiene el virus cuando se alcance el título viral requerido (después de casi 5 días, dependiendo del virus utilizado). Para EBIV, este valor de título fue de 10^{a 7} unidades formadoras de placa (UFP)/ml. Subempaquételos en tubos individuales de almacenamiento con tapón de rosca de 2 ml y almacene los tubos que contienen 0,5-1 ml de virus a -80 °C.
2. Determinación del título viral
   NOTA: Determine el título viral a través de los ensayos de placa¹⁶. BHK-21 se utilizó para determinar el título viral de EBIV, debido al efecto citopático obvio (CPE) observado en las células infectadas.
   1. Inocular 1 x 10⁵ células BHK-21 en cada pocillo de placas de 24 pocillos. Llene cada pocillo con 1 ml de medio DMEM que contenga 10% de FBS y 1% de P/S. Mantener las células en 5% de_CO2 a 37 °C durante la noche.
   2. Haga seis (^10-6) diluciones sucesivas de 10 veces de sobrenadante que contenga virus con medio DMEM fresco que contenga 10% FBS y 1% P / S.
   3. Agregue 100 μL de diluyente de virus en cada pocillo de placas de 24 pocillos que contengan la monocapa BHK-21. Desechar el diluyente del virus después de la incubación durante 1 h en_CO2 al 5% a 37 °C. Agregue 500 μL de DMEM que contenga 1.5% de metilcelulosa a cada pocillo.
   4. Células de cultivo en_CO2 al 5% a 37 °C durante 48 h (el CPE aparente se encontró después de 48 h para EBIV). Fijar las células durante la noche con 750 μL de formaldehído al 3,7%.
   5. Tañaderlos con 200 μL de cristal violeta al 2% durante 15 min. Cuente el número de placas para calcular el título viral.
3. Cría de mosquitos en el laboratorio
   NOTA: Mosquitos traseros en un laboratorio de contención de artrópodos de nivel 1 (ACL-1).
   1. Para la preparación del agua declorada, llene un cubo de 20 L con agua del grifo y déjelo reposar durante 7-8 días sin luz. No cubra la tapa.
   2. Mantener los huevos y larvas de Ae. aegypti en una sala de mosquitos con las siguientes condiciones: 28 ± 1 °C con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h y una humedad relativa del 75% ± 5%.
   3. Mantenga casi 1,000 larvas en un plato poco profundo (22 cm x 15 cm x 6 cm) que contenga agua declorada después de que los huevos eclosionen. Aliméntelos con casi 1/8 cucharadita de polvo de alimento para ratones. Refresque la comida diariamente y cambie el agua cada 2 días.
   4. Una vez que las larvas pupan después de 5-7 días, use un gotero único para transferir las pupas a un vaso de plástico (7 oz) lleno de agua declorada.
   5. Coloque cinco tazas que contengan pupas (aproximadamente 200 por taza) en una jaula de malla (30 cm x 30 cm x 30 cm) y mantenga las jaulas en la incubadora de insectos con las mismas condiciones que en el paso 1.3.2.
   6. Coloque una pequeña esponja que contenga una solución de glucosa al 8% (m / p) en cada jaula de malla para alimentar a los mosquitos adultos. Después de la emergencia adulta, saque las tazas sin pupas. Mantenga las jaulas de malla con aproximadamente 1,000 mosquitos adultos por jaula en la misma incubadora de insectos.

2. Preparación para la infección oral

1. Prepare mosquitos hembra para la infección oral. Use la máquina absorbedora de mosquitos para recolectar mosquitos de 5 a 8 días de edad. Anestesiarlos a -20 °C durante 1 min y comprobar si los mosquitos están mareados. Si no, anestesiarlos durante otro minuto a -20 °C.
2. Viértalos rápidamente en los vasos de plástico (24 oz) a unos 200 mosquitos (hembra y macho) por taza. Cubra cada taza rápidamente con un mosquitero bien cortado, seguido de una tapa con un agujero (aproximadamente 6 cm de diámetro) en el medio.
3. Matar de hambre a los mosquitos durante 24 h antes de la infección oral y preparar harina de sangre infecciosa de la siguiente manera.
4. En un gabinete de bioseguridad en condiciones BSL-2, saque las existencias de virus del congelador a -80 °C y descongélelas en hielo. Diluir la cepa de virus a una concentración de 2 x 10⁶ UFP/ml con RPMI 1640 medio que contenga 10% FBS y 1% P/S. Mezclar la dilución del virus con un volumen igual de sangre de caballo desfibrada.
   NOTA: Los procesos se llevaron a cabo en un gabinete de bioseguridad en un laboratorio ACL-2.

