Un protocolo preanalítico estandarizado de biopsia líquida para aplicaciones de ADN libre de circulación aguas abajo

Resumen

La biopsia líquida ha revolucionado nuestro enfoque de los estudios traslacionales oncológicos, siendo la recolección de muestras, la calidad y el almacenamiento pasos cruciales para su aplicación clínica exitosa. Aquí describimos un protocolo estandarizado y validado para aplicaciones de ADN libre de circulación aguas abajo que se puede aplicar en la mayoría de los laboratorios de investigación traslacional.

Resumen

El término biopsia líquida (LB) se refiere a moléculas como proteínas, ADN, ARN, células o vesículas extracelulares en la sangre y otros fluidos corporales que se originan en el tumor primario y / o metastásico. LB se ha convertido en un pilar en la investigación traslacional y ha comenzado a formar parte de la práctica de oncología clínica, proporcionando una alternativa mínimamente invasiva a la biopsia sólida. El LB permite el monitoreo en tiempo real de un tumor a través de una extracción de muestra mínimamente invasiva, como la sangre. Las aplicaciones incluyen la detección temprana del cáncer, el seguimiento del paciente para la detección de la progresión de la enfermedad, la evaluación de la enfermedad residual mínima y la identificación potencial de la progresión molecular y el mecanismo de resistencia. Para lograr un análisis confiable de estas muestras que se puede informar en la clínica, los procedimientos preanalíticos deben considerarse cuidadosamente y seguirse estrictamente. La recolección de muestras, la calidad y el almacenamiento son pasos cruciales que determinan su utilidad en aplicaciones posteriores. Aquí, presentamos protocolos estandarizados de nuestro módulo de trabajo de biopsia líquida para recolectar, procesar y almacenar muestras de plasma y suero para el análisis de biopsia líquida aguas abajo basado en ADN libre de circulación. Los protocolos presentados aquí requieren equipos estándar y son lo suficientemente flexibles para ser aplicados en la mayoría de los laboratorios centrados en procedimientos biológicos.

Introducción

El término "biopsia líquida" se definió en 2010¹ como la presencia de moléculas (por ejemplo, proteína, ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN)), células o vesículas extracelulares (por ejemplo, exosomas) en la sangre y otros fluidos corporales que se originan en el tumor primario. El uso de muestras de biopsia líquida ha revolucionado la investigación oncológica traslacional, ya que las biopsias de tejido, limitadas a una región particular en un momento determinado, pueden perder clones relevantes debido a la heterogeneidad tumoral. Además, la biopsia líquida juega un papel relevante en los tipos de tumores donde el tejido primario es escaso o no accesible, ya que puede evitar una biopsia invasiva, reduciendo los costos y el riesgo para los pacientes. Además, las características moleculares del tumor están en constante evolución debido principalmente a la presión de la terapia, y las muestras de biopsia líquida pueden capturar la dinámica clonal del tumor, ya que se pueden tomar longitudinalmente, en diferentes momentos clínicos y terapéuticos de la enfermedad, como la línea de base, en el tratamiento, la mejor respuesta y en la progresión de la enfermedad o incluso antes. El concepto de "biopsia líquida en tiempo real" significa que los cambios dinámicos en el tumor se pueden monitorear en tiempo real, lo que permite la medicina de precisión en esta enfermedad. La biopsia líquida tiene numerosas aplicaciones potenciales en la clínica, incluyendo el cribado y la detección precoz del cáncer, la monitorización en tiempo real de la enfermedad, la detección de la enfermedad residual mínima, el estudio de los mecanismos de resistencia al tratamiento y la estratificación de los pacientes a nivel terapéutico¹. La detección precoz de la recurrencia y progresión de la enfermedad es una necesidad clínica insatisfecha en muchos tipos de tumores y es un factor clave para aumentar la supervivencia y la calidad de vida de los pacientes con cáncer. Las modalidades de diagnóstico por imágenes de rutina y los marcadores tumorales solubles pueden carecer de la sensibilidad y/o especificidad requerida para esta tarea. Por lo tanto, se necesitan urgentemente nuevos marcadores predictivos en la clínica, como los basados en ácidos nucleicos libres circulantes.

Los tipos de muestras que se utilizan para los estudios de biopsia líquida incluyen, entre otros, muestras de sangre, orina, saliva y heces. Otras muestras específicas del tumor pueden ser aspirados celulares, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, líquido de quistes y ascitis, esputo y jugo pancreático². Los primeros líquidos pueden contener diferentes tipos de materiales derivados del cáncer, células tumorales circulantes (CTC) o fragmentos como exosomas y ADN tumoral circulante libre de células (ctDNA). Los ácidos nucleicos pueden encapsularse en vesículas extracelulares (EV) o liberarse en los fluidos corporales debido a la muerte y el daño celular. El ADN libre circulante (cfDNA) se libera principalmente en el torrente sanguíneo desde células apoptóticas o necróticas y está presente en todos los individuos, mostrando niveles aumentados en enfermedades inflamatorias u oncológicas³. Los exosomas son pequeñas vesículas extracelulares (~30-150 nm) secretadas por células que contienen ácidos nucleicos, proteínas y lípidos. Estas vesículas forman parte de la red de comunicación intercelular y se encuentran comúnmente en muchos tipos de fluidos corporales². Los ácidos nucleicos encerrados dentro de los EV están protegidos del ambiente hostil dentro de los fluidos corporales, proporcionando así una forma más robusta de estudiar estas moléculas en el entorno de biopsia líquida.

