Macro Imager de vida útil de fluorescencia para aplicaciones biomédicas

Resumen

Este artículo describe el uso de un nuevo y rápido generador de imágenes ópticas para la obtención de imágenes macroscópicas de la vida útil de la fotoluminiscencia de muestras que emiten descomposición larga. Se describen los procedimientos de integración, adquisición de imágenes y análisis, junto con la preparación y caracterización de los materiales del sensor para la obtención de imágenes y la aplicación del generador de imágenes en el estudio de muestras biológicas.

Resumen

Este artículo presenta un nuevo generador de imágenes de vida útil de fotoluminiscencia diseñado para mapear la concentración de oxígeno molecular (O2) en diferentes muestras fosforescentes que van desde recubrimientos de estado sólido sensibles al O2 hasta muestras de tejido animal vivo teñidas con sondas solubles sensibles al_O2. En particular, se utilizó la sonda de infrarrojo cercano basada en nanopartículas NanO2-IR, que es excitable con un diodo emisor de luz (LED) de 625 nm y emite a 760 nm. El sistema de imágenes se basa en la cámara Timepix3 (Tpx3Cam) y el adaptador optomecánico, que también alberga un intensificador de imagen. La microscopía de imágenes de por vida de fosforescencia (PLIM) de_O2 se requiere comúnmente para varios estudios, pero las plataformas actuales tienen limitaciones en su precisión, flexibilidad general y facilidad de uso.

El sistema presentado aquí es un generador de imágenes rápido y altamente sensible, que se basa en un sensor óptico integrado y un módulo de chip de lectura, Tpx3Cam. Se ha demostrado que produce señales de fosforescencia de alta intensidad y valores estables de vida útil a partir de muestras de tejido intestinal teñido superficialmente o fragmentos teñidos intraluminalmente del intestino grueso y permite el mapeo detallado de los niveles de_O2 tisular en aproximadamente 20 s o menos. También se presentan experimentos iniciales sobre la imagen de hipoxia en tumores injertados en animales inconscientes. También describimos cómo se puede reconfigurar el generador de imágenes para su uso con materiales sensibles al_O2 basados en colorantes de porfirina Pt utilizando un LED de 390 nm para la excitación y un filtro de paso de banda de 650 nm para la emisión. En general, se encontró que el generador de imágenes PLIM produce mediciones cuantitativas precisas de los valores de vida útil para las sondas utilizadas y los respectivos mapas bidimensionales de la concentración de_O2 . También es útil para la obtención de imágenes metabólicas de modelos de tejidos ex vivo y animales vivos.

Introducción

El O2 es uno de los parámetros ambientales clave para los sistemas vivos, y el conocimiento de la distribución del_O2 y su dinámica es importante para muchos estudios biológicos 1,2,3. La evaluación de la oxigenación tisular por medio de sondas fosforescentes 4,5,6,7,8 y PLIM 9,10,11,12,13 están ganando popularidad en la investigación biológica y médica 3,9,14,15,16^{, 17,18,19}. Esto se debe a que PLIM, a diferencia de las mediciones de intensidad de fluorescencia o fosforescencia, no se ve afectado por factores externos como la concentración de la sonda, el fotoblanqueo, la intensidad de excitación, la alineación óptica, la dispersión y la autofluorescencia.

Sin embargo, las plataformas actuales de O₂ PLIM están limitadas por su sensibilidad, velocidad de adquisición de imágenes, precisión y usabilidad general. El conteo de fotones únicos correlacionados en el tiempo (TCSPC), combinado con un procedimiento de escaneo ráster, se utiliza con frecuencia en dispositivos PLIM y microscopía de imágenes de fluorescencia (FLIM)^20,21,22. Sin embargo, dado que PLIM requiere un largo tiempo de permanencia en píxeles (en el rango de milisegundos), el tiempo de adquisición de imágenes es mucho más largo que el requerido para las aplicaciones FLIM^20,22,23. Otras técnicas, como las cámaras CCD/CMOS cerradas, carecen de sensibilidad de fotón único y tienen bajas velocidades de cuadro^20,24,25,26. Además, los sistemas PLIM existentes se utilizan principalmente en formato microscópico, mientras que los sistemas macroscópicos son menos comunes²⁷.

