Un protocollo preanalitico standardizzato per biopsia liquida per applicazioni di DNA libero da circolazione a valle

Riepilogo

La biopsia liquida ha rivoluzionato il nostro approccio agli studi traslazionali oncologici, con la raccolta, la qualità e lo stoccaggio dei campioni come passaggi cruciali per la sua applicazione clinica di successo. Qui descriviamo un protocollo standardizzato e convalidato per applicazioni di DNA senza circolazione a valle che può essere applicato nella maggior parte dei laboratori di ricerca traslazionale.

Abstract

Il termine biopsia liquida (LB) si riferisce a molecole come proteine, DNA, RNA, cellule o vescicole extracellulari nel sangue e altri fluidi corporei che provengono dal tumore primario e / o metastatico. LB è emerso come un pilastro nella ricerca traslazionale e ha iniziato a diventare parte della pratica oncologica clinica, fornendo un'alternativa minimamente invasiva alla biopsia solida. L'LB consente il monitoraggio in tempo reale di un tumore tramite un'estrazione del campione minimamente invasiva, come il sangue. Le applicazioni includono la diagnosi precoce del cancro, il follow-up del paziente per il rilevamento della progressione della malattia, la valutazione della malattia residua minima e la potenziale identificazione della progressione molecolare e del meccanismo di resistenza. Al fine di ottenere un'analisi affidabile di questi campioni che può essere riportata in clinica, le procedure preanalitiche devono essere attentamente considerate e rigorosamente seguite. La raccolta, la qualità e l'archiviazione dei campioni sono passaggi cruciali che ne determinano l'utilità nelle applicazioni a valle. Qui, presentiamo protocolli standardizzati dal nostro modulo di lavoro per biopsia liquida per la raccolta, l'elaborazione e la conservazione di campioni di plasma e siero per l'analisi della biopsia liquida a valle basata sul DNA privo di circolazione. I protocolli qui presentati richiedono attrezzature standard e sono sufficientemente flessibili da essere applicati nella maggior parte dei laboratori focalizzati su procedure biologiche.

Introduzione

Il termine "biopsia liquida" è stato definito nel 2010¹ come la presenza di molecole (ad esempio, proteine, acido desossiribonucleico (DNA), acido ribonucleico (RNA)), cellule o vescicole extracellulari (ad esempio, esosomi) nel sangue e in altri fluidi corporei che provengono dal tumore primario. L'uso di campioni di biopsia liquida ha rivoluzionato la ricerca oncologica traslazionale in quanto le biopsie tissutali, limitate a una particolare regione in un particolare momento, possono perdere cloni rilevanti a causa dell'eterogeneità del tumore. Inoltre, la biopsia liquida svolge un ruolo rilevante nei tipi di tumore in cui il tessuto primario è scarso o non accessibile, in quanto può evitare una biopsia invasiva, riducendo i costi e i rischi per i pazienti. Inoltre, le caratteristiche molecolari del tumore sono in continua evoluzione principalmente a causa della pressione della terapia, e i campioni di biopsia liquida possono catturare la dinamica clonale del tumore in quanto possono essere prelevati longitudinalmente, in diversi momenti clinici e terapeutici della malattia come al basale, al trattamento, alla migliore risposta e alla progressione della malattia o anche prima. Il concetto di "biopsia liquida in tempo reale" significa che i cambiamenti dinamici nel tumore possono essere monitorati in tempo reale, consentendo così la medicina di precisione in questa malattia. La biopsia liquida ha numerose potenziali applicazioni in clinica, tra cui lo screening e la diagnosi precoce del cancro, il monitoraggio in tempo reale della malattia, il rilevamento della malattia residua minima, lo studio dei meccanismi di resistenza al trattamento e la stratificazione dei pazienti a livello terapeutico¹. La diagnosi precoce della recidiva e della progressione della malattia è un'esigenza clinica insoddisfatta in molti tipi di tumore ed è un fattore chiave per aumentare la sopravvivenza e la qualità della vita dei malati di cancro. Le modalità di imaging di routine e i marcatori tumorali solubili possono non avere la sensibilità e / o la specificità richieste per questo compito. Pertanto, nuovi marcatori predittivi sono urgentemente necessari nella clinica, come quelli basati su acidi nucleici liberi circolanti.

I tipi di campioni utilizzati per gli studi di biopsia liquida includono, ma non sono limitati a sangue, urina, saliva e campioni di feci. Altri campioni specifici del tumore possono essere aspirati cellulari, liquido cerebrospinale, liquido pleurico, liquido di cisti e ascite, espettorato e succo pancreatico². I primi liquidi possono contenere diversi tipi di materiali derivati dal cancro, cellule tumorali circolanti (CTC) o frammenti come esosomi e DNA tumorale circolante privo di cellule (ctDNA). Gli acidi nucleici possono essere incapsulati in vescicole extracellulari (EV) o rilasciati nei fluidi corporei a causa della morte e del danno cellulare. Il DNA libero circolante (cfDNA) viene rilasciato principalmente nel flusso sanguigno da cellule apoptotiche o necrotiche ed è presente in tutti gli individui, mostrando livelli aumentati nelle malattie infiammatorie o oncologiche³. Gli esosomi sono piccole vescicole extracellulari (~ 30-150 nm) secrete da cellule contenenti acidi nucleici, proteine e lipidi. Queste vescicole fanno parte della rete di comunicazione intercellulare e si trovano comunemente in molti tipi di fluidi corporei². Gli acidi nucleici racchiusi all'interno dei veicoli elettrici sono protetti dall'ambiente ostile all'interno dei fluidi corporei, fornendo così un modo più robusto per studiare queste molecole nell'ambiente della biopsia liquida.

