JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Настоящий протокол использует пакет биомолекулярного моделирования и описывает подход молекулярной динамики (MD) для моделирования каспазы дикого типа и ее мутантных форм. Метод MD позволяет оценить динамическую эволюцию структуры каспазы и потенциальный эффект мутаций или посттрансляционных модификаций.

Аннотация

Апоптоз — это тип запрограммированной гибели клеток, который устраняет поврежденные клетки и контролирует развитие и тканевой гомеостаз многоклеточных организмов. Caspases, семейство цистеиновых протеаз, играют ключевую роль в инициировании и выполнении апоптоза. Созревание каспаз и их активность тонко настраиваются посттрансляционными модификациями весьма динамичным образом. Чтобы оценить влияние посттрансляционных изменений, потенциальные участки обычно мутируют с остатками, устойчивыми к любым модификациям. Например, остаток серина заменяют аланином или аспарагиновой кислотой. Однако такие замены могут изменить конформацию активного центра каспазы, что приводит к нарушениям каталитической активности и клеточных функций. Более того, мутации других аминокислотных остатков, расположенных в критических положениях, также могут нарушать структуру и функции каспаз и приводить к возмущению апоптоза. Чтобы избежать трудностей с использованием мутировавших остатков, подходы молекулярного моделирования могут быть легко применены для оценки потенциального влияния замен аминокислот на структуру каспазы. Настоящий протокол позволяет моделировать как каспазу дикого типа, так и ее мутантные формы с помощью пакета биомолекулярного моделирования (Amber) и суперкомпьютерных средств для проверки влияния мутаций на структуру и функцию белка.

Введение

Апоптоз является одним из наиболее широко изученных клеточных процессов, регулирующих морфогенез и тканевый гомеостаз многоклеточных организмов. Апоптоз может быть инициирован широким спектром внешних или внутренних стимулов, таких как активация рецепторов смерти, нарушение сигналов клеточного цикла, повреждение ДНК, стресс эндоплазматического ретикулума (ER) и различные бактериальные и вирусные инфекции1. Каспазы - ключевые апоптотические игроки - условно классифицируются на две группы: инициаторы (каспаза-2, каспаза-8, каспаза-9 и каспаза-10) и эффекторы (каспаза-3, каспаза-6 и каспаза-7), в зависимости от их доменной структуры и места в каскаде каспазы 2,3. По сигналам гибели клеток инициаторы каспазы взаимодействуют с молекулами-адапторами, которые облегчают димеризацию и автообработку, индуцированную близостью, с образованием активного фермента. Эффекторные каспазы активируются путем расщепления инициаторными каспазами и выполняют последующие этапы выполнения путем расщепления нескольких клеточных субстратов4.

Созревание и функция инициатора и эффекторной каспаз регулируются большим количеством различных внутриклеточных механизмов, среди которых посттрансляционная модификация играет незаменимую роль в модуляции гибели клеток5. Добавление модифицирующих групп (фосфорилирование, нитрозилирование, метилирование или ацетилирование) или белков (убиквитинирование или SUMOylation) изменяет ферментативную активность каспаз или конформацию и стабильность белка, которые регулируют апоптоз. Мутагенез, направленный на сайт, широко применяется для исследования потенциальных посттрансляционных модификационных сайтов и определения их роли. Предполагаемый сайт модификации обычно заменяется другой аминокислотой, которая не может быть дополнительно модифицирована. Таким образом, потенциально фосфорилированные серин и треонин мутируют в аланин, а места убиквитинирования лизина заменяются аргинином. Другая стратегия включает замену аминокислоты, которая особенно имитирует посттрансляционную модификацию (например, глутамат и аспартат использовались для имитации фосфорилированного серина или треонина)6. Однако некоторые из этих замен, расположенных в непосредственной близости от активного сайта или в критических положениях, могут изменять структуру каспазы, нарушать каталитическую активность и подавлять апоптотическую гибель клеток7. Аналогичные эффекты могут наблюдаться в случаях опухолеассоциированных мутаций в генах каспазы. Например, опухолеассоциированная мутация каспазы-6 - R259H - привела к конформационным изменениям петель в субстрат-связывающем кармане, уменьшая эффективный каталитический оборот субстратов8. Замена аминокислот G325A в каспазе-8, идентифицированная при плоскоклеточном раке головы и шеи, могла препятствовать активности каспазы-8, что приводило к модуляции передачи сигналов ядерного фактора kB (NF-kB) и способствовало опухолевому генезу9.