El generador de imágenes macro PLIM²⁸ basado en TCSPC se creó para superar muchas de estas limitaciones. El diseño del generador de imágenes se vio facilitado en gran medida por el uso de un nuevo adaptador optomecánico, Cricket, que tiene lo siguiente: i) dos adaptadores de montura C, que proporcionan un fácil acoplamiento del módulo de la cámara en la parte posterior y la lente del objetivo en la parte frontal; ii) una carcasa interna para un intensificador de imagen y una toma de corriente para este último en el lado exterior del Cricket; iii) un espacio interno detrás del adaptador frontal de montura C donde se puede alojar un filtro de emisión estándar de 25 mm delante del intensificador; y iv) una óptica de colisión de luz incorporada con reguladores de anillo, que permiten la alineación / enfoque óptico entre la lente y la cámara para producir imágenes nítidas en el chip de la cámara.

En el generador de imágenes ensamblado, el módulo de la cámara está acoplado a la parte posterior del adaptador Cricket, que también alberga un intensificador de imagen que consiste en un fotocátodo seguido de una placa de microcanal (MCP), un amplificador y un centelleador rápido, fósforo P47. Un filtro de emisión de 760 nm ± 50 nm está instalado dentro del Cricket, y una lente objetiva, NMV-50M11'', está conectada al adaptador frontal de montura C. Finalmente, la lente y la cámara están alineadas ópticamente con reguladores de anillo.

El papel del intensificador es detectar fotones entrantes y convertirlos en ráfagas rápidas de luz en el chip de la cámara, que se registran y utilizan para generar decaimientos de emisión e imágenes de por vida. El módulo de cámara comprende una matriz avanzada de sensores ópticos basados en TCSPC (256 píxeles x 256 píxeles) y un chip de lectura de nueva generación 29,30,31,32,33, que permiten el registro simultáneo de la hora de llegada (TOA) y el tiempo sobre umbral (TOT) de ráfagas de fotones en cada píxel del chip de imagen con una resolución de tiempo de ^1,6 ns y una velocidad de lectura de 80 Mpixel/s.

En esta configuración, la cámara con el intensificador tiene sensibilidad de fotón único. Está basado en datos y se basa en el sistema de lectura rápida del detector de píxeles (SPIDR)³⁴. La resolución espacial del generador de imágenes se caracterizó previamente con sensores fosforescentes planos de_O2 y una máscara de placa de resolución. La función de respuesta del instrumento (IRF) se midió mediante la obtención de imágenes de un sensor fluorescente plano bajo la misma configuración que se utilizó para todas las demás mediciones. La vida útil del tinte de alrededor de 2,6 ns fue lo suficientemente corta como para ser utilizado para la medición IRF en modo PLIM. El generador de imágenes puede obtener imágenes de objetos de hasta 18 mm x 18 mm de tamaño con resoluciones espaciales y temporales de 39,4 μm y 30,6 ns (ancho completo a la mitad como máximo), respectivamente²⁸.

Los siguientes protocolos describen el ensamblaje del macrogenerador de imágenes y su posterior uso para mapear la concentración de O2 en muestras biológicas teñidas con la sonda de O2 en el infrarrojo cercano previamente caracterizada,_NanO2-IR ³⁵. La sonda es una sonda de detección de_O2 brillante, fotoestable y permeable a las células basada en colorante benzoporfirina (PtBP) de platino (II). Es excitable a 625 nm, emite a 760 nm y proporciona una respuesta óptica robusta al O2 en el rango fisiológico (0%-21% o 0-210 μM de_O2). También se ha demostrado que el generador de imágenes caracteriza diferentes materiales de sensores basados en colorantes de porfirina Pt (II). En general, el generador de imágenes es compacto y flexible, similar a una cámara fotográfica común. En la configuración actual, el generador de imágenes es apropiado para diferentes aplicaciones PLIM de campo amplio. La sustitución del LED con una fuente láser rápida mejorará aún más el rendimiento del generador de imágenes y podría permitir aplicaciones FLIM de nanosegundos.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales se realizaron bajo autorizaciones emitidas por la Autoridad Reguladora de Productos Sanitarios (HPRA, Irlanda) de acuerdo con la Directiva del Consejo de las Comunidades Europeas (2010/63/UE) y fueron aprobados por el Comité de Ética de Experimentación Animal del University College Cork.