Nel complesso, i livelli di acidi nucleici circolanti nei campioni di biopsia liquida sono molto bassi e quindi sono necessari metodi sensibili per il rilevamento, come la PCR digitale o il sequenziamento di nuova generazione (NGS). La gestione preanalitica del campione è fondamentale per prevenire la lisi delle cellule del sangue e il rilascio di DNA intatto, causando la contaminazione del cfDNA con il DNA genomico. Inoltre, è necessario prestare attenzione durante l'estrazione dei campioni per evitare la presenza di inibitori dei metodi di analisi basati su enzimi.

Qui presentiamo un metodo standardizzato per la raccolta e lo stoccaggio di campioni di plasma e siero, che è un primo passo cruciale per le applicazioni a valle basate sulla biopsia liquida, comprese le analisi degli acidi nucleici circolanti.

Protocollo

La previa approvazione etica è stata ottenuta dai centri partecipanti prima dell'estrazione dei campioni di sangue. I seguenti protocolli per l'isolamento del siero e del plasma sono stati eseguiti in conformità con i principi etici per la ricerca biomedica.

NOTA: le considerazioni preliminari prima di iniziare il protocollo sono fornite qui. È necessaria una previa approvazione etica per l'uso di campioni umani nella ricerca biomedica, con il corrispondente consenso informato. Per gestire i campioni di sangue è necessario un armadietto di biosicurezza di classe II. Un cappotto da laboratorio, guanti protettivi e occhiali devono essere indossati durante tutta la procedura per evitare l'infezione da agenti patogeni trasmessi dal sangue. È richiesto un minimo di 30 minuti per l'elaborazione dei campioni di siero. Dopo l'estrazione del sangue in tubi senza anticoagulante, mantenere a temperatura ambiente (RT) per 30-45 minuti per consentire la formazione di coaguli. È richiesto un minimo di 40 minuti per la preparazione del plasma e i campioni devono essere elaborati entro 4 ore dal momento dell'estrazione quando si utilizzano tubi di acido tetra-acetico (EDTA) di etilendiammina o entro 24-48 ore se si utilizzano tubi di raccolta stabilizzanti cellulari o specifici tubi di raccolta del DNA privi di cellule. Tuttavia, secondo alcuni produttori, i campioni sono stabili fino a 2 settimane in questi tubi specializzati. È importante verificare l'emolisi, che darà al plasma o alla frazione sierica un aspetto rossastro. Vedere la sezione relativa alla risoluzione dei problemi per gli esempi emolizzati nella discussione.

1. Preparazione del siero per studi di biopsia liquida

NOTA: il tempo totale necessario per eseguire questo passaggio è di 30 minuti (Figura 1).

1. Estrarre 4-10 ml di sangue in provette prive di anticoagulante (cappuccio rosso o rosso/grigio-nero) e mantenere a RT per 30-45 min. Elaborare questi campioni entro 4 ore dal momento dell'estrazione.
2. Registrare l'ora e la data dell'estrazione del campione e l'identificazione del soggetto (ID) in un database di campioni opportunamente progettato.
3. Indossando un camice da laboratorio, guanti protettivi e occhiali, centrifugare il tubo contenente sangue fresco a RT (15 °C-25 °C) per 10 minuti a 1.600 (± 150) x g, con la massima pausa applicata.
4. Dopo la centrifugazione, rimuovere con cura il tubo dalla centrifuga; la fase superiore del surnatante sierico apparirà chiara e giallastra (Figura 2). Controllare se il campione mostra segni di emolisi (Figura 3) e registrare la presenza di emolisi quando appropriato.
5. In un armadio di biosicurezza di classe II, trasferire il siero in tubi di raccolta come aliquote da 250 μL.
   NOTA: Il volume delle aliquote deve essere adeguato alle esigenze dello studio.
6. Congelare immediatamente il siero in posizione verticale in una scatola di stoccaggio a -80 °C e registrare il tempo di conservazione del campione.
7. Verificare che i campioni siano stati elaborati entro il periodo di tempo richiesto di 4 ore.

2. Preparazione del plasma per studi di biopsia liquida

NOTA: il tempo totale necessario per eseguire questo passaggio è di 40 minuti (Figura 4).