Для оценки потенциального влияния аминокислотных замен на структуру и функцию каспазы может быть применено молекулярное моделирование. Подход молекулярной динамики (MD) описан в этой работе для моделирования каспазы дикого типа и ее мутантных форм с использованием биомолекулярного пакета моделирования (Amber). Метод MD дает представление о динамической эволюции структуры белка после введения мутаций. Первоначально разработанный группой Питера Коллмана, пакет Amber стал одним из самых популярных программных инструментов для биомолекулярного моделирования 10,11,12,13. Это программное обеспечение разделено на две части: (1) AmberTools, набор программ, обычно используемых для подготовки системы (присвоение типа атома, добавление водорода и молекул эксплицитной воды и т. Д.) И анализа траектории; и (2) Янтарь, который сосредоточен вокруг программы моделирования pmemd. AmberTools является бесплатным пакетом (и обязательным условием для установки самого Amber), в то время как Amber распространяется с отдельной структурой лицензий и сборов. Параллельное моделирование на суперкомпьютере и/или с использованием графических процессоров (GPU) может существенно повысить производительность для научных исследований динамики структуры белка14. Последними доступными версиями программного обеспечения являются AmberTools21 и Amber20, но описанные протоколы также могут использоваться с предыдущими версиями.

протокол

1. Подготовка системы

ПРИМЕЧАНИЕ: Молекулярные модели нативных и мутантных белковых форм построены на основе соответствующей кристаллической структуры, полученной из Банка данных белка15,16.

  1. Чтобы получить выбранную структуру PDB, используйте раскрывающийся список Загрузить файлы и выберите Формат PDB. Удалите замечания и данные о подключении, а также вставьте карту TER между отдельными белковыми цепочками в файл PDB. Необязательно, установите состояние протонации остатков гистидина, заменив имя остатка HIS на HIE, HID или HIP (Дополнительный файл 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разумно не удалять кристаллографически разрешенные молекулы воды (если они присутствуют в файле PDB).
  2. Чтобы подготовить начальную модель, запустите программу tleap (пакет AmberTools) и введите команды, манипулирующие объектами tleap.
    1. Запустите программу: tleap. Загрузите силовое поле ff14SB для описания белка с молекулярной механикой: > источник leaprc.protein.ff14SB.
    2. Силовые поля нагрузки для молекул воды и атомных ионов (Na+, Cl-): > источника leaprc.water.tip3p.
    3. Загрузите PDB-файл и постройте координаты для водорода, создав объект с именем mol: > mol = loadpdb protein.pdb.
    4. Проверьте наличие внутренних несоответствий, которые могут вызвать проблемы: > проверьте моль.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дисульфидные мосты, если таковые имеются, должны быть указаны вручную. Замените названия ковалентно связанных цистеинов CYS на CYX и введите следующую команду в tleap , чтобы создать связь между атомами SG: mol.X.SG mol.Y.SG связи (X и Y — числа остатков цистеина).
    5. Создайте коробку растворителя вокруг белка (вода TIP3P, расстояние 12 Å): > сольватбокс моль TIP3PBOX 12.0.
    6. Проверьте общий заряд: > заряд моль и добавьте контрионы (Na+ или Cl-) для нейтрализации системы:
      > добавки моль Na+ 0.
    7. Создайте файл prmtop топологии и файл координат inpcrd (входные данные для выполнения моделирования): > saveamberparm mol protein.prmtop protein.inpcrd. Закройте программу tleap: > закройте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Файлы координат в янтарном формате могут быть легко преобразованы в формат PDB с помощью инструмента ambpdb (см. Руководство пользователя, см. Таблица материалов).

