Explorando las mutaciones de caspasa y la modificación postraduccional mediante enfoques de modelado molecular

Resumen

El presente protocolo utiliza un paquete de simulación biomolecular y describe el enfoque de dinámica molecular (DM) para modelar la caspasa de tipo salvaje y sus formas mutantes. El método MD permite evaluar la evolución dinámica de la estructura de la caspasa y el efecto potencial de mutaciones o modificaciones postraduccionales.

Resumen

La apoptosis es un tipo de muerte celular programada que elimina las células dañadas y controla el desarrollo y la homeostasis tisular de los organismos multicelulares. Las caspasas, una familia de proteasas de cisteína, juegan un papel clave en el inicio y ejecución de la apoptosis. La maduración de las caspasas y su actividad se ajusta mediante modificaciones postraduccionales de una manera altamente dinámica. Para evaluar el efecto de los cambios postraduccionales, los sitios potenciales se mutan rutinariamente con residuos persistentes a cualquier modificación. Por ejemplo, el residuo de serina se reemplaza con alanina o ácido aspártico. Sin embargo, tales sustituciones podrían alterar la conformación del sitio activo de la caspasa, lo que provocaría alteraciones en la actividad catalítica y las funciones celulares. Además, las mutaciones de otros residuos de aminoácidos localizados en posiciones críticas también podrían romper la estructura y las funciones de las caspasas y provocar perturbaciones en la apoptosis. Para evitar las dificultades de emplear residuos mutados, los enfoques de modelado molecular se pueden aplicar fácilmente para estimar el efecto potencial de las sustituciones de aminoácidos en la estructura de la caspasa. El presente protocolo permite el modelado tanto de la caspasa de tipo salvaje como de sus formas mutantes con el paquete de simulación biomolecular (Amber) y las instalaciones de supercomputadora para probar el efecto de las mutaciones en la estructura y función de la proteína.

Introducción

La apoptosis es uno de los procesos celulares más estudiados que regulan la morfogénesis y la homeostasis tisular de los organismos multicelulares. La apoptosis puede ser iniciada por una amplia gama de estímulos externos o internos, como la activación de los receptores de muerte, la alteración en las señales del ciclo celular, el daño del ADN, el estrés del retículo endoplásmico (RE) y diversas infecciones bacterianas y virales¹. Las caspasas - actores apoptóticos clave - se clasifican convencionalmente en dos grupos: iniciadores (caspasa-2, caspasa-8, caspasa-9 y caspasa-10) y efectores (caspasa-3, caspasa-6 y caspasa-7), dependiendo de su estructura de dominio y el lugar en la cascada de caspasas ^2,3. Tras las señales de muerte celular, las caspasas iniciadoras interactúan con moléculas adaptadoras que facilitan la dimerización inducida por proximidad y el autoprocesamiento para formar una enzima activa. Las caspasas efectoras se activan a través de la escisión mediante caspasas iniciadoras y realizan pasos de ejecución aguas abajo al dividir múltiples sustratos celulares⁴.

La maduración y la función de las caspasas iniciadoras y efectoras están reguladas por un gran número de mecanismos intracelulares diferentes, entre los cuales la modificación post-traduccional juega un papel indispensable en la modulación de la muerte celular⁵. La adición de grupos modificadores (fosforilación, nitrosilación, metilación o acetilación) o proteínas (ubiquitinación o SUMOilación) cambia la actividad enzimática de las caspasas o la conformación y estabilidad de proteínas que regulan la apoptosis. La mutagénesis dirigida al sitio se aplica ampliamente para investigar los posibles sitios de modificación postraduccional y discernir su papel. Un sitio de modificación putativo generalmente se reemplaza por otro aminoácido, que no se puede modificar más. Por lo tanto, la serina y la treonina potencialmente fosforiladas se mutan a alanina, y los sitios de ubiquitinación de lisina se reemplazan con arginina. Otra estrategia incluye la sustitución de un aminoácido que imita particularmente la modificación postraduccional (por ejemplo, el glutamato y el aspartato se han utilizado para imitar la serina fosforilada o la treonina)⁶. Sin embargo, algunas de estas sustituciones localizadas en las altas proximidades de un sitio activo o en posiciones críticas podrían cambiar la estructura de la caspasa, perturbar la actividad catalítica y suprimir la muerte celular apoptótica⁷. Se pudieron observar efectos similares en casos de mutaciones sin sentido asociadas a tumores en genes de caspasa. Por ejemplo, la mutación asociada al tumor de la caspasa-6 - R259H - resultó en cambios conformacionales de bucles en el bolsillo de unión al sustrato, reduciendo el recambio catalítico eficiente de los sustratos⁸. La sustitución de aminoácidos G325A en la caspasa-8 identificada en el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello podría obstaculizar la actividad de la caspasa-8, lo que condujo a la modulación de la señalización del factor nuclear kB (NF-kB) y promovió la tumorigénesis⁹.

