경구 수유 및 미세 주입에 의한 성인 모기의 실험적 바이러스 감염

요약

경구 수유 및 흉강내 주사 감염을 포함하는 이 방법론은 아르보 바이러스 감염에 대한 중장 및/또는 침샘 장벽의 영향을 효과적으로 평가할 수 있습니다.

초록

척추동물에 대한 감염성 병원체인 모기 매개 바이러스(MBV)는 많은 모기 종에 의해 전파되어 공중 보건에 심각한 위협이 됩니다. 일단 섭취되면 바이러스는 모기 중장 장벽을 극복하여 체액림프에 도달해야 하며, 그곳에서 잠재적으로 침샘으로 퍼질 수 있습니다. 모기에 물리면 이 바이러스는 새로운 척추동물 숙주에게 퍼집니다. 마찬가지로 모기는 다른 바이러스를 집어 올릴 수 있습니다. 일반적으로 바이러스의 아주 작은 부분만이 장을 통해 침샘으로 들어갈 수 있습니다. 땀샘으로의 이러한 바이러스의 전염 효율은 다른 모기 종에서 발견되는 두 가지 물리적 장벽, 즉 중장 장벽과 침샘 장벽의 영향을 받습니다. 이 프로토콜은 이집트숲모기의 경구 수유 및 흉강내 주사 감염 후 타액선에서 바이러스 검출 방법을 제시합니다. 또한, 내장 및/또는 침샘이 바이러스 확산을 방해하는지 여부를 결정하면 이집트숲모기에 의해 전염되는 MBV의 위험 평가에 도움이 될 수 있습니다.

서문

모기 매개 바이러스(Mosquito-borne virus, MBVs)는 이질적인 RNA 바이러스 그룹으로, 모기 매개체에서 잔류하다가 척추동물 숙주로 퍼질 수 있다¹. 임상적으로 중요한 MBV는 주로 Flaviviridae, Togaviridae, Reoviridae 및 Peribunyavividae ^2,3의 4가지 바이러스 계열에 분포합니다. 최근 수십 년 동안 이러한 바이러스는 전 세계적으로 보고되어 공중 보건 문제를 일으켰습니다. 가장 잘 알려진 MBV 중 하나인 뎅기열 바이러스(DENV)는 지난 20년 동안 100개 이상의 국가에서 가장 널리 퍼진 신종 또는 재출현 아르보 바이러스가 되었습니다⁴. 내륙에서 지카 바이러스(Zika virus, ZIKV)가 발견된 이후, 아프리카 대륙의 거의 모든 열대 및 아열대 국가와 영토에서 인간 ZIKV 감염이 보고되었다⁵. 바이러스 전파 위험을 평가하기 위해 최근 몇 년 동안 많은 연구가 이러한 바이러스에 대한 모기 벡터 능력에 초점을 맞추었습니다

프로토콜

1. 바이러스 및 모기의 준비

1. 바이러스의 준비
   참고: 모든 공정은 생물안전 레벨 2(BSL-2) 실험실에서 수행되었습니다. 사용되는 생물 안전성 관리 수준은 병원체의 위험 평가 및 국가 및 지역에 특정한 규정에 따라 결정되어야 합니다. 이 과정은 생물 안전 캐비닛에서 수행해야합니다.
   1. 1 x 10⁶ C6/36 세포를 T75 배양 플라스크에 접종합니다. 10% 열 비활성화 태아 소 혈청(FBS)과 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S)이 포함된 1640 배지 10mL의 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1를 플라스크에 채웁니다.
      참고: Leibovitz의 L-15 배지(L15) 또는 Dulbecco의 변형 Eagle's 배지(DMEM)도 C6/36 세포를 유지하는 데 사용할 수 있습니다.
   2. 세포를 28°C에서 5%_CO2 로 밤새 유지하고, 다음날 세포가 80%-90% 합류할 때 세포 상청액을 제거한다.
   3. 플라스크에 바이러스 희석액(Multiplicity of Infection(MOI) = 0.01) 1mL를 넣고 28°C에서 5%_CO2 에서 1시간 동안 세포를 배양합니다. 모기 매개 오르토부냐바이러....

결과

인공 혈액 공급(바이러스 최종 역가는 6.4 x 10⁶ PFU/mL) 및 흉부 내 주사(바이러스 용량은 340 PFU)를 통해 감염된 모기의 EBIV 분포를 조사하기 위해 감염 후 10일(dpi)에 모기의 타액, 머리 및 내장에 있는 바이러스 RNA를 결정했습니다.

Ae. aegypti의 경우, 흉부내 접종된 암컷 모기의 내장, 머리 및 타액에서 EBIV의 바이러스 역가는 경구에 감염된 암컷 모기보다 훨씬 .......

토론

이 방법의 목표는 경구 수유 및 흉부 내 접종을 통해 벡터 능력을 평가하여 모기 매개 바이러스에 대한 포괄적인 위험 평가를 제공하는 것이었습니다.

구강 수유 실험에서 충혈 된 모기를 골라내어 새 용기로 옮겨야하므로 작업자에게 심각한 위험을 초래할 수 있습니다. 그 이유는 감염되지 않은 모기를 포함한 모든 모기가 감염원이 될 수 있기 때문이다¹⁹. ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aedes aegypti			Rockefeller strain
Automated nucleic acid extraction system	NanoMagBio	S-48
BHK-21 cells	National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology
Buckets
C6/36 cells	National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology
Carbon dioxide spray gun	wuhan Yihong	YHDFPCO2
Centrifugal machine	Himac	CF16RN
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	CFX96 Touch
Ebinur Lake virus			Cu20-XJ isolation
Formaldehyde	Wuhan Baiqiandu	B0003
Glove box
Glucose	Hushi	10010518
Immersion oil	Cargille	16908-1
Insect incubator	Memmert	HPP750T7
Low Temperature Tissue Homogenizer Grinding Machine	Servicebio	KZ-III-F
Magnetic Virus Genome Extraction Kit	NanoMagBio	NMG0966-16
mesh cages (30 x 30 x 30 cm)	Huayu	HY-35
methylcellulose	Calbiochem	17851
mice feedstuff powder	BESSN	BS018
Microelectrode Puller	WPI	PUL-1000	PUL-1000 is a microprocessor controlled horizontal puller for making glass micropipettes or microelectrodes used in intracellular recording, patch clamp studies, microperfusion or microinjection.
Mosquito net meshes
Nanoject III Programmable Nanoliter Injector	Drummond	3-000-207
One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit	Takara	RR096A
PBS, pH 7.4	Gibco	C10010500BT
Penicillin/streptomycin	Gibco	151140-122
Petri dishes
Plastic cupes (7 oz)	Hubei Duoanduo
Plastic cups (24 oz)	Anhui shangji	PET32-Tub-1
Plastic disposable droppers	Biosharp	BS-XG-O3L-NS
Refrigerator (-80 °C)	sanyo	MDF-U54V
Replacement Glass Capillaries	Drummond	3-000-203-G/X
RPMI medium 1640	Gibco	C11875500BT
Screw cap storage tubes (2 mL )	biofil	FCT010005
Shallow dishes
Sponge
Sterile defibrillated horse blood	Wuhan Purity Biotechnology	CDHXB413
T75 culture flask	Corning	430829
The artificial mosquito feeding system	Hemotek	Hemotek PS6
The dissecting microscope	ZEISS	stemi508
The ice plates
The mosquito absorbing machine	Ningbo Bangning
The pipette tips	Axygen	TF
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056
Tweezers	Dumont	0203-5-PO