2. Минимизация энергопотребления

ПРИМЕЧАНИЕ: Минимизация энергии необходима для удаления любых плохих контактов и перекрытий между атомами в стартовой системе, которые приводят к нестабильности при запуске MD.

  1. Провести первый этап минимизации энергии (2 500 шагов алгоритма самого крутого спуска + 2 500 шагов алгоритма сопряженного градиента) для оптимизации положений добавленных атомов водорода и молекул воды при сохранении белковых координат, зафиксированных позиционными ограничениями на тяжелых атомах.
    1. Запустите программу pmemd следующим образом:
      pmemd -O -i min1.in -p protein.prmtop -c protein.inpcrd -o protein_min1.out
      -r protein_min1.rst -ref protein.inpcrd      .
    2. Следуйте требуемым аргументам: -i FILE управляющие данные; -p ФАЙЛ молекулярной топологии, параметры силового поля, названия атомов; -c Исходные координаты ФАЙЛА; -o ФАЙЛ считаемый пользователем вывод журнала; -r ФАЙЛ конечных координат; -ref FILE справочные координаты для позиционных ограничителей.
    3. Укажите параметры во входном файле min1.in:
      &cntrl
      imin=1, maxcyc=5000, ncyc=2500,
      cut=10.0, ntb=1,
      ntc=1, ntf=1,
      ntpr=10,
      ntr=1,
      restraintmask=':1-517 & !@H=',
      restraint_wt=2.0
      /
      ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры ввода: imin=1 выполняют минимизацию; maxcyc=5000 максимальное количество циклов минимизации; Метод минимизации ncyc=2500 переключается с самого крутого спуска на сопряженный градиент после циклов ncyc ; cut=10,0 несвязанное отсечение (Å); ntb=1 накладываются периодические границы, постоянный объем; ntc=1 к длинам связей не применяются ограничения (для лучшей конвергенции энергии); ntf=1 вычисляются все взаимодействия; ntpr=10 информация об энергии выводится в исходящий файл каждый шаг ntpr ; ntr=1 флаг для удержания заданных атомов с помощью гармонического потенциала; restraintmask=':1-517 & !@H=' указывает на ограниченные атомы; restraint_wt=вес 2,0 (ккал/моль∙Å2) для позиционных удерживающих устройств.
  2. Проведите второй этап минимизации энергии (5000 крутых ступеней спуска + 5000 сопряженных ступеней уклона) без ограничений для оптимизации всей системы.
    1. Используйте min2.in и protein_min1.rst в качестве входных данных: pmemd -O -i min2.in -p белок.prmtop
      -c protein_min1.rst -o protein_min2.out -r protein_min2.rst      .
    2. Укажите параметры во входном файле min2.in:
      &cntrl
      imin=1, maxcyc=10000, ncyc=5000,
      cut=10.0, ntb=1,
      ntc=1, ntf=1,
      ntpr=10
      /

3. Отопление

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап направлен на нагрев системы от 0 K до 300 K. Начальные скорости присваиваются атомам, поскольку начальная модель, основанная на файле PDB, не содержит информации о скорости.

  1. Осуществляют процесс нагрева с позиционными ограничениями на атомах белка (50 пс, постоянный объем).
    1. Используйте heat.in и protein_min2.rst в качестве входных данных: pmemd -O -i heat.in -p белок.prmtop
      -c protein_min2.rst -o protein_heat.out
      -r protein_heat.rst -x protein_heat.mdcrd -ref protein_min2.rst
    2. Следуйте обязательным аргументам: -x НАБОРЫ координат FILE, сохраненные по траектории MD.
    3. Укажите параметры во входном файле heat.in:
      &cntrl
      imin=0, irest=0, ntx=1,
      nstlim=25000, dt=0.002,
      ntc=2, ntf=2,
      cut=10.0, ntb=1,
      ntpr=500, ntwx=500,
      ntt=3, gamma_ln=2.0,
      tempi=0.0, temp0=300.0,
      ntr=1, сдерживающая маска=':1-517',
      restraint_wt=1.0,
      nmropt=1
      /
      &wt TYPE='TEMP0',
      istep1=0, istep2=25000,
      значение1=0.1, значение2=300.0 /
      &wt TYPE='END' /
      ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры ввода: imin=0 run MD; irest=0 запустите новую симуляцию; ntx=1 начальные скорости не считываются из файла rst ; nstlim=25000 количество шагов MD; dt=0,002 временного шага (ps); связи ntc=2 с участием водорода ограничены с помощью алгоритма SHAKE; ntf=2 силы для ограниченных связей не вычисляются; Координаты ntwx=500 записываются в файл mdcrd каждый шаг ntwx ; ntt=3 Регулирование температуры Ланжевена; частота столкновений gamma_ln=2,0 для динамики Ланжевена (ps−1); tempi=начальная температура 0,0 ; temp0=300.0 опорная температура; параметры nmropt=1 , указанные в списке имен &wt , считываются; TYPE='TEMP0' изменяет целевую температуру.