En general, los niveles de ácidos nucleicos circulantes en las muestras de biopsia líquida son muy bajos y, por lo tanto, se necesitan métodos sensibles para la detección, como la PCR digital o la secuenciación de próxima generación (NGS). El manejo preanalítico de la muestra es crucial para prevenir la lisis de las células sanguíneas y la liberación de ADN intacto, causando la contaminación del cfDNA con el ADN genómico. Además, se debe tener cuidado al extraer muestras para evitar la presencia de inhibidores de los métodos de análisis basados en enzimas.

Aquí presentamos un método estandarizado para la recolección y almacenamiento de muestras de plasma y suero, que es un primer paso crucial para las aplicaciones posteriores basadas en biopsia líquida, incluidos los análisis de ácidos nucleicos circulantes.

Protocolo

Se obtuvo la aprobación ética previa de los centros participantes antes de la extracción de muestras de sangre. Los siguientes protocolos para el aislamiento de suero y plasma se realizaron de acuerdo con los principios éticos para la investigación biomédica.

NOTA: Aquí se proporcionan consideraciones previas antes de comenzar el protocolo. Se requiere la aprobación ética previa para el uso de muestras humanas en investigación biomédica, con el correspondiente consentimiento informado. Se requiere un gabinete de bioseguridad de clase II para manejar muestras de sangre. Se debe usar una bata de laboratorio, guantes protectores y anteojos durante todo el procedimiento para evitar la infección por patógenos transmitidos por la sangre. Se requiere un mínimo de 30 minutos para el procesamiento de muestras de suero. Después de la extracción de sangre en tubos sin anticoagulante, mantener a temperatura ambiente (RT) durante 30-45 min para permitir la formación de coágulos. Se requiere un mínimo de 40 minutos para la preparación del plasma, y las muestras deben procesarse dentro de las 4 h posteriores al momento de la extracción cuando se utilizan tubos de ácido tetraacético de etilendiamina (EDTA) o dentro de las 24-48 h si se utilizan tubos de recolección estabilizadores celulares o tubos específicos de recolección de ADN libre de células. Sin embargo, según algunos fabricantes, las muestras son estables hasta por 2 semanas en estos tubos especializados. Es importante verificar si hay hemólisis, lo que le dará al plasma o a la fracción sérica una apariencia rojiza. Consulte la sección de solución de problemas para ver los ejemplos hemolizados en la discusión.

1. Preparación de suero para estudios de biopsia líquida

NOTA: El tiempo total necesario para realizar este paso es de 30 min (Figura 1).

1. Extraiga 4-10 ml de sangre en tubos que no contengan anticoagulante (tapa roja o roja / gris-negra) y manténgala en RT durante 30-45 min. Procese estas muestras dentro de las 4 h posteriores al momento de la extracción.
2. Registre la hora y la fecha de la extracción de la muestra y la identificación del sujeto (ID) en una base de datos de muestras diseñada adecuadamente.
3. Usando una bata de laboratorio, guantes protectores y gafas, centrifugue el tubo que contiene sangre fresca a RT (15 °C-25 °C) durante 10 min a 1.600 (± 150) x g, con la rotura máxima aplicada.
4. Después de la centrifugación, retire cuidadosamente el tubo de la centrífuga; la fase superior del sobrenadante sérico aparecerá clara y amarillenta (Figura 2). Compruebe si la muestra muestra muestra signos de hemólisis (Figura 3) y registre la presencia de hemólisis cuando sea apropiado.
5. En un gabinete de bioseguridad de clase II, transfiera el suero a los tubos de recolección como alícuotas de 250 μL.
   NOTA: El volumen de las alícuotas debe ajustarse a los requisitos del estudio.
6. Congele inmediatamente el suero en posición vertical en una caja de almacenamiento a -80 °C y registre el tiempo de almacenamiento de la muestra.
7. Verifique que las muestras se procesaron dentro del plazo requerido de 4 horas.

2. Preparación plasmática para estudios de biopsia líquida

NOTA: El tiempo total necesario para realizar este paso es de 40 min (Figura 4).

