Imager macro a fluorescenza per applicazioni biomediche

Riepilogo

Questo articolo descrive l'uso di un nuovo imager ottico veloce per l'imaging macroscopico della durata della fotoluminescenza di campioni che emettono lungo decadimento. Vengono descritte le procedure di integrazione, acquisizione delle immagini e analisi, insieme alla preparazione e caratterizzazione dei materiali del sensore per l'imaging e l'applicazione dell'imager nello studio dei campioni biologici.

Abstract

Questo articolo presenta un nuovo imager di durata della fotoluminescenza progettato per mappare la concentrazione di ossigeno molecolare (O 2) in diversi campioni fosforescenti che vanno dai rivestimenti sensibili allo stato solido, O 2 a campioni di tessuto animale vivo colorati con sonde solubili sensibili all'O₂. In particolare, è stata utilizzata la sonda nel vicino infrarosso basata su nanoparticelle NanO2-IR, che è eccitabile con un diodo a emissione luminosa (LED) da 625 nm ed emette a 760 nm. Il sistema di imaging si basa sulla telecamera Timepix3 (Tpx3Cam) e sull'adattatore opto-meccanico, che ospita anche un intensificatore di immagine. La microscopia a vita di imaging con fosforescenza (PLIM) O₂ è comunemente richiesta per vari studi, ma le piattaforme attuali hanno limitazioni nella loro accuratezza, flessibilità generale e usabilità.

Il sistema qui presentato è un imager veloce e altamente sensibile, costruito su un sensore ottico integrato e un modulo chip di lettura, Tpx3Cam. È dimostrato che produce segnali di fosforescenza ad alta intensità e valori stabili nel corso della vita da campioni di tessuto intestinale macchiati in superficie o frammenti di intestino crasso colorati per via intraluminale e consente la mappatura dettagliata dei livelli di O₂ del tessuto in circa 20 s o meno. Vengono inoltre presentati esperimenti iniziali sull'imaging dell'ipossia nei tumori innestati in animali incoscienti. Descriviamo anche come l'imager può essere riconfigurato per l'uso con materiali sensibili all'O₂ basati su coloranti Pt-porfirina utilizzando un LED da 390 nm per l'eccitazione e un filtro passa banda 650 nm per l'emissione. Nel complesso, l'imager PLIM è risultato in grado di produrre misurazioni quantitative accurate dei valori di vita per le sonde utilizzate e le rispettive mappe bidimensionali della concentrazione di O₂ . È anche utile per l'imaging metabolico di modelli di tessuto ex vivo e animali vivi.

Introduzione

O 2 è uno dei parametri ambientali chiave per i sistemi viventi e la conoscenza della distribuzione di O 2 e della sua dinamica è importante per molti studi biologici _1,2,3. La valutazione dell'ossigenazione tissutale mediante sonde fosforescenti 4,5,6,7,8 e PLIM 9,10,11,12,13 sta guadagnando popolarità nella ricerca biologica e medica 3,9,14,15,16^{, 17,18,19}. Questo perché il PLIM, a differenza delle misurazioni dell'intensità di fluorescenza o fosforescenza, non è influenzato da fattori esterni come la concentrazione della sonda, il fotosbiancamento, l'intensità di eccitazione, l'allineamento ottico, la diffusione e l'autofluorescenza.

Tuttavia, le attuali piattaforme PLIM O₂ sono limitate dalla loro sensibilità, velocità di acquisizione delle immagini, precisione e usabilità generale. Il conteggio a singolo fotone correlato al tempo (TCSPC), combinato con una procedura di scansione raster, viene spesso utilizzato nei dispositivi PLIM e FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy)^20,21,22. Tuttavia, poiché PLIM richiede un lungo tempo di permanenza dei pixel (nell'intervallo dei millisecondi), il tempo di acquisizione dell'immagine è molto più lungo di quello richiesto per le applicazioni FLIM^20,22,23. Altre tecniche, come le telecamere CCD / CMOS gated, mancano di sensibilità a singolo fotone e hanno frame rate bassi^20,24,25,26. Inoltre, i sistemi PLIM esistenti sono per lo più utilizzati nel formato microscopico, mentre i sistemi macroscopici sono meno comuni²⁷.