1. Preparación de la muestra

1. Tinción con la sonda de muestras de tejido vivo ex vivo
   1. Para aplicaciones ex vivo , utilice muestras de tejido recién aisladas de ratones Balb/c hembra de 4 semanas de edad.
   2. El día del experimento, eutanasia a un ratón por decapitación y disecciona rápidamente fragmentos del colon (intestino grueso), de aproximadamente 10 mm de tamaño. Lavarlos inmediatamente con tampón PBS, colocar en medio DMEM suplementado con tampón Hepes de 10 mM (pH 7,2) e incubar a 37 °C³⁶.
   3. Para la tinción superficial del lado serosal del intestino, transfiera las muestras de tejido vivo a una miniplaca, aplique 2 ml de DMEM completo que contenga 1 mg/ml de sonda NanO2-IR para cubrir las muestras de tejido e incube durante 30 min a 37 °C.
      NOTA: Las células en el tejido post-mortem permanecen vivas durante muchas horas en cultivo. NaNO2-IR muestra citotoxicidad menor, por lo que todos los experimentos se completaron dentro de las 4 h posteriores al aislamiento del tejido.
   4. Para la tinción intraluminal de tejido profundo ex vivo , transfiera las piezas del intestino a una placa de Petri seca y elimine cualquier exceso de DMEM con papel de filtro.
   5. Inyecte 1 μL de DMEM que contenga 1 mg/ml de NanO2-IR 35 en el lumen con una jeringa de Hamilton e incube las muestras durante¹⁵ minutos o hasta 4 h.
      NOTA: NaNO2-IR muestra efectos citotóxicos menores a largo plazo; Por lo tanto, todos los experimentos deben completarse dentro de las 4 h posteriores al aislamiento del tejido.
2. Preparación de tejido tumoral teñido en animales vivos
   1. Para aplicaciones in vivo , pre-tiñir las células CT26 durante 18 h en un medio libre de suero que contiene la sonda NaNO2-IR a 0,05 mg/ml.
   2. Tomar un ratón, afeitar el área de inyección en el flanco derecho e inyectar con una jeringa 200 μL de una mezcla de 1 × 10 5 células no teñidas y 1 × 10⁵ células preteñidas con NanO2-IR .
   3. Permitir que los tumores crezcan en los ratones, monitoreando el tamaño del tumor con un calibrador y el peso del animal periódicamente³⁷. Los animales con tumores injertados se preparan para obtener imágenes en el séptimo día de crecimiento del tumor.
      NOTA: El volumen tumoral se calculó mediante la ecuación (1):
      V = (L × W 2)/² (1)
      donde L es el diámetro del tumor, y W is el diámetro perpendicular al diámetro L.
   4. Sacrificar a los animales por dislocación cervical justo antes de la imagen.