3. Realizar la infección oral

NOTA: Todos los pasos se realizaron en un laboratorio de ACL-2. El proceso debe realizarse en la guantera para evitar que los mosquitos se escapen.

1. Realizar alimentación artificial utilizando el sistema de alimentación artificial de mosquitos durante 1 h.
   1. Corte las membranas de colágeno al tamaño apropiado (aproximadamente 5 cm de diámetro), asegúrelas a los reservorios con juntas tóricas y luego agregue la mezcla de virus y sangre (aproximadamente 3 ml) a los reservorios. Use tapones de plástico para sellar los depósitos y evitar fugas.
      NOTA: Estos pasos se realizaron en un gabinete de bioseguridad.
   2. Coloque los vasos de plástico (24 oz) que contienen mosquitos en la guantera. Atornille los depósitos sellados en el alimentador FU1 y coloque un depósito en una taza, luego encienda la unidad de potencia. Alimentar a los mosquitos durante 1 h
2. Anestesiar a los mosquitos con CO₂ durante varios segundos hasta que se desmayen. En resumen, coloque la pistola rociadora de dióxido de carbono en el medio de la malla de red a través del orificio de la taza que contiene mosquitos, abra el valor y permita que se arrojen grandes cantidades de dióxido de carbono para anestesiar a los mosquitos.
3. Viértelos en una placa de Petri colocada sobre hielo y tapa la tapa rápidamente. Elija los mosquitos hembra hinchados con fórceps. Para identificar, los machos tienen antenas plumosas y las hembras tienen antenas lisas. Transfiéralos a nuevos vasos de plástico a 50 mosquitos hembra por taza.
   NOTA: Los mosquitos hembra hinchados fueron seleccionados para mantener la consistencia ya que la cantidad de alimentación afecta el contenido viral.
4. Envuelva la taza con una malla de mosquitero cortada y luego cúbrala con una tapa con un agujero en el medio. Corta la esponja en un trozo pequeño y ponla en la taza.
5. Agregue una solución de glucosa al 8% en la esponja con un gotero desechable de plástico. Mantener las copas que contienen mosquitos hembra en la incubadora a 27 °C al 80% de humedad durante 10 días. Reemplace una nueva esponja saturada de glucosa cada 72 h.

4. Preparación para la inoculación intratorácica

1. Prepare las agujas de microinyección de la siguiente manera. Utilice un PUL-1000 para hacer agujas de microinyección (Figura 1A) con los siguientes parámetros en el programa de extracción de agujas: índice de calor = 450, fuerza (g) = 110, distancia (mm) = 1.00 y retardo (s) = 0.
2. Corte la punta de una aguja tirada con pinzas bajo el microscopio de disección con un aumento de 16x (Figura 1B). No haga la punta demasiado grande, de lo contrario puede dañar a los mosquitos.
3. Preparar los mosquitos hembra como en el paso 2.1.
   NOTA: Los siguientes procesos se realizaron en un laboratorio ACL-2.
4. Prepare la dilución del virus infeccioso de la siguiente manera:
   1. Saque el stock de virus del congelador a -80 °C y descongélelo en hielo. Diluir el virus a una dilución de virus de 100 nL que contenga 100-500 virus PFU con medio RPMI 1640 que contenga 10% FBS y 1% P/S. Mantenga la dilución del virus en hielo.
5. Rellene la aguja con aceite mineral a través de una jeringa estéril desechable. Coloque la aguja en el inyector siguiendo las instrucciones de la máquina.
6. Inserte la aguja en un tubo que contenga la dilución del virus infeccioso. No rompa la punta de la aguja. Pulse el botón FILL para llenar la aguja con una solución antivirus. El volumen final de la solución de virus en la aguja es de aproximadamente 4,0 μL. Una vez que la aguja esté llena del virus, tenga cuidado de no tocarla y dañarla.
   NOTA: Los pasos se realizaron en un gabinete de bioseguridad.

5. Realizar la inyección viral bajo un microscopio de disección

NOTA: Todos los pasos se realizaron en un laboratorio de ACL-2.