Il sequencer macro imager²⁸ basato su TCSPC è stato configurato per superare molte di queste limitazioni. Il design dell'imager è stato notevolmente facilitato dall'uso di un nuovo adattatore opto-meccanico, Cricket, che ha quanto segue: i) due adattatori C-mount, che forniscono un facile accoppiamento del modulo fotocamera sul lato posteriore e dell'obiettivo sul lato anteriore; ii) un alloggiamento interno per un intensificatore di immagine e una presa di corrente per quest'ultimo sul lato esterno del Cricket; iii) uno spazio interno dietro l'adattatore frontale con montaggio a C in cui un filtro di emissione standard da 25 mm può essere alloggiato davanti all'intensificatore; e iv) un'ottica di collimazione della luce incorporata con regolatori ad anello, che consentono l'allineamento / messa a fuoco ottica tra l'obiettivo e la fotocamera per produrre immagini nitide sul chip della fotocamera.

Nell'imager assemblato, il modulo della fotocamera è accoppiato al lato posteriore dell'adattatore Cricket, che ospita anche un intensificatore di immagine costituito da un fotocatodo seguito da una piastra a microcanali (MCP), un amplificatore e uno scintillatore veloce, il fosforo P47. Un filtro di emissione da 760 nm ± 50 nm è montato all'interno del Cricket e un obiettivo, NMV-50M11'', è collegato all'adattatore C-mount frontale. Infine, l'obiettivo e la fotocamera sono allineati otticamente con i regolatori ad anello.

Il ruolo dell'intensificatore è quello di rilevare i fotoni in arrivo e convertirli in rapide esplosioni di luce sul chip della fotocamera, che vengono registrati e utilizzati per generare decadimenti di emissione e immagini a vita. Il modulo telecamera comprende un avanzato array di sensori ottici basati su TCSPC (256 pixel x 256 pixel) e un chip di lettura di nuova generazione 29,30,31,32,33, che consentono la registrazione simultanea del tempo di arrivo (TOA) e del tempo oltre la soglia (TOT) dei burst di fotoni su ciascun pixel del chip di imaging con una risoluzione temporale di ^1,6 ns e una velocità di lettura di 80 Mpixel/s.

In questa configurazione, la telecamera con l'intensificatore ha una sensibilità a fotone singolo. È basato sui dati e si basa sul sistema di lettura del rilevatore di pixel veloci (SPIDR)³⁴. La risoluzione spaziale dell'imager era precedentemente caratterizzata da sensori O₂ fosforescenti planari e una maschera a piastre di risoluzione. La funzione di risposta dello strumento (IRF) è stata misurata mediante l'imaging di un sensore fluorescente planare con le stesse impostazioni utilizzate per tutte le altre misurazioni. La durata del colorante di circa 2,6 ns è stata abbastanza breve da poter essere utilizzata per la misurazione IRF in modalità PLIM. L'imager può visualizzare oggetti di dimensioni fino a 18 mm x 18 mm con risoluzioni spaziali e temporali di 39,4 μm e 30,6 ns (larghezza completa a metà massima), rispettivamente²⁸.

I seguenti protocolli descrivono l'assemblaggio del macro imager e il suo successivo utilizzo per mappare la concentrazione di O 2 in campioni biologici colorati con la sonda O₂ nel vicino infrarosso precedentemente caratterizzata, NanO2-IR³⁵. La sonda è una sonda O₂ luminosa, fotostabile, permeabile alle cellule basata sul colorante benzoporfirina di platino (II) (PtBP). È eccitabile a 625 nm, emette a 760 nm e fornisce una robusta risposta ottica a O 2 nell'intervallo fisiologico (0% -21% o 0-210 μM di O₂). È stato inoltre dimostrato che l'imager caratterizza diversi materiali del sensore basati su coloranti Pt(II)-porfirina. Nel complesso, l'imager è compatto e flessibile, simile a una comune fotocamera fotografica. Nella configurazione corrente, l'imager è adatto per diverse applicazioni PLIM a campo ampio. La sostituzione del LED con una sorgente laser veloce migliorerà ulteriormente le prestazioni dell'imager e potrebbe potenzialmente consentire applicazioni FLIM in nanosecondi.