1. Extraiga 4-10 ml de sangre en tubos que contengan ácido etilendiamina tetraacético (EDTA). Procese las muestras dentro de 4 h desde el momento de la extracción.
2. Registre la hora y la fecha de la extracción de la muestra y el ID del sujeto en una base de datos de muestras diseñada adecuadamente.
3. Usando una bata de laboratorio, guantes protectores y gafas, centrifugue el tubo EDTA a RT (15 °C-25 °C) durante 10 min a 1.600 (± 150) x g, con la rotura máxima aplicada.
   NOTA: Consulte las instrucciones del fabricante cuando utilice otros tubos de recogida.
4. Después de la centrifugación, el sobrenadante de plasma aparecerá claro y amarillento. Compruebe si la muestra muestra muestra signos de hemólisis (Figura 3) y transfiera el plasma (sobrenadante) a un tubo de centrífuga de 15 ml sin perturbar la capa celular utilizando una pipeta serológica desechable (o pipetas de bombilla desechable o pipetas p1000 con punta de filtro). Deje un pequeño volumen residual de plasma por encima de la capa celular (aproximadamente 5 mm).
5. Si se observa hemólisis, deseche la muestra para análisis adicionales. (Figura 5). Consulte la sección de solución de problemas en la Discusión para evaluar la hemólisis.
6. Centrifugar el plasma en un tubo centrífugo de 15 ml a RT (15 °C-25 °C) durante 10-20 min a 3.000 (±150) x g. Realice este paso para eliminar cualquier célula sanguínea intacta residual arrastrada desde el primer paso de centrifugación.
7. Después de la centrifugación, retire cuidadosamente el tubo de la centrífuga y transfiera 1-4 ml de plasma a viales criogénicos de polipropileno de 1-4 ml utilizando una pipeta serológica desechable (o pipeta de bombilla desechable o pipetas p1000 con punta de filtro). Se debe dejar un volumen residual de plasma (aproximadamente 0,3 ml o 7 mm de altura) en la parte inferior del tubo para evitar contaminar el plasma con células sanguíneas (Figura 5).
8. Congele inmediatamente el plasma en posición vertical en la caja de almacenamiento a -80 °C y registre el tiempo de almacenamiento de la muestra. Verifique que las muestras se procesaron dentro del plazo requerido de 4 horas.
9. Recoge la capa celular (capa buffy) usando un P1000 y una punta filtrada y transfiérela a un tubo de 2 ml. Congelar y conservar inmediatamente a -80 °C.

Resultados

Después de la centrifugación de los tubos sanguíneos sin anticoagulante, la fase superior aparece de un amarillo pálido y corresponde a la fracción sérica (Figura 2). Esta fracción se retira cuidadosamente y se alicita para su posterior análisis.

La hemólisis puede estar presente en la fracción plasmática o sérica, y la fase superior tendrá un aspecto rojizo, lo que indica la presencia y el grado de hemólisis (Figura 3)....

Discusión

La biopsia líquida tiene numerosas aplicaciones potenciales en diferentes momentos durante el tratamiento del cáncer. Primero, en el momento del diagnóstico para identificar marcadores moleculares tumorales que sugieran la presencia de una posible lesión tumoral que podría investigarse más a fondo clínicamente. En segundo lugar, durante el tratamiento para la monitorización en tiempo real de la enfermedad, la evaluación de la respuesta molecular del tratamiento, la evolución clonal y la detección precoz de rec...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Eppendorf tubes	Eppendorf	0030 120.086	Any standard tubes/equipment can be used
10 mL serological disposable pipettes	BIOFIL	GSP010010	Any standard tubes/equipment can be used
10 mL Vacutainer K2 EDTA tube	Becton Dickinson	367525	These tubes can be used for plasma collection
15 mL polypropylene centrifuge tubes	BIOFIL	CFT411150	Any standard tubes/equipment can be used
3.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant	Becton Dickinson	368965	Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection
4 mL polypropylene cryogenic vial, round bottom, self-standing	Corning	430662	Any standard tubes/equipment can be used
4 mL Vacutainer K2 EDTA tube	Becton Dickinson	367864	These tubes can be used for plasma collection
4200 TapeStation System	Agilent	G2991BA	Several quantification methods are available with a  specific application for cfDNA
5 mL serological disposable pipettes	BIOFIL	GSP010005	Any standard tubes/equipment can be used
8.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant	Becton Dickinson	366468	Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection
Centrifuge, capable of ~3000 x g with a swing bucket rotor	Thermo Fisher Scientific	Sorvall ST 16  10688725	Any standard tubes/equipment can be used
Freezer storage boxes for 1–4 mLcryogenic vials	Corning	431120	These boxes are needed when using 4 mL vials for storage
p1000 pipette tips	CORNING	4809	Any standard tubes/equipment can be used
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit	Qiagen	55114	Any commercially available kit that is specific for cfDNA isolation can be used with this blood prcessing protocol.
Streck Cell-Free DNA BCT CE tubes 10 mL	Streck	218997	These tubes can be used for plasma collection
Temperature Freezer (-80 °C)	ESCO	2180104	Any standard tubes/equipment can be used