Para evaluar el efecto potencial de las sustituciones de aminoácidos en la estructura y función de la caspasa, se puede aplicar el modelado molecular. El enfoque de dinámica molecular (MD) se describe en este trabajo para modelar la caspasa de tipo salvaje y sus formas mutantes utilizando el paquete de simulación biomolecular (Amber). El método MD ofrece una visión de la evolución dinámica de la estructura de la proteína tras la introducción de mutaciones. Originalmente desarrollado por el grupo de Peter Kollman, el paquete Amber se convirtió en una de las herramientas de software más populares para simulaciones biomoleculares^10,11,12,13. Este software se divide en dos partes: (1) AmberTools, una colección de programas utilizados rutinariamente para la preparación del sistema (asignación de tipo átomo, adición de hidrógenos y moléculas de agua explícita, etc.) y análisis de trayectoria; y (2) Amber, que se centra en el programa de simulación pemdd. AmberTools es un paquete gratuito (y un requisito previo para instalar Amber), mientras que Amber se distribuye con una licencia separada y una estructura de tarifas. Las simulaciones paralelas en un superordenador y/o utilizando unidades de procesamiento gráfico (GPU) pueden mejorar sustancialmente el rendimiento para la investigación científica de la dinámica de la estructura de proteínas¹⁴. Las últimas versiones de software disponibles son AmberTools21 y Amber20, pero los protocolos descritos también se pueden utilizar con las versiones anteriores.

Protocolo

1. Preparación del sistema

NOTA: Los modelos moleculares de las formas proteicas nativas y mutantes se construyen en base a una estructura cristalina apropiada obtenida del Banco de Datos de Proteínas^15,16.

1. Para recuperar la estructura PDB seleccionada, utilice la lista desplegable Descargar archivos y haga clic en Formato PDB. Elimine los comentarios y los datos de conectividad, e inserte una tarjeta TER entre cadenas de proteínas separadas en el archivo PDB. Opcionalmente, establezca el estado de protonación de los residuos de histidina reemplazando el nombre del residuo HIS por HIE, HID o HIP (Archivo complementario 1).
   NOTA: Es razonable no eliminar moléculas de agua resueltas cristalográficamente (si están presentes en el archivo PDB).
2. Para preparar el modelo inicial, inicie el programa tleap (paquete AmberTools) y, a continuación, escriba comandos que manipulen objetos tleap .
   1. Inicie el programa: tleap. Cargue el campo de fuerza ff14SB para describir la proteína con mecánica molecular: > fuente leaprc.protein.ff14SB.
   2. Campos de fuerza de carga para moléculas de agua e iones atómicos (Na⁺, Cl^-): > fuente leaprc.water.tip3p.
   3. Cargue el archivo PDB y cree coordenadas para hidrógenos, creando un objeto llamado mol: > mol = proteína loadpdb.pdb.
   4. Compruebe si hay inconsistencias internas que puedan causar problemas: > compruebe mol.
      NOTA: Los puentes disulfuro, si están presentes, deben especificarse manualmente. Reemplace los nombres de las cisteínas unidas covalentemente CYS por CYX y escriba el siguiente comando en tleap para crear un enlace entre átomos SG: enlace mol.X.SG mol.Y.SG (X e Y son números de residuos de cisteína).
   5. Cree una caja de disolvente alrededor de la proteína (agua TIP3P, 12 Å de distancia): > solvatebox mol TIP3PBOX 12.0.
   6. Verifique la carga total: > mol de carga y agregue contraiones (Na⁺ o Cl^-) para neutralizar el sistema:
      > adiciones mol Na⁺ 0.
   7. Cree el archivo prmtop de topología y el archivo inpcrd de coordenadas (entradas para ejecutar una simulación): > saveamberparm mol protein.prmtop protein.inpcrd. Salga del programa tleap: > renuncie.
      NOTA: Los archivos de coordenadas en formato ámbar se pueden convertir fácilmente al formato PDB utilizando la herramienta ambpdb (consulte el Manual del usuario, consulte la Tabla de materiales).

2. Minimización de energía

NOTA: La minimización de energía es necesaria para eliminar cualquier contacto defectuoso y superposición entre átomos en el sistema de arranque que conducen a la inestabilidad cuando se ejecuta MD.