4. Уравновешивание

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап необходим для корректировки плотности воды и получения равновесного состояния белка.

  1. Выполняйте уравновешивание при 300 К без каких-либо ограничений (500 пс, постоянное давление).
    1. Используйте equil.in и protein_heat.rst в качестве входных данных: pmemd -O -i equil.in -p белок.prmtop
      -c protein_heat.rst -o protein_equil.out -r protein_equil.rst -x protein_equil.mdcrd      .
    2. Укажите параметры во входном файле equil.in:
      &cntrl
      imin=0, irest=1, ntx=5,
      nstlim=250000,
      dt=0.002,
      ntc=2, ntf=2,
      cut=10.0, ntb=2, ntp=1, taup=2.0,
      ntpr=1000, ntwx=1000, ntwr=50000,
      ntt=3, gamma_ln=2.0,
      temp0=300.0
      /
      ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры ввода: irest=1 перезапуск моделирования; координаты и скорости ntx=5 считываются из ранее сгенерированного rst-файла ; ntb=2 периодические границы, постоянное давление; ntp=1 изотропное масштабирование давления; taup=2.0 время релаксации давления (ps); ntwr=50000 каждые шаги ntwr , rst файл записывается, обеспечивая восстановление после сбоя.

5. Динамика производства

  1. После того, как равновесие успешно достигнуто, проводят производственное моделирование MD (10 нс или более) при постоянном давлении и генерируют файл траектории для последующего анализа структуры белка.
    1. Используйте prod.in и protein_equil.rst в качестве входных данных: pmemd -O -i prod.in -p белок.prmtop
      -c protein_equil.rst -o protein_prod.out -r protein_prod.rst -x protein_prod.mdcrd      .
    2. Укажите параметры во входном файле prod.in:
      &cntrl
      imin=0, irest=1, ntx=5,
      nstlim=5000000,
      dt=0.002,
      ntc=2, ntf=2,
      cut=10.0, ntb=2, ntp=1, taup=2.0,
      ntpr=1000, ntwx=1000, ntwr=50000,
      ntt=3, gamma_ln=2.0,
      temp0=300.0, ig=-1
      /
      ПРИМЕЧАНИЕ: Параллельная версия pmemd (pmemd. MPI) или gpu-ускоренная версия (pmemd.cuda) может использоваться на компьютерных кластерах и суперкомпьютерах. Длинное моделирование MD может быть разбито на несколько сегментов и выполнено последовательно. Настоятельно рекомендуется устанавливать ig=-1 (опция случайного начального значения) для каждого перезапуска моделирования. Программы ptraj или cppptraj могут использоваться для анализа и обработки координатных траекторий. Дополнительные сведения см. в Руководстве пользователя программного обеспечения.