1. Estratto 4-10 ml di sangue in provette contenenti acido tetra-acetico etilendiammina (EDTA). Elaborare i campioni entro 4 ore dal momento dell'estrazione.
2. Registrare l'ora e la data dell'estrazione del campione e l'ID soggetto in un database di campioni progettato in modo appropriato.
3. Indossando un camice da laboratorio, guanti protettivi e occhiali, centrifugare il tubo EDTA a RT (15 °C-25 °C) per 10 minuti a 1.600 (± 150) x g, con la massima rottura applicata.
   NOTA: fare riferimento alle istruzioni del produttore quando si utilizzano altri tubi di raccolta.
4. Dopo la centrifugazione, il surnatante plasmatico apparirà chiaro e giallastro. Controllare se il campione mostra segni di emolisi (Figura 3) e trasferire il plasma (surnatante) in un tubo centrifugo da 15 ml senza disturbare lo strato cellulare utilizzando una pipetta sierologica monouso (o pipetta a bulbo monouso o pipette p1000 con punta del filtro). Lasciare un piccolo volume residuo di plasma sopra lo strato cellulare (circa 5 mm).
5. Se si osserva emolisi, scartare il campione per ulteriori analisi. (Figura 5). Vedere la sezione relativa alla risoluzione dei problemi nella Discussione per valutare l'emolisi.
6. Centrifugare il plasma in un tubo centrifugo da 15 mL a RT (15 °C-25 °C) per 10-20 min a 3.000 (±150) x g. Eseguire questo passaggio per rimuovere eventuali cellule del sangue intatte residue trasportate dalla prima fase di centrifugazione.
7. Dopo la centrifugazione, rimuovere con cura il tubo dalla centrifuga e trasferire 1-4 mL di plasma in flaconcini criogenici in polipropilene da 1-4 mL utilizzando una pipetta sierologica monouso (o pipetta a bulbo monouso o pipette p1000 con punta filtrante). Un volume residuo di plasma (circa 0,3 ml o 7 mm di altezza) deve essere lasciato sul fondo del tubo per evitare di contaminare il plasma con cellule del sangue (Figura 5).
8. Congelare immediatamente il plasma in posizione verticale nella scatola di stoccaggio a -80 °C e registrare il tempo di conservazione del campione. Verificare che i campioni siano stati elaborati entro il periodo di tempo richiesto di 4 ore.
9. Raccogliere lo strato cellulare (buffy coat) utilizzando un P1000 e la punta filtrata e trasferirlo in un tubo da 2 ml. Congelare e conservare immediatamente a -80 °C.

Risultati

Dopo la centrifugazione delle provette del sangue senza anticoagulante, la fase superiore appare di un giallo pallido e corrisponde alla frazione sierica (Figura 2). Questa frazione viene accuratamente rimossa e aliquotata per un'analisi successiva.

L'emolisi può essere presente sia nel plasma che nella frazione sierica e la fase superiore avrà un aspetto rossastro, che indica la presenza e il grado di emolisi (Figura 3).

Discussione

La biopsia liquida ha numerose potenziali applicazioni in momenti diversi durante la gestione del cancro. In primo luogo, alla diagnosi per identificare i marcatori molecolari tumorali che suggerirebbero la presenza di una potenziale lesione tumorale che potrebbe essere ulteriormente studiata clinicamente. In secondo luogo, durante il trattamento per il monitoraggio in tempo reale della malattia, la valutazione della risposta molecolare del trattamento, l'evoluzione clonale e la diagnosi precoce delle recidive della mala...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Eppendorf tubes	Eppendorf	0030 120.086	Any standard tubes/equipment can be used
10 mL serological disposable pipettes	BIOFIL	GSP010010	Any standard tubes/equipment can be used
10 mL Vacutainer K2 EDTA tube	Becton Dickinson	367525	These tubes can be used for plasma collection
15 mL polypropylene centrifuge tubes	BIOFIL	CFT411150	Any standard tubes/equipment can be used
3.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant	Becton Dickinson	368965	Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection
4 mL polypropylene cryogenic vial, round bottom, self-standing	Corning	430662	Any standard tubes/equipment can be used
4 mL Vacutainer K2 EDTA tube	Becton Dickinson	367864	These tubes can be used for plasma collection
4200 TapeStation System	Agilent	G2991BA	Several quantification methods are available with a  specific application for cfDNA
5 mL serological disposable pipettes	BIOFIL	GSP010005	Any standard tubes/equipment can be used
8.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant	Becton Dickinson	366468	Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection
Centrifuge, capable of ~3000 x g with a swing bucket rotor	Thermo Fisher Scientific	Sorvall ST 16  10688725	Any standard tubes/equipment can be used
Freezer storage boxes for 1–4 mLcryogenic vials	Corning	431120	These boxes are needed when using 4 mL vials for storage
p1000 pipette tips	CORNING	4809	Any standard tubes/equipment can be used
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit	Qiagen	55114	Any commercially available kit that is specific for cfDNA isolation can be used with this blood prcessing protocol.
Streck Cell-Free DNA BCT CE tubes 10 mL	Streck	218997	These tubes can be used for plasma collection
Temperature Freezer (-80 °C)	ESCO	2180104	Any standard tubes/equipment can be used