Protocollo

Tutte le procedure con gli animali sono state eseguite sotto autorizzazioni rilasciate dalla Health Products Regulatory Authority (HPRA, Irlanda) in conformità con la Direttiva del Consiglio delle Comunità Europee (2010/63 / UE) e sono state approvate dal Comitato Etico per la sperimentazione animale dell'University College Cork.

1. Preparazione del campione

1. Colorazione con sonda di campioni di tessuto vivo ex vivo
   1. Per le applicazioni ex vivo , utilizzare campioni di tessuto appena isolati da topi Balb/c femmina di 4 settimane.
   2. Il giorno dell'esperimento, eutanasia di un topo per decapitazione e sezionare rapidamente frammenti del colon (intestino crasso), di circa 10 mm di dimensione. Lavarli immediatamente con tampone PBS, metterli in mezzo DMEM integrato con tampone Hepes 10 mM (pH 7,2) e incubare a 37 °C³⁶.
   3. Per la colorazione superficiale del lato sieroso dell'intestino, trasferire i campioni di tessuto vivo in un mini-piatto, applicare 2 ml di DMEM completo contenente 1 mg/mL di sonda NanO2-IR per coprire i campioni di tessuto e incubare per 30 minuti a 37 °C.
      NOTA: Le cellule nel tessuto post-mortem rimangono vive per molte ore in coltura. NaNO2-IR mostra una citotossicità minore, quindi tutti gli esperimenti sono stati completati entro 4 ore dall'isolamento tissutale.
   4. Per la colorazione intraluminale ex vivo dei tessuti profondi, trasferire i pezzi dell'intestino in una capsula di Petri asciutta e rimuovere qualsiasi DMEM in eccesso con carta da filtro.
   5. Iniettare 1 μL di DMEM contenente 1 mg/mL di NanO2-IR 35 nel lume con una siringa di Hamilton e incubare i campioni per¹⁵ minuti o fino a 4 ore.
      NOTA: NaNO2-IR mostra effetti citotossici minori a lungo termine; Pertanto, tutti gli esperimenti dovrebbero essere completati entro 4 ore dall'isolamento tissutale.
2. Preparazione di tessuto tumorale colorato in animali vivi
   1. Per applicazioni in vivo, pre-colorare le cellule CT26 per 18 ore in mezzo privo di siero contenente sonda NaNO2-IR a 0,05 mg/ml.
   2. Prenda un topo, rada l'area di iniezione nel fianco destro e inietti con una siringa 200 μL di una miscela di 1 × 10 5 cellule non colorate e 1 × 10⁵ cellule pre-colorate con NanO2-IR .
   3. Consentire ai tumori di crescere nei topi, monitorando periodicamente le dimensioni del tumore con una pinza e il peso dell'animale periodicamente³⁷. Gli animali con tumori innestati diventano pronti per l'imaging il settimo giorno di crescita del tumore.
      NOTA: Il volume del tumore è stato calcolato utilizzando l'equazione (1):
      V = (L × W 2)/² (1)
      dove L è il diametro del tumore e W èil diametro perpendicolare al diametro L.
   4. Sacrificare gli animali per dislocazione cervicale poco prima dell'imaging.