Результаты

Настоящий протокол может быть легко применен в исследованиях посттрансляционной модификации каспаз или патогенных мутаций. В этом разделе проиллюстрирован рабочий процесс моделирования MD (рисунок 1), который был успешно использован при исследовании каспазы-2

Обсуждение

Описанный подход MD позволяет моделировать как дикие, так и мутантные формы каспазы с использованием биомолекулярных пакетов моделирования. Здесь обсуждается несколько важных вопросов методологии. Во-первых, репрезентативная кристаллическая структура каспазы должна быть выбрана из ?...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом Российского научного фонда (17-75-20102, разработка протокола). Эксперименты, описанные в разделе репрезентативных результатов (анализ фосфорилирования), были поддержаны Стокгольмским (181301) и Шведским (190345) онкологическими обществами.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Amber20University of California, San FranciscoSoftware for molecular dynamics simulation
http://ambermd.org
AmberTools21University of California, San FranciscoSoftware for molecular modeling and analysis
http://ambermd.org

Ссылки

  1. Olsson, M., Zhivotovsky, B. Caspases and cancer. Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1441-1449 (2011).
  2. Lavrik, I. N., Golks, A., Krammer, P. H. Caspase: Pharmacological manipulation of cell death. Journal of Clinical Investigation. 115 (10), 2665-2672 (2005).
  3. Degterev, A., Boyce, M., Yuan, J. A decade of caspases. Oncogene. 22 (53), 8543-8567 (2003).
  4. Pop, C., Salvesen, G. S. Human caspases: Activation, specificity, and regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (33), 21777-21781 (2009).
  5. Zamaraev, A. V., Kopeina, G. S., Prokhorova, E. A., Zhivotovsky, B., Lavrik, I. N. Post-translational modification of caspases: The other side of apoptosis regulation. Trends in Cell Biology. 27 (5), 322-339 (2017).
  6. Pearlman, S. M., Serber, Z., Ferrell, J. E. A mechanism for the evolution of phosphorylation sites. Cell. 147 (4), 934-946 (2011).
  7. Zamaraev, A. V., et al. Requirement for Serine-384 in Caspase-2 processing and activity. Cell Death and Disease. 11 (10), 825 (2020).
  8. Dagbay, K. B., Hill, M. E., Barrett, E., Hardy, J. A. Tumor-associated mutations in caspase-6 negatively impact catalytic efficiency. Biochemistry. 56 (34), 4568-4577 (2017).
  9. Ando, M., et al. Cancer-associated missense mutations of caspase-8 activate nuclear factor-κB signaling. Cancer Science. 104 (8), 1002-1008 (2013).
  10. Case, D. A., et al. . AMBER 2020. , (2020).
  11. Salomon-Ferrer, R., Case, D. A., Walker, R. C. An overview of the Amber biomolecular simulation package. WIREs Computational Molecular Science. 3 (2), 198-210 (2013).
  12. Roe, D. R., Cheatham, T. E. PTRAJ and CPPTRAJ: Software for processing and analysis of molecular dynamics trajectory data. Journal of Chemical Theory and Computation. 9 (7), 3084-3095 (2013).
  13. Maier, J. A., et al. ff14SB: Improving the accuracy of protein side chain and backbone parameters from ff99SB. Journal of Chemical Theory and Computation. 11 (8), 3696-3713 (2015).
  14. Salomon-Ferrer, R., Götz, A. W., Poole, D., Le Grand, S., Walker, R. C. Routine microsecond molecular dynamics simulations with AMBER on GPUs. 2. Explicit solvent particle mesh ewald. Journal of Chemical Theory and Computation. 9 (9), 3878-3888 (2013).
  15. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
  16. Burley, S. K., et al. RCSB Protein Data Bank: Powerful new tools for exploring 3D structures of biological macromolecules for basic and applied research and education in fundamental biology, biomedicine, biotechnology, bioengineering and energy sciences. Nucleic Acids Research. 49, 437-451 (2021).
  17. Martinez, X., et al. Molecular graphics: Bridging structural biologists and computer scientists. Structure. 27 (11), 1617-1623 (2019).
  18. Lee, T. S., et al. GPU-accelerated molecular dynamics and free energy methods in Amber18: Performance enhancements and new features. Journal of Chemical Information and Modeling. 58 (10), 2043-2050 (2018).
  19. Jäger, R., Zwacka, R. M. The enigmatic roles of caspases in tumor development. Cancers. 2 (4), 1952-1979 (2010).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

188

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены