Стандартизированный преаналитический протокол жидкой биопсии для последующих применений ДНК без циркуляции

Резюме

Жидкая биопсия произвела революцию в нашем подходе к трансляционным исследованиям онкологии, при этом сбор, качество и хранение образцов являются важнейшими шагами для ее успешного клинического применения. Здесь мы описываем стандартизированный и проверенный протокол для последующих приложений ДНК без циркуляции, который может быть применен в большинстве трансляционных исследовательских лабораторий.

Аннотация

Термин жидкая биопсия (LB) относится к молекулам, таким как белки, ДНК, РНК, клетки или внеклеточные везикулы в крови и других жидкостях организма, которые происходят из первичной и / или метастатической опухоли. LB стал опорой в трансляционных исследованиях и начал становиться частью клинической онкологической практики, обеспечивая минимально инвазивную альтернативу твердой биопсии. LB позволяет контролировать опухоль в режиме реального времени с помощью минимально инвазивной экстракции образца, такого как кровь. Приложения включают раннее выявление рака, наблюдение за пациентами для выявления прогрессирования заболевания, оценку минимального остаточного заболевания и потенциальную идентификацию молекулярной прогрессии и механизма резистентности. Для того чтобы добиться достоверного анализа этих образцов, о которых можно сообщить в клинику, преаналитические процедуры следует тщательно обдумывать и строго соблюдать. Сбор, качество и хранение образцов являются важнейшими шагами, определяющими их полезность в последующих приложениях. Здесь мы представляем стандартизированные протоколы из нашего рабочего модуля жидкой биопсии для сбора, обработки и хранения образцов плазмы и сыворотки для последующего анализа жидкой биопсии на основе свободной от циркуляции ДНК. Представленные здесь протоколы требуют стандартного оборудования и достаточно гибки для применения в большинстве лабораторий, ориентированных на биологические процедуры.

Введение

Термин «жидкая биопсия» был определен в 2010^году1 как присутствие молекул (например, белка, дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), рибонуклеиновой кислоты (РНК)), клеток или внеклеточных везикул (например, экзосом) в крови и других жидкостях организма, которые происходят из первичной опухоли. Использование образцов жидкой биопсии произвело революцию в трансляционных онкологических исследованиях, поскольку биопсия тканей, ограниченная определенной областью в определенный момент, может пропустить соответствующие клоны из-за гетерогенности опухоли. Кроме того, жидкая биопсия играет важную роль в типах опухолей, где первичная ткань скудна или недоступна, поскольку она может избежать инвазивной биопсии, снижая затраты и риск для пациентов. Кроме того, молекулярные характеристики опухоли постоянно развиваются в основном из-за терапевтического давления, и образцы жидкой биопсии могут захватывать клональную динамику опухоли, поскольку их можно брать продольно, в различные клинические и терапевтические периоды заболевания, такие как исходный уровень, лечение, наилучший ответ и прогрессирование заболевания или даже раньше. Концепция «жидкой биопсии в реальном времени» означает, что динамические изменения в опухоли могут контролироваться в режиме реального времени, что позволяет проводить прецизионную медицину при этом заболевании. Жидкая биопсия имеет множество потенциальных применений в клинике, включая скрининг и раннее выявление рака, мониторинг заболевания в режиме реального времени, выявление минимального остаточного заболевания, изучение механизмов резистентности к лечению и стратификацию пациентов на терапевтическом уровне¹. Раннее выявление рецидива и прогрессирования заболевания является неудовлетворенной клинической потребностью во многих типах опухолей и является ключевым фактором повышения выживаемости и качества жизни больных раком. Обычные методы визуализации и растворимые опухолевые маркеры могут не иметь чувствительности и / или специфичности, необходимых для этой задачи. Таким образом, в клинике срочно необходимы новые прогностические маркеры, такие как те, которые основаны на циркулирующих свободных нуклеиновых кислотах.

Типы образцов, которые используются для исследований жидкой биопсии, включают, но не ограничиваются ими, образцы крови, мочи, слюны и стула. Другими опухолеспецифическими образцами могут быть клеточные аспираты, спинномозговая жидкость, плевральная жидкость, киста и асцит жидкости, мокрота и панкреатический сок². Первые жидкости могут содержать различные типы материалов, полученных из рака, циркулирующие опухолевые клетки (CTC) или фрагменты, такие как экзосомы и бесклеточная циркулирующая опухолевая ДНК (ctDNA). Нуклеиновые кислоты могут быть инкапсулированы во внеклеточные везикулы (EV) или высвобождаться в жидкости организма из-за гибели и повреждения клеток. Циркулирующая свободная ДНК (cfDNA) в основном высвобождается в кровоток из апоптотических или некротических клеток и присутствует у всех людей, показывая повышенные уровни при воспалительных или онкологических заболеваниях³. Экзосомы представляют собой небольшие внеклеточные везикулы (~30-150 нм), секретируемые клетками, содержащими нуклеиновые кислоты, белки и липиды. Эти везикулы являются частью межклеточной коммуникационной сети и обычно встречаются во многих типах жидкостей организма². Нуклеиновые кислоты, заключенные внутри электромобилей, защищены от суровой среды в жидкостях организма, что обеспечивает более надежный способ изучения этих молекул в условиях жидкой биопсии.

В целом, уровни циркулирующих нуклеиновых кислот в жидких образцах биопсии очень низкие, и поэтому для обнаружения необходимы чувствительные методы, такие как цифровая ПЦР или секвенирование следующего поколения (NGS). Преаналитическое управление образцом имеет решающее значение для предотвращения лизиса клеток крови и высвобождения интактной ДНК, вызывая загрязнение cfDNA геномной ДНК. Кроме того, при извлечении образцов необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать присутствия ингибиторов ферментных методов анализа.

Здесь мы представляем стандартизированный метод сбора и хранения образцов плазмы и сыворотки, который является важным первым шагом для последующих применений на основе жидкой биопсии, включая анализ циркулирующих нуклеиновых кислот.

протокол

Предварительное этическое одобрение было получено от участвующих центров перед извлечением образцов крови. Следующие протоколы выделения сыворотки и плазмы были выполнены в соответствии с этическими принципами биомедицинских исследований.

ПРИМЕЧАНИЕ: Предыдущие соображения перед началом протокола приведены здесь. Для использования образцов человека в биомедицинских исследованиях требуется предварительное этическое одобрение с соответствующего информированного согласия. Для обработки образцов крови требуется шкаф биобезопасности класса II. Лабораторное пальто, защитные перчатки и очки следует носить на протяжении всей процедуры, чтобы избежать заражения патогенами, передающимися через кровь. Минимум 30 минут требуется для обработки образцов сыворотки. После забора крови в пробирках без антикоагулянта выдерживают при комнатной температуре (РТ) в течение 30-45 мин, чтобы обеспечить образование сгустков. Для плазменной подготовки требуется не менее 40 мин, и образцы должны быть обработаны в течение 4 ч с момента экстракции при использовании пробирок этилендиаминовой тетра-уксусной кислоты (ЭДТА) или в течение 24-48 ч, если используются клеточные стабилизирующие трубки для сбора или специфические бесклеточные трубки для сбора ДНК. Однако, по мнению некоторых производителей, образцы стабильны до 2 недель в этих специализированных трубках. Важно проверить на гемолиз, который придаст плазме или сывороточной фракции красноватый вид. См. раздел устранения неполадок для гемолизованных образцов в обсуждении.

1. Подготовка сыворотки для исследований жидкой биопсии

ПРИМЕЧАНИЕ: Общее время, необходимое для выполнения этого шага, составляет 30 минут (рисунок 1).

1. Извлекают 4-10 мл крови в пробирках, не содержащих антикоагулянта (красный или красный/серо-черный колпачок), и выдерживают при РТ в течение 30-45 мин. Обработайте эти образцы в течение 4 часов с момента извлечения.
2. Запишите время и дату извлечения образца и идентификацию субъекта (ID) в надлежащим образом разработанной базе данных образцов.
3. Надев лабораторный халат, защитные перчатки и очки, центрифугируйте трубку, содержащую свежую кровь при РТ (15 °C-25 °C) в течение 10 мин при 1 600 (± 150) х г, с максимальным перерывом.
4. После центрифугирования осторожно извлеките трубку из центрифуги; верхняя фаза сывороточного супернатанта будет казаться прозрачной и желтоватой (рисунок 2). Проверьте, есть ли в образце признаки гемолиза (рисунок 3) и запишите наличие гемолиза, когда это необходимо.
5. В шкафу биобезопасности класса II перенесите сыворотку в пульверы в виде 250 мкл аликвот.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Объем аликвот должен быть скорректирован в соответствии с требованиями исследования.
6. Немедленно заморозьте сыворотку в вертикальном положении в ящике для хранения при -80 °C и запишите время хранения образца.
7. Убедитесь, что образцы были обработаны в течение требуемых 4 часов.

2. Препарат плазмы для исследований жидкой биопсии

ПРИМЕЧАНИЕ: Общее время, необходимое для выполнения этого шага, составляет 40 минут (рисунок 4).