2. Configurazione dell'imaging PLIM

1. Prendi l'adattatore Cricket e rimuovi l'adattatore C-mount sul retro per accedere all'alloggiamento dell'intensificatore all'interno. Inserire l'intensificatore d'immagine MCP-125 in questo scomparto e riposizionare l'adattatore C-mount.
2. Rimuovere l'adattatore C-mount frontale del Cricket, inserire il filtro di emissione da 760 nm ± 50 nm e ripararlo rimettendo il C-mount.
3. Collegare il modulo fotocamera Tpx3Cam al lato posteriore del modulo Cricket tramite il suo adattatore C-mount
4. Collegare l'obiettivo al lato anteriore del modulo Cricket tramite il suo adattatore C-mount.
5. Montare l'intero gruppo telecamera sulla parte superiore della scatola nera ottica, rivolta verso il basso verso il basso verso il palco su cui verranno ripresi i campioni (Figura 1).
6. Montare il LED super-luminoso da 624 nm su un palo collegato a una breadboard all'interno della scatola nera.
7. Collegare il LED a un alimentatore e a un generatore di impulsi. Accendere il LED e metterlo a fuoco per garantire un'eccitazione efficace e uniforme dei campioni visualizzati.
8. Collegare la telecamera a un altro generatore di impulsi e sincronizzare gli impulsi inviati alla fotocamera e al LED³⁸.
9. Utilizzando il cavo speciale e la presa sull'unità Cricket, collegare l'intensificatore a un alimentatore standard e impostare il guadagno su 2,7 V.
10. Utilizzando le funzionalità di messa a fuoco dell'obiettivo e dell'adattatore Cricket, mettere a fuoco l'ottica della fotocamera sul palco campione per generare immagini nitide dei campioni con buon contrasto e luminosità.
11. Per l'utilizzo dell'imager con coloranti Pt-porfirina, sostituire il LED da 625 nm con un LED da 390 nm per l'eccitazione e sostituire il filtro da 760 nm ± 50 nm con un filtro da 650 nm ± 50 nm nel modulo Cricket.

3. Acquisizione di immagini

1. Posizionare il campione davanti all'obiettivo della fotocamera.
   NOTA: utilizzare uno stadio regolabile x-y-z come supporto del campione per regolare la posizione del campione per una buona messa a fuoco.
2. Spegni tutte le luci nella stanza.
3. Accendere il software Sophy per la messa a punto dei parametri operativi, come la messa a fuoco e l'allineamento del campione.
   NOTA: il software Sophy viene fornito insieme alla fotocamera per impostare i parametri di imaging e registrare i dati. Assicurarsi che il software sia collegato alla fotocamera controllando il codice della fotocamera. Tuttavia, abbiamo utilizzato un programma diverso per l'acquisizione dei dati.
4. In Moduli, selezionate fotogrammi infiniti e impostate la modalità operativa pixel su soglia di tempo.
5. In Moduli, vai a Anteprima e seleziona Modulo attivo. Verrà visualizzata la finestra Medpix/Timpix Frames .
6. In questa finestra, modificare la scala dei colori e ruotare l'immagine con l'orientamento desiderato.
7. Accendere l'intensificatore e avviare la registrazione.
   NOTA: Utilizzare la schermata di registrazione del software Sophy per confermare visivamente l'allineamento e la messa a fuoco del campione e per ottimizzare i parametri di eccitazione LED per la registrazione.
8. Interrompere la registrazione e chiudere il software Sophy.
9. Vai al terminale e utilizza il software progettato su misura per acquisire i dati grezzi in formato binario e post-elaborarli (https://github.com/svihra/TimePix3).
   1. Nel terminale, eseguire i seguenti comandi per registrare i dati:
      Cd Document/SPIDR/trunk/Release/
       Ls
      ./Tpx3daq - i 1 - b 50 - m - s {Nome del file} - t {tempo di acquisizione}
      NOTA: dopo aver digitato "ls", controllare l'elenco dei file nella directory corrente; confermare che Tpx3daq è visto.
   2. Attendere che tutti i fotogrammi vengano registrati.
   3. Per elaborare i dati, eseguire i seguenti comandi nel terminale:
      cd Documents/DataProcessing/Timepix3/Timepix3/
      radice
      . L dataprocess.cpp++
      .x DRGUI. C
   4. Attendere l'apertura di una finestra RRGui . Selezionare tutte le variabili a sinistra e Tutti i dati, File singolo e Centroid a destra.
   5. Selezionare il file da elaborare ed eseguire il riduttore di dati.
      NOTA: tutti i file elaborati verranno visualizzati nella stessa cartella del file raw.