2. Configuración de imágenes PLIM

1. Tome el adaptador Cricket y retire su adaptador de montura C de la parte posterior para acceder a la carcasa del intensificador en el interior. Inserte el intensificador de imagen MCP-125 en este compartimento y vuelva a colocar el adaptador de montura C.
2. Retire el adaptador de montura C frontal del Cricket, inserte el filtro de emisión de 760 nm ± 50 nm y fíjelo volviendo a colocar la montura C.
3. Conecte el módulo de cámara Tpx3Cam a la parte posterior del módulo Cricket a través de su adaptador de montura C
4. Conecte la lente a la parte frontal del módulo Cricket a través de su adaptador de montura C.
5. Monte todo el conjunto de la cámara en la parte superior de la caja negra óptica, mirando hacia abajo hasta el escenario en el que se tomarán las imágenes (Figura 1).
6. Monte el LED súper brillante de 624 nm en un poste conectado a una placa de pruebas dentro de la caja negra.
7. Conecte el LED a una fuente de alimentación y a un generador de pulsos. Encienda el LED y enfóquelo para garantizar una excitación efectiva y uniforme de las muestras de imagen.
8. Conecte la cámara a otro generador de pulsos y sincronice los pulsos enviados a la cámara y al LED³⁸.
9. Usando el cable especial y el enchufe de la unidad Cricket, conecte el intensificador a una fuente de alimentación estándar y ajuste la ganancia a 2.7 V.
10. Utilizando las capacidades de enfoque de la lente y el adaptador Cricket, enfoque la óptica de la cámara en la etapa de muestra para generar imágenes claras de muestras con buen contraste y brillo.
11. Para el uso de imágenes con colorantes de Pt-porfirina, reemplace el LED de 625 nm con un LED de 390 nm para excitación y reemplace el filtro de 760 nm ± 50 nm con un filtro de 650 nm ± 50 nm en el módulo Cricket.

3. Adquisición de imágenes

1. Coloque la muestra delante de la lente de la cámara.
   NOTA: Utilice una etapa ajustable x-y-z como soporte de muestra para ajustar la posición de la muestra para un buen enfoque.
2. Apague todas las luces de la habitación.
3. Encienda el software Sophy para ajustar los parámetros operativos, como el enfoque y la alineación de muestras.
   NOTA: El software Sophy se proporciona junto con la cámara para configurar los parámetros de imagen y registrar los datos. Asegúrese de que el software esté conectado a la cámara comprobando el código de la cámara. Sin embargo, utilizamos un programa diferente para la adquisición de datos.
4. En Módulos, seleccione fotogramas infinitos y establezca el modo de operación de píxeles en tiempo por encima del umbral.
5. En Módulos, vaya a Vista previa y seleccione Módulo activo. Esto abre la ventana Medpix/Timpix Frames .
6. En esta ventana, cambie la escala de color y gire la imagen a la orientación deseada.
7. Encienda el intensificador e inicie la grabación.
   NOTA: Utilice la pantalla de grabación del software Sophy para confirmar visualmente la alineación y el enfoque de la muestra y para optimizar los parámetros de excitación LED para la grabación.
8. Detenga la grabación y cierre el software Sophy.
9. Vaya a la terminal y use el software diseñado a medida para adquirir los datos sin procesar en formato binario y postprocesarlos (https://github.com/svihra/TimePix3).
   1. En el terminal, ejecute los siguientes comandos para registrar los datos:
      Documento CD/SPIDR/trunk/Release/
       ls
      ./Tpx3daq - i 1 - b 50 - m - s {Nombre del archivo} - t {tiempo de adquisición}
      NOTA: Al escribir "ls", compruebe la lista de archivos en el directorio actual; confirme que se ve Tpx3daq.
   2. Espere hasta que se graben todos los fotogramas.
   3. Para procesar los datos, ejecute los siguientes comandos en el terminal:
      cd Documents/DataProcessing/Timepix3/Timepix3/
      raíz
      . L dataprocess.cpp++
      .x DRGUI. C
   4. Espere a que se abra una ventana RRGui . Seleccione todas las variables a la izquierda y Todos los datos, Archivo único y Centroide a la derecha.
   5. Seleccione el archivo para procesar y ejecute el reductor de datos.
      NOTA: Todos los archivos procesados aparecerán en la misma carpeta que el archivo sin procesar.