1. Anestesiar los mosquitos a -20 °C durante 1 min. Viértelos en una placa de Petri colocada sobre hielo y tapa la tapa rápidamente.
2. Escoge casi 50 mosquitos hembra con pinzas y colócalos en la placa de hielo. Coloque la placa de hielo debajo del inyector e inserte la aguja en la cavidad torácica del mosquito bajo el microscopio de disección (Figura 1C).
3. Ajuste el volumen de inyección a 100 nL y la velocidad a 50 nL/s. Presione el botón INYECTAR para permitir que la solución del virus fluya hacia el mosquito. Si se produce una inyección exitosa, el abdomen se abultará ligeramente.
4. Coloque el mosquito infectado en un nuevo vaso de plástico (24 oz) colocado en hielo. Cuando el número de mosquitos infectados sea suficiente, envuelva la taza con una malla de mosquitero cortada y luego cúbrala con la tapa.
5. Mantenga la taza que contiene mosquitos infecciosos en la incubadora a 27 °C al 80% de humedad durante 10 días. Alimente a los mosquitos como en el paso 3.5.

6. Procesamiento de los mosquitos hembra infectados

NOTA: Se diseccionaron tres tejidos/órganos diferentes de cada mosquito hembra: el intestino para calcular la tasa de infección por virus (VIR), la cabeza para calcular la tasa de diseminación del virus (VDR) y la saliva para calcular la tasa de transmisión del virus (VTR). VIR se definió como el número de mosquitos con intestinos positivos para el virus. VDR se definió como el número de mosquitos con cabezas positivas para el virus dividido por el número de mosquitos con intestinos positivos para el virus por 100. VTR se definió como el número de mosquitos con saliva positiva para el virus dividido por el número de mosquitos con intestinos positivos para el virus por 100.

1. Recolección de saliva de los mosquitos hembra infectados
   NOTA: Los procesos deben realizarse en un laboratorio ACL-2.
   1. Anestesiar a los mosquitos hembra infectados mediante anestesia con dióxido de carbono como en el paso 3.2. Viértalos en una placa de Petri colocada sobre hielo y cierre la tapa rápidamente.
   2. Coloque las puntas de pipeta de 10 μL llenas de aceite de inmersión una al lado de la otra sobre el barro de goma.
   3. Escoge mosquitos hembra con pinzas y colócalos en una placa de hielo. Quítale las patas y las alas con unas pinzas. Coloque la parte bucal de un mosquito en cada punta de pipeta.
   4. Recoja la saliva secretada en el aceite por los mosquitos durante los próximos 45-60 minutos a temperatura ambiente.
   5. Coloque las puntas de la pipeta en tubos de 1,5 ml que contengan 200 μL de medio diluyente de virus (medio RPMI 1640 que contenga 10 % de FBS y 1 % de P/S). Centrifugarlos a 5.000 x g durante 5 min a 4 °C para expulsar la saliva en tubos. Almacene estos tubos a -80 °C para la posterior determinación de las velocidades de transmisión.
2. Diseccionar los mosquitos hembra infectados
   NOTA: Los procesos deben realizarse en un laboratorio ACL-2.
   1. Use pinzas para cortar las cabezas de los mosquitos hembra después de la recolección de saliva. Coloque cada cabezal en un tubo individual que contenga 200 μL de medio RPMI 1640.
   2. Agarre el tórax con una pinza, luego el penúltimo segmento del abdomen con otra pinza y sáquelo. Se sacará el intestino. Limpie el intestino arrancado de cualquier tejido y órgano perdido.
   3. Lave el intestino con PBS y coloque cada intestino en un tubo individual que contenga 200 μL de medio RPMI 1640. Conservar estos tubos a -80 °C para determinar posteriormente la tasa de infección por virus y la tasa de diseminación.

7. Análisis de datos

1. Extracción de ARN
   1. Moler los tejidos en trozos con una máquina rectificadora homogeneizadora de tejidos a baja temperatura configurada con los siguientes parámetros: frecuencia de funcionamiento = 60 Hz, tiempo de operación = 15 s, tiempo de pausa = 10 s, ciclos = 2 y temperatura de ajuste = 4.0 ° C.
   2. Centrifugar las muestras a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C. Extraiga el ARN total de cada muestra mediante un sistema automatizado de extracción de ácidos nucleicos siguiendo las instrucciones del instrumento.
2. Realización de qRT-PCR
   1. Utilice el kit RT-PCR de un solo paso para cuantificar las copias de ARN viral utilizando un instrumento de PCR cuantitativa¹⁷. Utilice los siguientes cebadores para la detección del segmento S F del EBIV: ATGGCATCACCTGGGAAAG y R: TTCCAATGGCAAGTGGATAGAA. Configure el proceso de reacción como: etapa 1: 42 °C durante 5 min, 95 °C durante 10 s; etapa 2: 40 ciclos de 95 °C durante 5 s y 60 °C durante 20 s.
   2. Determinar la dosis más baja de virus para la infección en las células a través de las diluciones seriadas de 10 veces inoculadas en las células. Utilice las células BHK-21 para determinar la dosis más baja de EBIV para el virus, utilizando diluciones hasta ^10-7 como se describe en el paso 1.2.
   3. Calcular el valor de Ct de la dosis más baja del virus mediante qRT-PCR. Utilice el valor de corte para EBIV-positivo por qRT-PCR como < 35. Utilice la siguiente ecuación para calcular las copias del EBIV en cada muestra:
      y = -4.0312x + 3.384 [x = log (las copias de EBIV), y = valor Ct, R² = 0.9905]
   4. Calcule la tasa de infección, la tasa de diseminación y la tasa de transmisión de la siguiente manera:
      Tasa de infección (%) = 100 x (el número de intestinos de mosquitos positivos para virus / el número total de mosquitos)
      Tasa de diseminación (%) = 100 x (el número de cabezas de mosquito con virus positivos / el número de intestinos de mosquitos con virus positivos)
      Tasa de transmisión (%) = 100 x (el número de saliva de mosquito con virus positivo / el número de intestinos de mosquitos positivos para virus)
   5. Analice las diferencias en las variables continuas y las diferencias en las tasas de infección por mosquitos, las tasas de diseminación y las tasas de transmisión utilizando el análisis no paramétrico de Kruskal-Wallis para comparaciones múltiples y la prueba exacta de Fisher cuando corresponda.