4. Analisi dei dati

1. Analizza i dati post-elaborati con un programma dedicato scritto in linguaggio C che scriverà i dati in un file immagine .ics (https://github.com/lmhirvonen/timepix3cam).
2. Aprire i file di immagine .ics utilizzando il software Time Resolved Imaging disponibile gratuitamente (vedere Tabella dei materiali). Utilizzare due funzioni esponenziali per adattarsi ai decadimenti della fosforescenza.
3. Aprire i file di immagine .ics dotati con il software di analisi delle immagini disponibile (vedere Tabella dei materiali).
4. Utilizzando le tabelle di ricerca, generare immagini di durata della fosforescenza e codificarle in scala pseudocolore (ad esempio, colore blu per brevi vite e rosso per lunghe vite). Utilizzare la funzione Misura per calcolare i valori medi di durata per l'intera immagine o specifiche regioni di interesse (ROI).
5. Convertire i valori di vita nella concentrazione di ossigeno utilizzando l'equazione ottenuta dal montaggio della calibrazione O₂ della sonda³⁶.
   NOTA: L'equazione (2) è stata utilizzata per questo lavoro:
   O 2 [μM] = −86,16 + 770,35 × e^{−0,049 × LT} (2)

Risultati

Per le applicazioni di imaging ex vivo , frammenti di tessuti intestinali sono stati colorati dall'applicazione topica della sonda NanO2-IR sul lato sieroso del tessuto. Per una colorazione più profonda, 1 μL della sonda è stato iniettato nel lume. In quest'ultimo caso, la parete intestinale spessa 0,2-0,25 mm ha schermato la sonda dalla fotocamera. I due processi di colorazione sono illustrati nella Figura 2A.

L'intensità risultante e le immagini PLI...

Discussione

I protocolli di cui sopra forniscono una descrizione dettagliata dell'assemblaggio del nuovo imager e del suo funzionamento in modalità FLIM/PLIM al microsecondo. La telecamera Tpx3Cam di nuova generazione basata su TCSPC, accoppiata mediante l'adattatore optomeccanico Cricket con l'intensificatore di immagine, il filtro di emissione e il macroobiettivo, produce un modulo ottico stabile, compatto e flessibile facile da usare. L'imager ha dimostrato di funzionare bene con una serie di diversi campioni e compiti analitici...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
627 nm LED	Parts Express		Can be replaced with different LED based on the excitation wavelength of the sensor. Used 390 nm LED for Pt-porphyrin dyes.
760 ± 50 nm emission filter	Edmund Optics	84-788	Can be replaced with different filter based on the emission wavelength of the sensor. Used 650 ± 50 nm bandpass filter for Pt-porphyrin dyes.
Balb/c mice	Envigo, UK	Balb/c
Black box	Thorlabs	XE25C9/M
Cricket Adapter	Photonis	Cricket-2
CT26 cells	ATCC	CT26.WT	https://www.atcc.org/products/crl-2638
DMEM	Sigma-Aldrich	D0697	Other media can also be used
ImageJ Software	ImageJ		Free Image analysis software. Can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/index.html
MCP-125 image intensifier with P47 phosphor screen	Photonis	PP0360EF
Mini dishes	Sarstedt	83.3900.300	35 mm diameter
Mylar plastic film, 75 micron	RS Ireland	785-0795	Othe plastic substrates can also be used
NanO2-IR	home-made	n/a	The probe can be synthesised according to the published method 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. J Neurosci Methods. 2013 Jun 15;216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.' or provided by our lab.
NMV-50M11” 50 mm lens	Navitar		Other lenses compatibel with C-mount adators can be used
Optical breadboard	Thorlabs	MB1836
Petri Dishes	Sarstedt	82.1472.001	92 mm diameter
Power Supply	Tenma	72-10495
Pulse Generator	Tenma	TGP110
Sophy	Amsterdam Scientific Instruments	n/z	Provided by ASI together with the Tpx3Cam
Tpx3Cam	Amsterdam Scientific Instruments	TPXCAM
Tri2 Software	University of Oxford	n/a	Free Time Resolved Imaging software, can be downloaded from: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml
XYZ Translation Stage	Thorlabs	LT3