1. Llevar a cabo la primera etapa de la minimización de energía (2.500 pasos del algoritmo de descenso más pronunciado + 2.500 pasos del algoritmo de gradiente conjugado) para optimizar las posiciones de los átomos de hidrógeno añadidos y las moléculas de agua manteniendo las coordenadas de las proteínas fijadas por restricciones posicionales en átomos pesados.
   1. Ejecute el programa pmemd de la siguiente manera:
      pmemd -O -i min1.in -p protein.prmtop -c protein.inpcrd -o protein_min1.out
      -r protein_min1.rst -ref protein.inpcrd.
   2. Siga los argumentos requeridos: -i Datos de control FILE; -p ARCHIVO topología molecular, parámetros de campo de fuerza, nombres de átomos; -c ARCHIVO coordenadas iniciales; -o ARCHIVO de salida de registro legible por el usuario; -r ARCHIVO coordenadas finales; -ref ARCHIVO coordenadas de referencia para sujeciones de posición.
   3. Especifique las opciones en el archivo de entrada min1.in:
      &cntrl
      imin=1, maxcyc=5000, ncyc=2500,
      corte = 10.0, ntb = 1,
      ntc=1, ntf=1,
      ntpr=10,
      ntr=1,
      restraintmask=':1-517 & !@H=',
      restraint_wt=2,0
      /
      NOTA: Opciones de entrada: imin=1 realizar minimización; maxcyc=5000 número máximo de ciclos de minimización; El método de minimización NCYC=2500 se cambia de descenso más pronunciado a gradiente conjugado después de ciclos NCYC ; cut=10,0 corte no vinculado (Å); NTB=1 se imponen límites periódicos, volumen constante; NTC=1 no se aplican restricciones a las longitudes de enlace (para una mejor convergencia energética); NTF=1 Se calculan todas las interacciones; NTPR=10 La información energética se imprime en el archivo de salida cada paso de NTPR ; ntr=1 indicador para restringir átomos especificados utilizando un potencial armónico; restraintmask=':1-517 & !@H=' especifica átomos restringidos; restraint_wt=2,0 de peso (kcal/mol∙Ų) para las restricciones posicionales.
2. Llevar a cabo la segunda etapa de la minimización de energía (5.000 pasos de descenso más pronunciados + 5.000 pasos de gradiente conjugado) sin restricciones para optimizar todo el sistema.
   1. Utilice min2.in y protein_min1.rst como entradas: pmemd -O -i min2.in -p protein.prmtop
      -c protein_min1.rst -o protein_min2.out -r protein_min2.rst.
   2. Especifique las opciones en el min2.in del archivo de entrada:
      &cntrl
      imin=1, maxcyc=10000, ncyc=5000,
      corte = 10.0, ntb = 1,
      ntc=1, ntf=1,
      NTPR=10
      /

3. Calefacción

NOTA: Esta etapa tiene como objetivo calentar el sistema de 0 K a 300 K. Las velocidades iniciales se asignan a los átomos ya que el modelo inicial basado en el archivo PDB no contiene información de velocidad.

1. Llevar a cabo el proceso de calentamiento con restricciones posicionales en los átomos de proteína (50 ps, volumen constante).
   1. Utilice heat.in y protein_min2.rst como entradas: pmemd -O -i heat.in -p protein.prmtop
      -c protein_min2.rst -o protein_heat.out
      -r protein_heat.rst -x protein_heat.mdcrd -ref protein_min2.rst
   2. Siga los argumentos requeridos: -x FILE conjuntos de coordenadas guardados sobre la trayectoria MD.
   3. Especifique las opciones en el archivo de entrada heat.in:
      &cntrl
      imin=0, irest=0, ntx=1,
      nstlim=25000, dt=0,002,
      ntc=2, ntf=2,
      corte = 10.0, ntb = 1,
      ntpr=500, ntwx=500,
      NTT=3, gamma_ln=2.0,
      tempi=0.0, temp0=300.0,
      ntr=1, restraintmask=':1-517',
      restraint_wt=1,0,
      nmropt=1
      /
      &wt TYPE='TEMP0',
      istep1=0, istep2=25000,
      valor1=0,1, valor2=300,0 /
      &wt TYPE='END' /
      NOTA: Opciones de entrada: imin=0 run MD; irest=0 ejecutar una nueva simulación; ntx=1 no se leen velocidades iniciales del archivo rst ; nstlim=25000 número de pasos de MD; DT=0,002 paso de tiempo (ps); ntc=2 enlaces que involucran hidrógeno están restringidos usando el algoritmo SHAKE; NTF=2 fuerzas para los enlaces restringidos no se calculan; NTWX=500 coordenadas se escriben en el archivo MDCRD cada paso NTWX ; NTT=3 Regulación de la temperatura de Langevin; gamma_ln=2,0 frecuencia de colisión para la dinámica de Langevin (ps⁻¹); tempi=0,0 temperatura inicial; temp0=300.0 temperatura de referencia; Se leen los parámetros nmropt=1 especificados en una lista de nombres &wt ; TYPE='TEMP0' varía la temperatura objetivo.