1. Экстракт 4-10 мл крови в пробирках, содержащих этилендиамин тетра-уксусную кислоту (ЭДТА). Обрабатывайте образцы в течение 4 ч с момента извлечения.
2. Запишите время и дату извлечения образца и идентификатор субъекта в надлежащим образом спроектированной базе данных образцов.
3. Надев лабораторный халат, защитные перчатки и очки, центрифугируйте трубку ЭДТА при RT (15 °C-25 °C) в течение 10 мин при 1 600 (± 150) х г, с максимальным перерывом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к инструкциям производителя при использовании других сборных трубок.
4. После центрифугирования супернатант плазмы будет казаться прозрачным и желтоватым. Проверьте, есть ли в образце признаки гемолиза (рисунок 3), и перенесите плазму (надводный материал) в центрифужную трубку объемом 15 мл, не нарушая клеточный слой, используя одноразовую серологическую пипетку (или одноразовую ламповую пипетку или пипетки p1000 с фильтрующим наконечником). Оставьте небольшой остаточный объем плазмы над клеточным слоем (примерно 5 мм).
5. Если наблюдается гемолиз, выбросьте образец для дальнейших анализов. (Рисунок 5). См. раздел устранение неполадок в обсуждении, чтобы оценить гемолиз.
6. Центрифугировать плазму в 15 мл центрифужной трубки при РТ (15 °C-25 °C) в течение 10-20 мин при 3000 (±150) х г. Выполните этот шаг, чтобы удалить любые остаточные неповрежденные клетки крови, перенесенные с первого этапа центрифугирования.
7. После центрифугирования осторожно извлеките трубку из центрифуги и переведите 1-4 мл плазмы в 1-4 мл полипропиленовых криогенных флаконов с помощью одноразовой серологической пипетки (или одноразовой ламповой пипетки или пипетки p1000 с фильтрующим наконечником). Остаточный объем плазмы (приблизительно 0,3 мл или высота 7 мм) должен быть оставлен на дне трубки, чтобы избежать загрязнения плазмы клетками крови (рисунок 5).
8. Немедленно заморозьте плазму в вертикальном положении в ящике для хранения при -80 °C и запишите время хранения образца. Убедитесь, что образцы были обработаны в течение требуемых 4 часов.
9. Соберите клеточный слой (пушистый слой) с помощью P1000 и отфильтрованного наконечника и переложите его в трубку объемом 2 мл. Немедленно заморозить и хранить при -80 °C.

Результаты

После центрифугирования пробирок крови без антикоагулянта верхняя фаза выглядит бледно-желтой и соответствует сывороточной фракции (рисунок 2). Эта фракция тщательно удаляется и аликвотируется для последующего анализа.

Гемолиз может присутствовать как...

Обсуждение

Жидкая биопсия имеет множество потенциальных применений в разное время во время лечения рака. Во-первых, при постановке диагноза идентифицировать молекулярные маркеры опухоли, которые бы предполагали наличие потенциального опухолевого поражения, которое может быть дополнительно ис?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Eppendorf tubes	Eppendorf	0030 120.086	Any standard tubes/equipment can be used
10 mL serological disposable pipettes	BIOFIL	GSP010010	Any standard tubes/equipment can be used
10 mL Vacutainer K2 EDTA tube	Becton Dickinson	367525	These tubes can be used for plasma collection
15 mL polypropylene centrifuge tubes	BIOFIL	CFT411150	Any standard tubes/equipment can be used
3.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant	Becton Dickinson	368965	Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection
4 mL polypropylene cryogenic vial, round bottom, self-standing	Corning	430662	Any standard tubes/equipment can be used
4 mL Vacutainer K2 EDTA tube	Becton Dickinson	367864	These tubes can be used for plasma collection
4200 TapeStation System	Agilent	G2991BA	Several quantification methods are available with a  specific application for cfDNA
5 mL serological disposable pipettes	BIOFIL	GSP010005	Any standard tubes/equipment can be used
8.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant	Becton Dickinson	366468	Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection
Centrifuge, capable of ~3000 x g with a swing bucket rotor	Thermo Fisher Scientific	Sorvall ST 16  10688725	Any standard tubes/equipment can be used
Freezer storage boxes for 1–4 mLcryogenic vials	Corning	431120	These boxes are needed when using 4 mL vials for storage
p1000 pipette tips	CORNING	4809	Any standard tubes/equipment can be used
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit	Qiagen	55114	Any commercially available kit that is specific for cfDNA isolation can be used with this blood prcessing protocol.
Streck Cell-Free DNA BCT CE tubes 10 mL	Streck	218997	These tubes can be used for plasma collection
Temperature Freezer (-80 °C)	ESCO	2180104	Any standard tubes/equipment can be used