Resultados

Para examinar la distribución del EBIV en los mosquitos infectados a través de la alimentación con sangre artificial (el título final viral fue de 6,4 x 10⁶ UFP/ml) y la inyección intratorácica (la dosis viral fue de 340 UFP), se determinaron los ARN virales en saliva, cabezas e intestinos de los mosquitos a los 10 días después de la infección (dpi).

Para Ae. aegypti, el título del virus EBIV en los intestinos, la cabeza y la saliva de los mosquitos hembr...

Discusión

El objetivo de este método era proporcionar una evaluación integral del riesgo de un virus transmitido por mosquitos mediante la evaluación de la competencia del vector a través de la alimentación oral y la inoculación intratorácica.

En el experimento de alimentación oral, los mosquitos hinchados deben ser recogidos y transferidos a un nuevo contenedor, lo que representa un grave riesgo para los operadores. La razón de esto es porque cualquier mosquito, incluidos los mosquitos no infe...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aedes aegypti			Rockefeller strain
Automated nucleic acid extraction system	NanoMagBio	S-48
BHK-21 cells	National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology
Buckets
C6/36 cells	National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology
Carbon dioxide spray gun	wuhan Yihong	YHDFPCO2
Centrifugal machine	Himac	CF16RN
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	CFX96 Touch
Ebinur Lake virus			Cu20-XJ isolation
Formaldehyde	Wuhan Baiqiandu	B0003
Glove box
Glucose	Hushi	10010518
Immersion oil	Cargille	16908-1
Insect incubator	Memmert	HPP750T7
Low Temperature Tissue Homogenizer Grinding Machine	Servicebio	KZ-III-F
Magnetic Virus Genome Extraction Kit	NanoMagBio	NMG0966-16
mesh cages (30 x 30 x 30 cm)	Huayu	HY-35
methylcellulose	Calbiochem	17851
mice feedstuff powder	BESSN	BS018
Microelectrode Puller	WPI	PUL-1000	PUL-1000 is a microprocessor controlled horizontal puller for making glass micropipettes or microelectrodes used in intracellular recording, patch clamp studies, microperfusion or microinjection.
Mosquito net meshes
Nanoject III Programmable Nanoliter Injector	Drummond	3-000-207
One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit	Takara	RR096A
PBS, pH 7.4	Gibco	C10010500BT
Penicillin/streptomycin	Gibco	151140-122
Petri dishes
Plastic cupes (7 oz)	Hubei Duoanduo
Plastic cups (24 oz)	Anhui shangji	PET32-Tub-1
Plastic disposable droppers	Biosharp	BS-XG-O3L-NS
Refrigerator (-80 °C)	sanyo	MDF-U54V
Replacement Glass Capillaries	Drummond	3-000-203-G/X
RPMI medium 1640	Gibco	C11875500BT
Screw cap storage tubes (2 mL )	biofil	FCT010005
Shallow dishes
Sponge
Sterile defibrillated horse blood	Wuhan Purity Biotechnology	CDHXB413
T75 culture flask	Corning	430829
The artificial mosquito feeding system	Hemotek	Hemotek PS6
The dissecting microscope	ZEISS	stemi508
The ice plates
The mosquito absorbing machine	Ningbo Bangning
The pipette tips	Axygen	TF
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056
Tweezers	Dumont	0203-5-PO