4. Equilibrio

NOTA: Esta etapa es necesaria para ajustar la densidad del agua y obtener el estado de equilibrio de la proteína.

1. Realice el equilibrio a 300 K sin restricciones (500 ps, presión constante).
   1. Utilice equil.in y protein_heat.rst como entradas: pmemd -O -i equil.in -p protein.prmtop
      -c protein_heat.rst -o protein_equil.out -r protein_equil.rst -x protein_equil.mdcrd.
   2. Especifique las opciones en el equil.in del archivo de entrada:
      &cntrl
      imin=0, irest=1, ntx=5,
      nstlim=250000,
      dt=0,002,
      ntc=2, ntf=2,
      corte = 10.0, ntb = 2, ntp = 1, taup = 2.0,
      ntpr=1000, ntwx=1000, ntwr=50000,
      NTT=3, gamma_ln=2.0,
      temp0=300.0
      /
      NOTA: Opciones de entrada: irest=1 reiniciar la simulación; Las coordenadas y velocidades ntx=5 se leen de un archivo RST generado previamente; NTB=2 se imponen límites periódicos, presión constante; ntp=1 escala de presión isotrópica; TAUP=2,0 Tiempo de relajación de la presión (PS); ntwr=50000 Cada paso NTWR , se escribe el archivo RST , lo que garantiza la recuperación de un bloqueo.

5. Dinámica de producción

1. Después de que se haya logrado con éxito el equilibrio, realice una simulación MD de producción (10 ns o más) a presión constante y genere el archivo de trayectoria para el posterior análisis de la estructura de la proteína.
   1. Utilice prod.in y protein_equil.rst como entradas: pmemd -O -i prod.in -p protein.prmtop
      -c protein_equil.rst -o protein_prod.out -r protein_prod.rst -x protein_prod.mdcrd.
   2. Especifique las opciones en el archivo de entrada prod.in:
      &cntrl
      imin=0, irest=1, ntx=5,
      nstlim=5000000,
      dt=0,002,
      ntc=2, ntf=2,
      corte = 10.0, ntb = 2, ntp = 1, taup = 2.0,
      ntpr=1000, ntwx=1000, ntwr=50000,
      NTT=3, gamma_ln=2.0,
      temp0=300.0, ig=-1
      /
      NOTA: La versión paralela de pmemd (pmemd. MPI) o versión acelerada por GPU (pmemd.cuda) se puede usar en clústeres de computadoras y supercomputadoras. Una simulación MD larga puede dividirse en varios segmentos y realizarse secuencialmente. Se recomienda encarecidamente establecer ig=-1 (opción de semilla aleatoria) para cada reinicio de simulación. Los programas ptraj o cppptraj se pueden utilizar para el análisis y procesamiento de trayectorias de coordenadas. Para obtener más información, consulte el Manual del usuario del software.

Resultados

El presente protocolo se puede aplicar fácilmente en estudios de modificación postraduccional de caspasas o mutaciones patogénicas. En esta sección, se ilustra el flujo de trabajo de modelado MD (Figura 1), que se ha utilizado con éxito en el estudio de la caspasa-2⁷. Utilizando mutagénesis in vitro dirigida al sitio de sitios potenciales de fosforilación (Ser/Thr a Ala) y enfoques bioquímicos, se demostró que la mutación Ser384Ala impidió el proce...

Discusión

El enfoque MD descrito permite modelar tanto las formas de caspasa de tipo salvaje como mutantes utilizando los paquetes de simulación biomolecular. Aquí se discuten varias cuestiones importantes de la metodología. Primero, se debe seleccionar una estructura cristalina representativa de caspasa del Banco de Datos de Proteínas. Es importante destacar que tanto las formas monoméricas como las diméricas de caspasa son aceptables. Elegir estructuras de alta resolución con un número mínimo de residuos faltantes es un...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amber20	University of California, San Francisco		Software for molecular dynamics simulation http://ambermd.org
AmberTools21	University of California, San Francisco		Software for molecular modeling and analysis http://ambermd.org