4. Análisis de datos

1. Analice los datos postprocesados con un programa dedicado escrito en lenguaje C que escribirá los datos en un archivo de imagen .ics (https://github.com/lmhirvonen/timepix3cam).
2. Abra los archivos de imagen .ics utilizando el software Time Resolved Imaging disponible gratuitamente (consulte Tabla de materiales). Utilice dos funciones exponenciales para adaptarse a las desintegraciones de la fosforescencia.
3. Abra los archivos de imagen .ics ajustados con el software de análisis de imágenes disponible (consulte la Tabla de materiales).
4. Usando tablas de búsqueda, genere imágenes de vida útil de fosforescencia y codifique en escala de pseudocolor (por ejemplo, color azul para vidas cortas y rojo para vidas largas). Utilice la función Medir para calcular los valores medios de vida útil de toda la imagen o de regiones de interés (ROI) específicas.
5. Convertir los valores de vida útil en la concentración de oxígeno utilizando la ecuación obtenida de la instalación de la calibración de_O2 de la sonda³⁶.
   NOTA: La ecuación (2) se utilizó para este trabajo:
   O 2 [μM] = −86,16 + 770,35 × e^{−0,049 × LT} (2)

Resultados

Para aplicaciones de imágenes ex vivo , se tiñeron fragmentos de tejidos intestinales mediante la aplicación tópica de la sonda NanO2-IR en el lado serosal del tejido. Para una tinción más profunda, se inyectó 1 μL de la sonda en el lumen. En este último caso, la pared intestinal de 0,2-0,25 mm de espesor protegía la sonda de la cámara. Los dos procesos de tinción se muestran en la Figura 2A.

La intensidad resultante y las imágenes PLIM se pr...

Discusión

Los protocolos anteriores ofrecen una descripción detallada del montaje del nuevo generador de imágenes y su funcionamiento en el modo FLIM/PLIM de microsegundos. La cámara Tpx3Cam de nueva generación basada en TCSPC, acoplada por medio del adaptador optomecánico Cricket con el intensificador de imagen, el filtro de emisión y la lente macro, produce un módulo óptico estable, compacto y flexible que es fácil de operar. Se demostró que el generador de imágenes funciona bien con una variedad de muestras diferente...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
627 nm LED	Parts Express		Can be replaced with different LED based on the excitation wavelength of the sensor. Used 390 nm LED for Pt-porphyrin dyes.
760 ± 50 nm emission filter	Edmund Optics	84-788	Can be replaced with different filter based on the emission wavelength of the sensor. Used 650 ± 50 nm bandpass filter for Pt-porphyrin dyes.
Balb/c mice	Envigo, UK	Balb/c
Black box	Thorlabs	XE25C9/M
Cricket Adapter	Photonis	Cricket-2
CT26 cells	ATCC	CT26.WT	https://www.atcc.org/products/crl-2638
DMEM	Sigma-Aldrich	D0697	Other media can also be used
ImageJ Software	ImageJ		Free Image analysis software. Can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/index.html
MCP-125 image intensifier with P47 phosphor screen	Photonis	PP0360EF
Mini dishes	Sarstedt	83.3900.300	35 mm diameter
Mylar plastic film, 75 micron	RS Ireland	785-0795	Othe plastic substrates can also be used
NanO2-IR	home-made	n/a	The probe can be synthesised according to the published method 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. J Neurosci Methods. 2013 Jun 15;216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.' or provided by our lab.
NMV-50M11” 50 mm lens	Navitar		Other lenses compatibel with C-mount adators can be used
Optical breadboard	Thorlabs	MB1836
Petri Dishes	Sarstedt	82.1472.001	92 mm diameter
Power Supply	Tenma	72-10495
Pulse Generator	Tenma	TGP110
Sophy	Amsterdam Scientific Instruments	n/z	Provided by ASI together with the Tpx3Cam
Tpx3Cam	Amsterdam Scientific Instruments	TPXCAM
Tri2 Software	University of Oxford	n/a	Free Time Resolved Imaging software, can be downloaded from: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml
XYZ Translation Stage	Thorlabs	LT3